Summary
このプロトコルは、開発、展開、およびヒトES細胞やiPS細胞から派生したNK細胞のin vivoイメージングを説明しています。
Abstract
私たちは、フィーダーフリーのアプローチを使用して未分化ヒトES細胞やiPS細胞からナチュラルキラー（NK）細胞を導出する手法を提案する。この方法は、4週間培養した後、NK細胞の高レベルの上昇を与え、人工抗原提示細胞をさらに2ログ膨張を受けることができる。このシステムで開発されたヒトES細胞とiPS細胞由来のNK細胞が成熟した表現型と機能を持っています。遺伝的に変更可能なNK細胞の多数の製造は、基本的なメカニズムの、ならびに抗腫瘍の研究の両方に適用可能である。 hESC由来NK細胞にホタルルシフェラーゼの発現は、非侵襲的なアプローチは、NK細胞移植、分布、および関数に従うことができます。また、二つの異なる細胞集団の別個のモニターがよりはっきりとin vivoでの相互作用を特徴付けることができ、デュアル撮像方式を説明する。この導出方法、拡大、およびin vivoイメージングのデュアルは、NK細胞とその評を製造するための信頼性のあるアプローチを提供します現在のNK細胞養子治療法を改善する必要があるATION。
Introduction
ヒト胚性幹細胞（ES細胞）と人工多能性幹細胞（iPS細胞）無制限の自己再生および多系統分化することができる未分化多能性細胞である。ヒトES細胞が正常に1-3造血系の細胞を含むそれぞれの胚芽層の成熟と機能的なサブセットに分化してきた。ナチュラルキラー（NK）細胞は、間質細胞株1,2,6-8を有する4,5又は共培養胚様体（EB）を形成することによってヒトES細胞から誘導することができる自然免疫系のリンパ球である。 NK細胞は、抗ウイルスおよび抗腫瘍機能を有し、彼らのエフェクター機能を実行する前の抗原刺激を必要としないので、悪性腫瘍の広い範囲に対して有効である可能性があります。したがって、hESC由来NK細胞は免疫療法のための細胞の魅力源です。また、ヒトES細胞からNK細胞の導出は正常な発達を研究するために遺伝的に影響を受けやすいシステムを提供しています<in vitroでemが>。
それらは遺伝的に扱いやすいシステムを提供するので、ヒトES細胞由来のNK細胞は、実験的に、 インビトロおよびインビボで NK細胞のエフェクター機能を研究するための最適なモデルを提供し、生物発光、蛍光リポーターに発現するように改変することができる。ヒトES細胞由来のNK細胞は、HIV 9、白血病（K562）と他の癌のタイプ7,8を含むターゲットの範囲に対して活性を有する。しかし、効率的に患者を治療することのできる十分なNK細胞を導出する能力は、臨床翻訳のための重要な障壁ままで、より少ない程度、NK細胞の発達および抗癌機能のインビボ研究前臨床広範囲の制限にある。ここでは、ヒトES細胞4,5,10から造血前駆細胞を導出するスピンEBのアプローチを使用しています。 11日に続いてスピンEBを、28日間フィーダの有無にかかわらず、NK細胞培養に転送されます。 NK細胞培養培地中で4週間後、NK細胞は、過渡ある膜結合型人工抗原提示細胞（AAPCS）としてインターロイキン21（IL-21）を、表現するために修正されたK562細胞との共培養にsferred。これらの人工のAPC 11,12を使用して末梢血NK細胞の増殖のためのプロトコルを適応させる、我々は成熟した表現型および細胞毒性機能を保持しながら、NK細胞2 -ログを拡張することができます。
発展と拡大するこのプロセスは、in vivo特性評価における広範に十分なhESC由来NK細胞を提供する。 in vivo試験では、私たちは、非侵襲的に生物発光イメージングを使用して長期生着と動態（Fluc +）を発現する、注入ホタルルシフェラーゼ、hESC由来NK細胞をモニターすることができます。さらに、我々は、二重の生物発光又は蛍光撮像方式を用いて腫瘍細胞とNK細胞の相互作用に従うことができる。私たちのグループによる以前の研究では、腫瘍の進行とCLEに従う抗腫瘍モデルでは生物発光イメージングを使用した生体7 Fluc + K562細胞のarance。さて、急行ホタルルシフェラーゼ13,14に当社のヒトES細胞を工学的に我々は最近特徴付け蛍光タンパク質、turboFP650 15を表現K562腫瘍細胞にNK細胞の生体内分布と人身売買に従うことができます。我々は、同時に生体内における 2つの細胞集団（ 図1）に従うために、この二重レポーター系を選択した。ほとんどのデュアルイメージングモデルは、デュアルルシフェラーゼシステムでしたが、これらのシステムは、技術的に原因セレンテラジン、最もウミとガウルシフェラーゼレポーター16-18の発現に必要な基板の配信要件に挑戦することができます。蛍光レポーターは、in vitroで 、多くの細胞株と構造の監視を簡単に行うことが許されているが、組織と毛皮自家蛍光と多くの共同の発光スペクトルの重なりに起因する生体イメージングのための限られた成功を収めてきましたmmonly GFP、DsRedの、そしてTdTomato 15,19含む蛍光レポーターを使用していました。この懸念は、より良い組織の浸透度と背景15,19に比べ、より高い特定の信号を可能に遠赤色蛍光タンパク質の開発を奨励してきた。 TurboFP650、このシステムに示す蛍光タンパク質は、シフトした遠赤で、生きた動物でのイメージング蛍光タンパク質に関わる問題の多くを克服する。
ヒトES細胞由来のNK細胞を開発し、拡大するためのこの方法は、私たちはさらに、in vitroおよび現在のNK細胞養子 治療法を改善する優れたNK細胞の機能を理解するために必要な、臨床的に重要である生体内の hESC由来NK細胞を特徴付けることができました。また、派生とiPS細胞由来のNK細胞の増殖に適しています。デュアル蛍光と生物発光イメージング方式では、我々がここに示されている抗腫瘍モデル以外のシステムに広く適用されます。
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Protocol
1。スピンのEB文化TrypLEにおける適応ヒトES細胞やiPS細胞
- TrypLEとの最初の解離は、コラゲナーゼ継代培養からES / iPS細胞コロニーがあれば最高の作品は比較的小さいです。開始ES / iPS細胞集団は、細胞であるべき4-5日前より、もはや渡されません。 TrypLEパッセージの開始前に4-5日は、細胞は4日の時間で〜70％コンフルエントになるようになります密度でES細胞を渡す。 TrypLE継代ES細胞の培養のために定期的なES·メディアを使用します。ここでは、安定的ルシフェラーゼレポーター構築物（ 材料表 ）で修飾されたヒトES細胞を使用している。プロトコルは、造血前駆細胞とNK細胞の発達の比較のために変更されていない性IPSCを使用して、性IPSCで動作します。
- TrypLEパッセージの開始前に4日、通常の通路プロトコルに従って、コラゲナーゼIVとES / iPS細胞の細胞を渡す。我々は一般的にTrypLEを持つ最初の通路に1:1に渡す。それに応じて事前にES / iPS細胞の細胞を展開します。
- 注意深くTrypLE解離に進む前に、差別化されたコロニー（外接国境を欠いたり、上皮/線維芽細胞の特性を有するもの）狙い撃ち。分化した細胞はTrypLE経過とともに比較的容易に文化を引き継ぐことができるので、それはあなたの開始人口が非常にきれいであることを確認することが重要です。
- 井戸からメディアを吸引除去し、1.0ミリリットル予め温めておいたTrypLEはウェル当たり選択追加。
- 37℃のインキュベーター内で5分間TrypLEでインキュベートES / iPS細胞の細胞。井戸の底から5分、静かにピペットES細胞の後。
- 井戸からTrypLE細胞懸濁液を収集し、コニカルチューブに移す。 GEを上下ピペットntly 2-3回最大の塊がバラバラにすることを奨励する。少なくとも1等量ESのメディアと1等量のDPBSでTrypLEを希釈。 TrypLEは、培養培地によりクエンチしているので、プレートから細胞を除去した後、メディアとDPBSでTrypLEを希釈することが重要であるれない。我々はESメディアを保存するために洗浄用DPBS +メディアを使用しています。
- 冷却遠心機で5分（8℃）1,500 rpmで、細胞をスピンダウン。
- TrypLEを削除するには、できるだけ多くの上清をできるだけをオフに吸引。
- 4ミリリットルESメディアプラス4ミリリットルのDPBSとTrypLEの残りの痕跡を取り除くためにスピンを繰り返して再懸濁した細胞。
- メッキ用の適切なボリュームES培地で上清と再懸をオフに吸引。
- プレートのES細胞1：01 ES培地で低密度のMEF上に（または2:1が必要な場合）。
- 24時間後、新鮮なES培地で細胞を養う。最も可能性の高い添付していなかった多くの単一の細胞があります。 ESメディアで毎日のES細胞を養う。
- 新鮮たMEF（0.9-1×10にTrypLEに渡す
- 最初のいくつかの通路（最大5-10通過に）のために、細胞は、1:1で渡す必要があります。これは、細胞の増殖が困難になる。我々の経験では、ES細胞のプレーティング効率は4-5の通路の周りが劇的に低下した後、通路のカップルの中にバックアップしています。 5-7継代した後、1時03、最終的には1時02分で細胞を渡し始め、ことができるかもしれません。通路20を超えて、あなたは、1時05分または午前1時06分で細胞を渡して起動する必要があります。高密度にプレートしたES細胞を最初に5-10の通路にいることを確認してください。一度効率的に十分な、彼らが通過した後二日以内に〜70％コンフルエントに達することができる細胞プレートダウンポイントを取得すると、1時02分で合格開始しようとすることができ、最終的に1:3に合格することができる必要がありますか1時04分。性IPSCは、特に、完全に前に密集十分継代されていない場合dapted、差別化する傾向があります。
2。スピンEBの文化を設定するためのストック溶液を準備
- IMDMで10％BSA溶液：35ミリリットルIMDM（50ミリリットルコニカルで）でBSA 4gのを一時停止します。 BSAが完全に溶解することができるように1〜2時間室温で座るためのソリューションを可能にします。 10％の最終濃度を得るためにIMDMで40ミリリットルの合計音量を調整します。市販のBSAは、ES細胞に細胞毒性があります。ソリューションを脱イオンして細胞毒性の可能性を減らすことができます。 、脱イオンBSAの溶液40mlに〜1.3グラムの樹脂ビーズを追加して、よく振ってミックスする。
- 4で行わBSA溶液（樹脂ビーズ付き）°C青緑色から（交換容量が枯渇したことを示す）が黄色にビーズの色が変わるまで。
- ソリューションの交換を容易にするためにあらゆる20-30分を振る
- それぞれの交換は2時間かかる場合があります。交換が完了すると、チューブの底にペレットビーズに1,000 rpmで2分間、溶液を遠心する。
- ピップ破棄される新鮮な50ミリリットルコニカル、去るビーズにETTE BSA溶液。
- 繰り返しは、3つ以上の交換の合計2.2から2.5に少なくともさらに2回を繰り返します。最後の交換の間に、ビーズの容量が十分にあってもビーズで2時間インキュベートした後に排出されない場合があります。
- 無菌フィルターBSA溶液と残りのビーズを除去します。
- BSA溶液は、少なくとも2ヶ月間4℃で安定していなければならない。
- 5％PVA溶液：125ミリリットルのガラス瓶に測定100ミリリットルミリポアH 2 O。
- 水に5グラムPVAを追加します。これは、PVAが完全になるように水にPVAを追加することが重要である "ぬれた。"あなたはPVAに水を追加した場合、PVAが溶液に入るために、それは非常に長い時間がかかります。
- PVAはすぐに溶解しない。 4℃で一晩置きPVA /水溶液。
- 37の次の朝、場所PVA /水溶液4-8時間、°Cの水浴。 PVAは、年末までにほとんどのソリューションでなければなりませんインキュベーション。
- 追加の24〜48時間のために戻って4℃に置きボトル、または完全に溶解するまで。解決策は、わずかに粘性のあるかもしれない。
- PVAのソリューションは、少なくとも6週間は4℃で安定していなければならない。
- リノール酸とリノレン酸（10,000 Xソリューション）：200防エタノールで希釈するために1 mg / mlの。を10mlのエタノールに10ミリリットル純粋なオイルを追加します。 -20℃でアリコートと店舗
- α-MTG原液1ミリリットルIMDMで希釈13μlのα-MTG。
- アスコルビン酸2 -リン酸溶液（100X）：5 mg / mlのソリューションを作成します。 50ミリリットル滅菌、組織培養グレードH 2 Oで250mgのアスコルビン酸2 -リン酸容易に溶解する。
3。 BPELメディアの組立（〜200ミリリットル総容積のために）
- PVA-脂質混合物（このステップは除外されてしまう中で不溶性液滴を形成することから、PVAを防ぐ）ことを確認します。
- 50〜20ミリリットルのIMDMと20ミリリットルF-12栄養混合物を追加mlコニカルチューブ。
- 5％PVA株式の10ミリリットルを加え、0.4ミリリットルsynthechol、20μlのリノレン酸、および200ミリリットルBPELメディアの20μlのリノール酸。混合するだけでなく、チューブを横に振る。他のメディアコンポーネントを組み立てている間に脇に置きます。
- 250ミリリットルSTERICUP濾過ユニットの一番上に、残りのすべてのメディアコンポーネントを追加します。必要なIMDMと100X F-12巻（66ミリリットルずつ）、BSA、-MTG、ITS、グルタマックスI、ペニシリン/ストレプトマイシン、無タンパク質ハイブリドーマ混合物II、およびアスコルビン酸のバランスを追加します。ステップ1からSTERICUPのトップにPVA-脂質混合物を追加します。培地をフィルタリング。培地は、少なくとも2週間は4℃で安定していなければならない。洗浄ステップのために古い培地を使用してください。
4。ステージにTrypLE継代ES細胞を設定する私はEBSをスピン
低密度のMEF（少なくとも5-7回でTrypLEで継代されたすなわち、ES / iPS細胞の細胞）の通過をTrypLEするようになってきたES / iPS細胞の細胞を使用してください。細胞は〜1時03分で通過し、3〜4日で70〜80％コンフルエントになることができれば、細胞が使用する良いことがあります。
- 二日スピンEBの分化（日-2）を設定する前に、：それらが分化·セットアップの日に合流70〜80％であることができるように密度で新鮮MEFの上にTrypLE適応したES / iPS細胞の細胞を渡します。我々は一般的にEBセットアップをスピンする前に48時間を渡します。
- スピンEBメッキに備えるため、ピペット150μlの滅菌水各96ウェルプレートの36外側のウェルに蒸発を最小限にする：私は差別（0日）ステージにスピンEBセットアップの日 。唯一の丸底、低付着、96ウェルプレートを使用してください。
- ES / iPS細胞の細胞の培地をオフに吸引除去し、各ウェルに選択1.0ミリリットル予め温めておいたTrypLEを追加します。
- 5分間インキュベーターに置きプレート（37°C）。ゆっくり板細胞をオフにピペット。
- コニカルチューブに解離細胞を収集し、塊をバラバラにするために上下にピペッティングし。 1等量のBPELメディアおよび少なくとも1等量のDPBSでTrypLEを希釈。
- 上清を除去し、再懸濁5ミリリットルBPELメディアプラス5ミリリットルDPBSのセル。スピンを繰り返します。
- 予想される細胞数に応じて5〜10ミリリットルBPELメディアに清と再懸濁した細胞を取り除きます。 （EBの形成を妨げることができます）塊を除去するために、円錐形のフレッシュ50mlに70μmのフィルター（BDファルコン＃352350）を介した細胞を渡します。
- フィルタリングされた細胞をカウントします。アリコートの細胞を50mlコニカル及びスピンにめっきに使用される。メッキの場合：3,000 ES細胞/ウェル、60ウェルの/プレート= 1.8×10 5 ES細胞/プレート。
- 遠心分離後、細胞は3×10 4細胞/ ml（体積100μl/ウェル、3,000 ES細胞/ウェル）に再懸濁さする必要がある。
- BPELメディアの音量+細胞（これは6ミリリットル/プレートになります）再懸濁のために十分なサイトカインを準備します。 I期分化のために、我々は造血前駆細胞の誘導のためにSCF（40 ngの/ ml）を、BMP4（20 ngの/ ml）を、およびVEGFを（20 ngの/ ml）を使用しています。
- プレート100よくμlの細胞/（= 3,000細胞/ウェル）た準備の内側の60の各ウェルにED 96ウェルプレート。マルチチャンネルピペッターおよび滅菌トラフを使用するときにこれが最も簡単です。細胞が沈降する機会を持っていないので、すぐに谷に入れる前にピペッティングにより細胞を混ぜて作業してください。
- 〜1,500 rpmで4分間、8℃で冷却遠心機で96ウェルプレートをスピン
- 遠心機から37℃インキュベーターにプレートを慎重に移す。なるべくプレートを中断することは避けてください。細胞は井戸の底に均一にペレットを形成していることを確認するためのプレートを確認してください。
- EBは、より耐久性のある外側の層を形成しているまで、私はEBを数日3-4分化を介して供給あるいは邪魔するべきではありませんスピンステージ。 EBをが10-12日先以降のステージのどこに放置された場合、我々は時々、各ウェルへのサイトカインと50μlの新鮮なBPELメディア（最初の各ウェルから古いメディア50μlのを取る）とEBSを養う。 24時間以内に、細胞は3-D EB構造を形成し始めるべきであり、一日3-5によって別個の外側層を有し、deveを開始する必要が嚢胞構造をローピング。
5。 FACS分析のための解離ステージI EBを
FACS分析のためaround18-36スピンEBを収集します。 6日目の前に細胞を分析した場合、複数のウェルは、十分な細胞数を得るために必要とされる。
- 2％ニワトリ血清をトリプシンの必要なボリュームを準備します。 37で行われ、使用するまで°C水浴。
- 96ウェルプレートで15 mlコニカルチューブにスピンEBは、メディアを転送します。
- EBのはコニカルチューブの底に沈殿することができます。 5ミリリットルピペットで、慎重に上清と別のチューブ（あなたが1 15ミリリットルまたは50 mlコニカルチューブにプール上清のすべてをすることができます）への転送をピペット。いくつかの造血細胞が既に日9と11の間にスピンEBから解放されたように、これらの細胞を含む上清を分離することは過度のトリプシン処理を防ぐことができます。
- トリプシンで再懸濁したEB + 2％ニワトリ血清：各15ミリリットルコニカルチューブ3-4〜mlであった。 37にトリプシンでEBSを置き°Cウォート3-7分間rbath。すべての1-2分を振ったり、軽くボルテックス。以前の時点で（8日前）、EBを、より容易にバラバラになると、わずか3として分を取ることができます。後の時点で（8日目+）EBSが解離する時間がかかることがあります。我々は通常、彼らが37℃以上で5分間℃でトリプシン処理させない注、これらの時間はあくまで目安です。任意の特定の細胞株またはEB分化のために、それはEBSを解離させる多かれ少なかれ時間がかかる場合があります。密接に解離を監視します。それはあまりにも長い間、トリプシンで細胞を残さないことが重要です。それはトリプシンのみいくつかの小さな塊が表示されたままに解離はなくすべての塊を排除しようとするを停止することをお勧めします。
- FBS含有培地のうち少なくとも1等量のトリプシンをクエンチ。細胞（1,500回転、5分、8℃）スピンダウン。
- （通常3-5 ml）をカウントするために、メディアの適切な量で細胞を再懸濁します。
- 100μmのセルストレーナーを通してフィルタセル。カウントするため、細胞のアリコートを削除します。細胞を続行標準ラボFACSプロトコルに。
6。 HPSC由来の前駆細胞からNK細胞の開発、拡張、および特性
スピンEBを、造血前駆細胞を高い割合で含んでいるので、それらは11日目に直接NK細胞培養に転送することができる。スピンのEBは、フィーダの有無にかかわらず24ウェルプレートに移してもよい。私たちは、それぞれの条件で得られたNK細胞間の表現型や機能に差は示さなかった。したがって、我々は一般的にNK細胞の発達のために完全に定義されたシステムを持っているフィーダせず培養液に移す。次善の造血分化にヒトES細胞/ iPS細胞ラインを使用している場合はフィーダー層の使用は、7,8をお勧めします。
- 24ウェルプレートの各ウェルへの転送6スピンEBを、100μlに設定するマルチチャンネルピペットを使用して。
- 転送スピンEBを照射10万（3,000 CGY）EL08-1D2を（マウスembryoni含む24ウェルプレートへ：フィーダとC肝細胞株）細胞をウェル当たり。フィーダなし：直接コーティングされていないため、転送EBを、24ウェルプレート。
- 各ウェルの総体積は〜1ミリリットルですので、サイトカイン（IL-3、IL-15、IL-7、SCF、FLT3L、Peprotech社からのすべて）を含む400μlのNK分化培地を追加します。
- インキュベーターに入れ、細胞とIL-3を除くステップ6.3にすべてのサイトカインを含むNK分化培地で毎5-7日養う。
- NK細胞は、NK細胞分化文化に28日以下の転送（ 図2）で、成熟した表現型を発現するであろう。
- NK細胞毒性を試験するために、4時間クロム放出アッセイを08行うことができる。
- 多数の細胞がインビボ研究のために必要とされる場合は、人工抗原提示細胞（AAPCS）との共培養は、2 -ログ以上の膨張を得ることができる。詳細なプロトコルについては、訪問http://www.joveを.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12。
7。免疫不全マウスにヒトES細胞由来のNK細胞および腫瘍細胞を監視する生体蛍光と生物発光イメージング
我々の実験のすべてにおいて6〜8週齢のマウス。私たちは、非肥満糖尿病/重症のγ鎖ノックアウト（ - / - NOD / SCID /γC）と免疫不全組み合わせを使用私たちは同時に、in vivoで腫瘍の進行（turboFP650記者）とのhESC-NK細胞の動態を（Flucレポーターが親のES細胞で発現）を追跡するためにデュアルイメージングモデルを使用しています。このイメージング方式は、ここに示されている抗腫瘍モデル以外のシステムに広く適用されます。 IVISスペクトラム（キャリパーライフサイエンス）は同時in vivoでの蛍光と生物発光イメージングに最適です。
- 腫瘍細胞の注射の前に24時間、照射マウス（225-250センチグレイ）。
- 所望の数を再懸濁し20％FBSを添加したダルベッコ培地（IMDM）を修正し、200μlのイスコブ中の腫瘍細胞（1×10 6 K562細胞が示されています）。腫瘍細胞の投与量は使用されるモデルに応じて変化させることができる。 TurboFP650は、非腫瘍タイプにおいて発現することができる。これは最高の単一の解剖学的部位に局在する細胞と結像される。
- 27または28ゲージの針を使用して、マウスの左上胸部皮下に腫瘍細胞を注入し、4日間生着することができます。細胞は、マウスの皮膚の下にバブルを形成すべきである。マウスは、より良い注入を視覚化するために本体のこの部分で剃毛することができる。また、 生体内蛍光イメージングにおけるよりよいのための領域を公開します。 IPはマウスが仰臥している間、NK細胞は最高可視化されるため、注入されたマウスの胸部の周りに注入は、このモデルで使用されていた。背中や脇腹を含む皮下配信の代替の方法は、動物へのストレスの少ないあると考慮されるべきである。
- たhESC-デリ、所望の数を再懸濁し抗生物質なしで、20％FBSを添加したダルベッコ培地（IMDM）が修正された300μlのイスコブでVED NK細胞（10×10 6 NK細胞が示されています）。
- 27または28ゲージの針を使用して、各マウスの腹腔内（IP）にヒトES細胞由来のNK細胞を注入する。すべての実験では、ネガティブコントロールとして全く腫瘍またはNK細胞注入を受けていないマウスが含まれています。
- 続いて最初の7日間、毎日マウスのIL-2（1×10 4 U /マウス）、および滅菌DPBSにおけるIL-15（10 ngの/マウス）250μlのIP注射を与え、 生体内で NK細胞集団を維持するために、IL-屠殺時まで2のみ2〜3日ごとに。
- 生物発光イメージングによるヒトES細胞由来のNK細胞の生着を監視します。 120μlのD-ルシフェリン（150 mg / kg）を、各マウスのIPを注入。 D-ルシフェリン注射後のマウス10分画像。
- 0.8リットル/分でボックスにイソフルラン入力を可能にするチャンバーを用いてマウスを麻酔。チャンバへの酸素の流れもあることを確認してください。
- 麻酔場所テープやマジックテープを使用して彼らの背中にIVISスペクトラムと安全なマウスではマウスや麻酔を維持するために、0.5リットル/分でボックスにイソフルランエントリーを可能にします。
- 媒体はf / 1に停止し、1分間画像を取得するビニング設定し、（4-5マウスではD、3つ以下のマウスについてC）イメージングプラットフォームを補正するためにIVISマシンを設定する。
- turboFP650 +細胞のための蛍光イメージングを実行するには、関心だけでなく、バックグラウンド信号の測定プローブの発光スキャンを設定するにはイメージング·ウィザードを使用しています。プローブのリストから入力エム/ EXを選択し、正しい励起および発光に入力。 turboFP650の場合は、腫瘍の信号と570励起と背景信号を測定するために640から720の発光を測定するために605励起と660から720の発光を使用しています。自動露出の設定を使用して、目的のイメージングプラットフォームを選択します。全体のイメージングシーケンスは、一般的に取得するために3〜5分間かかります。
- マウスは完全にイメージング·システムから輸送前に麻酔から回復することができます。リチウムを用いて画像を分析するImageソフトウェアパッケージのバージョン4.2（キャリパーライフサイエンス）をムス。
- 全光束（光子/秒）または平均輝度（光子/秒/ cm 2で/ SR）と同じスケール（ 図3）にすべての画像を設定するに設 定した関心領域（ROI）を使用して、生物発光シグナルを定量化する。ここでは、代表画像を各マウスにおける細胞集団（ 図3）の両方を示すために使用される。我々の研究室から他の研究では、このテクニック20を用い共局在を示した。共局在タイミングは、使用される実験モデルに基づいて最適化する必要がある。
- エミッションスキャンシーケンスから蛍光シグナルを定量化するために "スペクトルアンミキシング"機能リビングイメージで使用してください。分析に含めると関心、この場合には、上部の胸部のシグナルを含むマウスの領域の上にマスクを描画する画像を選択します。純粋べき組織autofluorescenseと未知のプローブを選択します。マウスは、アルファルファを含む食品を与えられている場合、食品信号もuをすることができ利子および組織の自家蛍光プローブからnmixed。
- 得られた画像は、組織自己蛍光（信号が配置されている領域を含む）の均一な分布を表示していない場合は制約が一貫している分布と純粋成分の良好な分離を得るために設定することができる。これは典型的な、特定の信号がロー、またはそれに近いバックグラウンド信号にあるときに、ソフトウェアではなく、プローブの多くの場合に必要です。 turboFP650の排出曲線の下端に相当する640 nmのためのアップデート]タブの下にあるハイパスフィルタを設定します。ローパスフィルタ制約も設定が、それはここに示されている画像解析に不要だっすることができる。
- 放射効率（光子/秒/ cm 2で/ SR）/μWに設定した関心領域（ROI）を使用して混合されていない画像から蛍光シグナルを定量化）と同じスケール（ 図3）にすべての画像を設定してください。
- 所望の時点で、マウスを屠殺し、専用のために分析することができるフローサイトメトリーによるhESC由来細胞のgraftment。腹腔内に注入されたNK細胞のために我々は通常、末梢血（顔面静脈ブリード）、脾臓、腹膜を分析します。腹腔洗浄液を単に腹膜を露出させ、腹膜腔にアクセスするためにガラスパスツールピペットを可能にするのに十分な内側切開部が外れことによって行うことができる。滅菌PBSを使用して、マウスを回転させることにより、溶液を十分に混合することを確認し腹膜腔の数回の洗浄を行います。あなたが見えるペレット次遠心（洗浄の通常5〜10 ml）になるまで十分な流体収集。
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Representative Results
スピンEB法を用いて造血前駆細胞の生成は、ヒトES細胞とiPS細胞から最適なNK細胞の発達を可能にする。 図2に示したように、11日目のスピンのEBは、CD34、CD45、CD43、およびCD31を発現している前駆細胞の割合が高いが含まれています。 CD34とCD45の高レベルの間質細胞をソートや支援を必要とせずNK条件に直接転送することができます。次善のスピンEBの分化がある場合は、このようなEL08-1D2としてストローマ細胞がセカンダリNK条件で使用されることをお勧めします。 4週間の培養に続いて、スピンのEBは、NK細胞（24ウェルプレートのウェルあたり約1〜2×10 6細胞）の多数を生じる。培養物はまた、このシステム7にNK細胞の発達が徐々に進行状況を確認するために、以前の時点で表現型することができる。 NK細胞は、親ES / iPS細胞ラインに変更されたので、次に続くことができるレポーター遺伝子の発現を維持する
図1。デュアルイメージングスキームと発達タイムライン。 生体モデルでのA）の模式図。マウスはルシフェリンとIPを注入し、適切なインキュベーション時間後にされ、ホタルルシフェラーゼ+細胞は生物発光シグナルを結像される。生物発光画像の取得、TurboFP650 +細胞を画像化することができるから蛍光シグナル。たhESC-DERIVの開発とテストのためのB）タイムラインに続いてED NK細胞。
図2。ヒトES細胞やiPS細胞から派生したスピンのEBとNK細胞の表現型。スピンEB培養における）フォロー11日間、細胞をフローサイトメトリーによって分析することができる。 11日目の時点では、CD34、CD43、CD45、およびNK細胞分化のための最適CD31発現する細胞の高い割合を与える。B）NK細胞は、NK細胞培養の4週間後にフローサイトメトリーを用いて検出することができる。リンパ球ゲート（FSC / SSCプロット）内の細胞をCD56の発現について分析する。 CD56 +細胞はさらに、CD117などのマーカー、CD94、NKp46は、または他の共発現のために分析することができますより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 IVISスペクトラムを用いたin vivoでの蛍光と生物発光イメージング 生体モニタリングでは、このプロトコルの主な目的です。したがって、マウスは腫瘍クリアランス出続けていません。我々の以前の報告書は、（20万K562細胞を使用して）その腫瘍クリアランスは三週間7で発生を示しています。）Fluc + hESC由来NK細胞の生物発光イメージングを0日、7日、および14日にNK細胞注入が一番上の行に表示された後に。 TurboFP650の蛍光撮像+ 0日目、7、およびNK細胞の注射後14 K562細胞を、下段に示されている。蛍光画像は、生物発光画像取得の直後に取得した。B）シーケンスを示す組織の自家蛍光とturboFP6からの蛍光シグナル50 +細胞、画像ソフトをリビングでスペクトルアンミキシング機能を使用して生成された。各画像に左端にマウスが非噴射制御であり、唯一のバックグラウンド信号を示しています。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ヒトES細胞は、多様な種類の細胞を研究し、臨床的な翻訳のための顕著な潜在力を保持するための理想的なプラットフォームです。私たちは、造血前駆細胞にヒトES細胞/ iPS細胞を区別するために定義され、スピンEBのアプローチを使用しています。スピンEBアプローチは、NK細胞へ造血前駆細胞および分化の一貫した誘導が得られている、まだ、ばらつきが依然として細胞系全体の分化効率が存在し、他の造血細胞系統を生成するために変更する必要があります。同等の結果が他のEB又は間質培養法で導出から得ることができるが、このシステムは、無血清であり、他の方法に比べて造血前駆細胞を製造するためのより明確なアプローチを表す。また、臨床翻訳のための主要な関心事を克服同様フィーダーフリー方法、これらの造血前駆細胞からNK細胞を導出する標準化された効率的な方法を持っている。また、NK細胞开を研究するための定義されたシステムを提供in vitroで T。前臨床広範囲、例えば、NK細胞のような造血細胞のインビボ特性評価において 、特に臨床試験これらの実験的に誘導される細胞タイプおよびその実施を規定することも必要である。
イメージングと顕微鏡技術の進歩は、生物発光と蛍光レポーターを15-17,19,21を発現する細胞のin vivoモニタリングにおける長期的かつ非侵襲的な有効にしている。最も注目すべきは、その初期の特性ので多様な種類の細胞を視覚化するために使用されてきたホタルルシフェラーゼ構築物の使用である。これは、in vivoイメージングのための理想的なレポーターであるが、唯一の細胞集団を監視することに限定されている。デュアルレポーターシステムの最大の利点は、2つの異なる細胞集団の間の相互作用をフォローする機能です。しかし、少数の記者は、両方の生体内での画像に簡単であり、上記の十分かつ定量信号を持って開発されている背景。
TurboFP650、我々のデュアル撮像方式で使用される蛍光タンパク質は、背景とは異なる自家蛍光シグナルを与える、遠赤シフトされる。しかし、リビングImageソフトウェア（キャリパーライフサイエンス）のスペクトルアンミキシング法の利用は我々のシステムにおけるバックグラウンド比に信号を最大化するために必要であった。蛍光タンパク質イメージングの本質的な課題に助けることができるリビングImageソフトウェアの多くの機能があります。それでも、信号の浸透度は、課題である。腫瘍細胞はIP注射した場合のようにシステムが、小細胞集団または分散した細胞のイメージングの撮像のためのさらなる最適化を必要とする。しかし、蛍光イメージングの一貫性と使いやすさは、その使用デュアルイメージングモデルで使用するための理想的なプラットフォームとなります。動物は短い時間麻酔下で、ほとんどのデュアルルシフェラーゼシステムと、第2の基板を提供する必要はない。
この方法導出の、in vivoでの拡大、およびデュアルイメージングは現在NK細胞養子 治療法を改善する必要があるhESC由来やiPS細胞由来のNK細胞とその評価を製造するための一貫性のあるアプローチを提供します。デュアル蛍光と生物発光イメージングモデルは、我々が示されている抗腫瘍モデル以外の二つの異なる細胞集団の長期的な研究のために広く適用可能である。
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Disclosures
この作品はグラント、ミネソタ大学R01-HL77923 NIH / NHLBIでサポートされている（DSK）とNIH MSTP助成T32 GM008244（DAK）、幹細胞生物学研修グラントT32（DAK）（T32HD060536）、学部研究の機会プログラム（UROP）でた（AMB）、ミネソタ州がんセンターの大学、ウィリアム·Lとブランシュ·ヒューズ財団の白血病研究基金。
Acknowledgments
著者は、私たちの研究室の中でスピンEBプロトコルの開始のためメリンダHexumに感謝したいと思います。私たちは、この作品で彼らの技術支援のためにローラE. Bendzick、マイケルLepley、とジェーニャNiを含む研究室の他のメンバーに感謝したいと思います。著者はまた、彼の専門的技術的助言のためにキャリパーライフサイエンスでブラッド·テイラーに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercapt–thanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R & D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells |  MD Anderson, Houston, TX |
contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section | |
Materials Table. |
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References
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