Desenvolvimento, expansão e<em> In vivo</em> Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)
Summary
Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.
Abstract
Nós apresentamos um método para derivar células natural killer (NK) de hESCs indiferenciadas e iPSCs usando uma abordagem alimentador-free. Este método dá origem a elevados níveis de células NK após 4 semanas de cultura e podem ser submetidos a uma maior expansão 2-log, com as células que apresentam antigénios artificiais. hES e iPSC derivado de células NK desenvolvidos neste sistema tem um fenótipo maduro e função. A produção de grandes números de células NK modificáveis geneticamente é aplicável tanto mecânica básica, bem como os estudos anti-tumorais. A expressão de luciferase do pirilampo nas células NK, células estaminais embrionárias humanas derivadas permite uma abordagem não invasiva para seguir o enxerto de células NK, a distribuição e a função. Nós também descrevem um esquema dual-imagem que permite o monitoramento separado de duas populações celulares diferentes para caracterizar mais claramente suas interações in vivo. Este método de derivação, a expansão, e dual in vivo de imagens proporciona uma abordagem fiável para a produção de células NK e sua avação que é necessário para melhorar as terapias adotivos células NK atuais.
Introduction
As células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), são células indiferenciadas pluripotentes, capazes de auto-renovação e multi-linhagem diferenciação ilimitado. hESCs ter sido diferenciados com sucesso em subconjuntos maduras e funcionais de cada camada germinal, incluindo as células do sistema hematopoiético, 1-3. Células assassinas naturais (NK) são linfócitos do sistema imune inato que pode ser derivada a partir de hESCs por formação de corpos embrióides (EB) a 4,5 ou de co-cultura com as linhas de células estromais 1,2,6-8. As células NK possuem capacidades anti-virais e anti-tumoral e têm o potencial para ser eficaz contra uma vasta gama de doenças malignas, como eles não necessitam de estimulação do antigénio antes de exercer as suas funções efectoras. Assim, as células NK, células estaminais embrionárias humanas derivadas são uma fonte de células atractivo para imunoterapia. Além disso, a derivação de células NK, a partir de hESCs proporciona um sistema geneticamente susceptíveis a estudar o desenvolvimento normal <em> in vitro.
Porque eles fornecem um sistema tratável geneticamente, as células NK, células estaminais embrionárias humanas derivada experimentalmente pode ser modificado para expressar repórteres fluorescentes e bioluminescentes proporcionar um modelo ideal para estudar as funções efectoras de células NK in vitro e in vivo. As células NK derivadas de células estaminais embrionárias humanas possuem actividade contra uma gama de objectivos, incluindo HIV 9, leucemia (K562) e outros tipos de cancro 7,8. No entanto, a capacidade de extrair de forma eficiente as células NK suficientes capazes de tratar pacientes continua a ser um importante obstáculo clínico para a tradução e é, em menor grau, uma grande limitação para a pré-clínicos realizados in vivo do desenvolvimento de células NK e das funções anti-cancro. Aqui, usamos uma abordagem EB rotação para derivar células progenitoras hematopoéticas de hESCs 4,5,10. Após 11 dias o spin EB são transferidas para cultura de células NK, com ou sem alimentadores para 28 dias. Depois de 4 semanas, em meio de cultura de células NK, células NK são transferred a co-cultura com células K562 modificados para expressar ligado à membrana a interleucina 21 (IL-21), que servem como células apresentadoras de antígenos (AAPCS artificiais). Adaptação de um protocolo para a expansão de células NK do sangue periférico, utilizando estes artificial APCs 11,12, somos capazes de expandir as células NK 2-logs, mantendo um fenótipo maduro e capacidades citotóxicos.
Este processo de desenvolvimento e de expansão proporciona células NK, células estaminais embrionárias humanas derivada suficientes para extensa caracterização in vivo. Para estudos in vivo, somos capazes de monitorar de forma não invasiva enxerto a longo prazo e da cinética de injeção luciferase firefly expressando (Fluc +), células NK, células estaminais embrionárias humanas derivadas usando imagem de bioluminescência. Além disso, somos capazes de acompanhar as interações de células NK com as células tumorais usando um esquema de imagem dupla, bioluminescente ou fluorescente. Um estudo anterior do nosso grupo usou imagem de bioluminescência em um modelo anti-tumor para acompanhar a progressão do tumor e clearance de Fluc + células K562 in vivo 7. Agora, pela engenharia nossas hESCs para expressar firefly luciferase 13,14 podemos seguir a biodistribuição e tráfico de células NK para K562 células tumorais que expressam a proteína fluorescente recentemente caracterizada, turboFP650 15. Nós escolhemos este sistema repórter duplo, a fim de seguir simultaneamente as duas populações de células in vivo (Figura 1). A maioria dos modelos duais de imagem têm sido os sistemas dual-luciferase, mas estes sistemas podem ser tecnicamente difícil devido às exigências de entrega de celenterazina, o substrato necessário para a expressão da maioria Renilla e Gaussia repórteres luciferase 16-18. Repórteres fluorescentes têm permitido fácil monitorização de muitas linhas de células e as construções in vitro, mas tem tido um sucesso limitado para imagem in vivo, devido à sobreposição entre o tecido e pele autofluorescência e os espectros de emissão de co muitosmmonly usado repórteres fluorescentes incluindo GFP, DsRed e tdTomato 15,19. Esta preocupação tem incentivado o desenvolvimento de proteínas fluorescentes vermelho-distante, o que permite melhor penetração do tecido e sinal específico maior em relação ao fundo 15,19. TurboFP650, a proteína fluorescente mostrado neste sistema, é deslocou-vermelho distante e supera muitos dos problemas envolvidos com a imagem proteínas fluorescentes em animais vivos.
Este método para desenvolver e expandir as células NK derivadas de hESCs nos permitiu caracterizar células hESC derivado NK in vitro e in vivo, o que é necessário para entender melhor a função das células NK e clinicamente importante para melhorar as terapias adotivos células NK atuais. Também é favorável à derivação e expansão das células NK iPSC derivados. O esquema de imagens fluorescentes e bioluminescentes dupla é amplamente aplicável a outros que o modelo anti-tumor temos mostrado aqui sistemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs são uma plataforma ideal para estudar diferentes tipos de células e têm um potencial notável para a tradução clínica. Nós usamos um, rotação abordagem EB definido para diferenciar hESC / iPSCs de células progenitoras hematopoéticas. A abordagem EB rotação rendeu derivação consistente de células progenitoras hematopoiéticas e diferenciação para células NK, ainda, ainda existe variação na eficiência de diferenciação através de linhas de células e podem ter de ser modificado para a produç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Melinda Hexum para início do protocolo EB rotação dentro do nosso laboratório. Gostaríamos de agradecer aos outros membros do laboratório, incluindo Laura E. Bendzick, Michael Lepley e Zhenya Ni para a sua assistência técnica com este trabalho. Os autores também gostariam de agradecer Brad Taylor em Caliper Life Sciences para sua assessoria técnica especializada.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
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