Summary
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling, groei en in vivo beeldvorming van NK cellen uit hESCs en iPSCs.
Abstract
We stellen een werkwijze voor het afleiden van natuurlijke killer (NK) cellen ongedifferentieerd hESCs en iPSCs met een feeder-free benadering. Deze methode leidt tot hoge niveaus van NK-cellen na 4 weken kweek en verder log2 uitbreiding met kunstmatige antigeenpresenterende cellen ondergaan. hESC-en IPSC-afgeleide NK-cellen ontwikkeld in dit systeem hebben een volwassen fenotype en functie. De productie van grote hoeveelheden van genetisch beïnvloedbare NK-cellen kan zowel voor de mechanistische basis als anti-tumor studies. Expressie van vuurvliegluciferase in hESC-afgeleide NK-cellen kan een niet-invasieve benadering van NK cellen aanslaan, distributie, en de functie volgt. We hebben ook een dual-imaging regeling die het mogelijk maakt afzonderlijke bewaking van twee verschillende celpopulaties hun interacties duidelijker karakteriseren in vivo te beschrijven. Deze methode van afleiding, expansie, en dual in vivo beeldvorming biedt een betrouwbare aanpak voor de productie van NK-cellen en hun evaluatieatie die nodig zijn om de huidige NK cel adoptie therapieën te verbeteren is.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn ongedifferentieerde, pluripotente cellen die in staat onbeperkt zelf-vernieuwing en multi-lijn differentiatie. hESCs zijn succesvol onderscheiden in volwassen en functionele subsets van iedere kiem lagen, waaronder cellen van het hematopoietische systeem 1-3. Natural killer (NK) cellen zijn lymfocyten van het aangeboren immuunsysteem, dat kan worden afgeleid uit hESCs door de vorming van embryoid instanties (EBS) 4,5 of co-cultuur met stromale cellijnen 1,2,6-8. NK-cellen bezitten anti-virale en anti-tumor vermogens en hebben het potentieel om effectief te zijn tegen een breed spectrum van tumoren, omdat zij niet gevalideerd antigeenstimulatie hun effectorfuncties uitvoeren. Aldus hESC-afgeleide NK cellen een aantrekkelijke bron van cellen voor immunotherapie. Daarnaast is de afleiding van NK-cellen uit hESCs biedt een genetisch vatbaar systeem om normale ontwikkeling studeren <em> in vitro.
Omdat zij een genetisch handelbaar systeem kan hESC-afgeleide cellen NK experimenteel aangepast om fluorescente en bioluminescente reporters drukken waardoor een optimale model NK cell effector functie in vitro en in vivo. hESC-afgeleide NK-cellen bezitten activiteit tegen een aantal doelen, waaronder HIV 9, leukemie (K562) en andere vormen van kanker 7,8. De mogelijkheid om efficiënt genoeg leiden NK cellen die in staat om patiënten blijft een belangrijke hinderpaal voor klinische toepassing en, in mindere mate, een beperking voor uitgebreide preklinische in vivo studies van NK cel ontwikkeling en anti-kanker functies. Hier gebruiken we een spin EB benadering van hematopoietische voorlopercellen ontlenen hESCs 4,5,10. Na 11 dagen de spin EBS worden overgebracht naar NK celkweek met of zonder feeders voor 28 dagen. Na 4 weken in NK cel kweekmedium, NK-cellen zijn transferred aan co-kweek met K562 cellen gemodificeerd om expressie membraangebonden interleukine 21 (IL-21), die als kunstmatige antigeenpresenterende cellen (aAPCs). Aanpassen van een protocol voor de uitbreiding van perifere bloed NK-cellen met behulp van deze kunstmatige APC's 11,12, zijn we in staat om NK-cellen uit te breiden 2-logs met behoud van een rijp fenotype en cytotoxische capaciteiten.
Dit proces van ontwikkeling en uitbreiding voldoende hESC-afgeleide cellen NK voor uitgebreide in vivo karakterisering. Voor in vivo studies, zijn we in staat om niet-invasief bewaken lange termijn innesteling en kinetiek van geïnjecteerde vuurvliegluciferase uiten (Fluc +), hESC-afgeleide NK-cellen met behulp van bioluminescentie beeldvorming. Bovendien zijn wij in staat om NK-cel interacties te volgen met tumorcellen met een dual, bioluminescente of fluorescerende beeldvorming regeling. Een eerdere studie van onze groep gebruikt bioluminescentie beeldvorming in een anti-tumor model om tumorprogressie en cle volgenarance van Fluc + K562-cellen in vivo 7. Nu, door de engineering van onze hESCs aan uitdrukkelijke vuurvliegluciferase 13,14 wij kunnen de biologische verdeling van en handel in NK-cellen te volgen naar K562 tumorcellen dat de onlangs gekenmerkt fluorescerend eiwit, turboFP650 15 drukken. We hebben dit dubbele reporter systeem gekozen om gelijktijdig volgen twee celpopulaties in vivo (figuur 1). De meeste dual imaging modellen zijn dual-luciferase systemen geweest, maar deze systemen kunnen technisch gezien een uitdaging vanwege de levering eisen van coelenterazine, de ondergrond die nodig zijn voor de expressie van de meeste Renilla en Gaussia luciferase reporters 16-18. Fluorescerende reporters hebben toegestaan eenvoudige controle van veel cellijnen en constructies in vitro, maar heeft beperkt succes voor in vivo beeldvorming moest vanwege de overlap tussen weefsel en bont autofluorescentie en de emissie spectra van vele commonly gebruikte fluorescerende verslaggevers waaronder GFP, DsRed en tdTomato 15,19. Deze bezorgdheid heeft de ontwikkeling van ver-fluorescerende eiwitten, waardoor betere weefsel penetrantie en hoger specifiek signaal vergeleken background 15,19 aangemoedigd. TurboFP650, het fluorescerende eiwit getoond in dit systeem, is ver-rood verschoven en overwint veel van de kwesties die met beeldvorming fluorescerende eiwitten in levende dieren.
Deze werkwijze voor het ontwikkelen en uitbreiden van NK cellen uit hESCs konden wij verder te karakteriseren hESC-afgeleide NK cellen in vitro en in vivo, waarbij een beter begrip nodig NK celfunctie en klinisch belang huidige NK cel adoptieve therapie verbeteren is. Het is ook ontvankelijk voor de afleiding en uitbreiding van iPSC-afgeleide NK cellen. De dubbele TL-en bioluminescentie beeldvorming regeling is breed toepasbaar op andere dan de anti-tumor model dat we hebben hier getoonde systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aanpassing hESCs of iPSCs in TrypLE voor Spin EB Culturen
- De eerste dissociatie met TrypLE werkt het best als de ES / iPS kolonies van de collagenase-passage culturen zijn relatief klein. Het uitgangspunt ES / iPS populatie dient cellen worden doorgegeven niet langer dan 4-5 dagen vorige. 4-5 dagen voor aanvang van TrypLE passage, pass ES-cellen bij een dichtheid waarmee de cellen tot ~ 70% confluent in 4 dagen tijd. Gebruik gewone ES media voor cultuur van TrypLE-gepasseerde ES-cellen. Hier gebruiken we hESCs stabiel gemodificeerd met een luciferase reporter construct (Materials tabel). Het protocol werkt ook iPSCs, met ongemodificeerde iPSCs voor vergelijking van hematopoietische cellen en NK celontwikkeling.
- Vier dagen voor aanvang van TrypLE passage, pass ES / iPS cellen met collagenase IV, na een normale doorgang protocol. We meestal passeren 1:01 in de eerste passage met TrypLE. Expand ES / iPS cellen dienovereenkomstig vooraf.
- Kies zorgvuldig uit gedifferentieerde koloniën (die welke een afgebakende grens missen of hebben fibroblastische / epitheliale kenmerken) alvorens tot TrypLE dissociatie. Gedifferentieerde cellen kan over de cultuur relatief gemakkelijk te nemen met TrypLE passage, dus het is belangrijk om ervoor te zorgen dat uw uitgangspunt bevolking is zeer schoon.
- Aspireren media uit putten en voeg 1,0 ml voorverwarmde TrypLE Selecteer per putje.
- Incubate ES / iPS cellen in TrypLE gedurende 5 min in een 37 ° C incubator. Na 5 min voorzichtig pipet cellen van de bodem van de put.
- Verzamel de TrypLE celsuspensie uit putten en over te dragen aan een conische buis. Pipet op en neer gently 2-3 keer aan te moedigen de grootste klompen om uiteen te vallen. Verdun TrypLE met tenminste 1 gelijk volume ES media en 1 gelijk volume DPBS. TrypLE niet gedoofd door kweekmedia, dus is het belangrijk om de TrypLE verdunnen met media en DPBS cellen na verwijdering van de plaat. Wij gebruiken DPBS + media voor wasbeurten aan ES media te slaan.
- Spin down cellen bij 1500 rpm gedurende 5 minuten in gekoelde centrifuge (8 ° C).
- Zuig zo veel af van de supernatant mogelijk TrypLE verwijderen.
- Resuspendeer cellen in 4 ml ES media plus 4 ml DPBS en herhaal spin om zich te ontdoen van de resterende sporen van TrypLE.
- Aspireren uit supernatant en resuspendeer in juiste volume ES media voor plating.
- Plaat ES-cellen 01:01 (of 02:01 indien nodig) op low-density MEF in ES media.
- Na 24 uur, voeden cellen met verse ES media. Er zal waarschijnlijk veel afzonderlijke cellen die niet hechten. Feed ES-cellen dagelijks met ES media.
- Pass met TrypLE op verse MEF (0.9-1 x 10
- Gedurende de eerste passages (tot passage 5-10), de cellen moeten passeren om 01:01. Dit maakt uitbreiding van cellen moeilijk. In onze ervaring, plating efficiëntie van de ES-cellen daalt dramatisch rond passages 4-5 en dan komt terug binnen een paar passages. Na passages 5-7, kunt u in staat om te beginnen met het passeren van de cellen op 1:02, en uiteindelijk, 01:03. Beyond passage 20, kan het nodig zijn om te beginnen met het passeren van de cellen op 1:05 of 1:06. Zorg ervoor dat het bord van de ES-cellen in een hoge dichtheid van de eerste 5-10 passages. Als je eenmaal op een punt waar de cellen plaat naar beneden efficiënt genoeg dat ze ~ 70% confluentie kan bereiken binnen twee dagen na de passage, kunt u proberen om te beginnen met het passeren op 1:02, en uiteindelijk moeten kunnen passeren op 1:03 of 01:04. iPSCs, in het bijzonder, zo niet dicht genoeg gepasseerd voordat volledig eendapted, neigen te differentiëren.
2. Bereid Stock Oplossingen voor instellen Spin EB Culturen
- 10% BSA oplossing in IMDM Suspendeer 4 g BSA in 35 ml IMDM (in een 50 ml conische). Laat de oplossing te zitten bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur te laten BSA volledig te ontbinden. Pas totale volume IMDM met 40 ml tot een eindconcentratie van 10% te krijgen. Commercieel beschikbare BSA kan cytotoxisch zijn voor cellen van. Deionizing de oplossing kan de kans op cytotoxiciteit verminderen. Om deioniseren, voeg ~ 1,3 g hars kralen om 40 ml BSA-oplossing en schud goed om te mengen.
- Plaats BSA-oplossing (met harsparels) bij 4 ° C totdat kralen van kleur veranderen van blauw-groen naar geel (wat aangeeft dat de uitwisseling capaciteit is uitgeput).
- Schud oplossing elke 20-30 min tot uitwisseling te vergemakkelijken
- Elke uitwisseling kan tot 2 uur. Als uitwisseling is voltooid, centrifugeer oplossing gedurende 2 min bij 1000 rpm tot pellet kralen onderaan de buis.
- Pipette BSA oplossing in een 50 ml conische frisse, waardoor korrels worden weggegooid.
- Herhaal stappen 2.2-2.5 tenminste nog tweemaal voor een totaal van drie of meer uitwisselingen. De laatste uitwisseling, de capaciteit van de korrels kunnen niet volledig worden zelfs na twee uur incubatie met de kralen opgebruikt.
- Steriel filter de BSA-oplossing en verwijder alle resterende kralen.
- De BSA-oplossing moet bij 4 ° C stabiel gedurende tenminste 2 maanden.
- 5% PVA-oplossing: Meet 100 ml Millipore H 2 O in 125 ml glazen fles.
- Voeg 5 g PVA aan het water. Het is belangrijk om het PVA aan het water toe te voegen zodat het PVA wordt ruim "nat". Als je het water toe te voegen aan de PVA, het zal heel lang duren voor de PVA om in oplossing gaan.
- PVA zal NIET onmiddellijke ingang te ontbinden. Plaats PVA / water-oplossing bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Volgende ochtend, plaats PVA / water-oplossing in 37 ° C waterbad gedurende 4-8 uur. PVA moet meestal in oplossing zijn tegen het einde vande incubatie.
- Plaats fles weer 4 ° C gedurende nog 24-48 uur, of tot volledig opgelost. Oplossing zou kunnen zijn licht viskeuze.
- PVA oplossingen moeten bij 4 ° C stabiel gedurende tenminste 6 weken.
- Linolzuur en linoleenzuur (10.000 X toegevoegd): Verdun tot 1 mg / ml in 200-proof ethanol. Voeg 10 ml pure olie tot 10 ml ethanol. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
- α-MTG stockoplossing: Verdun 13 pi α-MTG in 1 ml IMDM.
- Ascorbinezuur 2-fosfaat-oplossing (100X): Maak een 5 mg / ml oplossing. 250 mg ascorbinezuur 2-fosfaat in 50 ml steriel, weefselkweek graad H 2 O. Lost gemakkelijk.
3. Assemblage van BPEL Media (voor ~ 200 ml Totaal Volume)
- Maak een PVA-lipiden mengsel (deze stap voorkomt dat de PVA vorming van onoplosbare druppels in het medium dat zou krijgen uitgefilterd).
- Voeg 20 ml IMDM en 20 ml F-12 voedingsmengsel te 50ml conische buis.
- Voeg 10 ml van 5% PVA voorraad, 0.4 ml synthechol, 20 ui linoleenzuur en 20 ui linolzuur voor 200 ml BPEL media. Schud buis goed te mengen. Terzijde leggen terwijl andere media componenten worden geassembleerd.
- Voeg alle overige media componenten naar boven van 250 ml Stericup filtratie-eenheid. Voeg de vereiste balans van IMDM en F-12 volumes (elk 66 ml), BSA, een-MTG, 100X ITS, Glutamax I, Pen / Strep, Protein-free hybridoma mengsel II en ascorbinezuur. Voeg de PVA-lipiden mengsel uit stap 1 aan de top van de Stericup. Filter de medium. Medium moeten bij 4 ° C stabiel gedurende tenminste 2 weken. Gebruik oude medium voor wasstappen.
4. Opzetten TrypLE-gepasseerde ES-cellen in Fase I Spin EBs
Gebruik ES / iPS cellen die zijn aangepast om doorgang TrypLE met lagere dichtheid MEF (dwz ES / iPS cellen die zijn gepasseerd met TrypLE minstens 5-7 keer). Indien cellen worden gepasseerd ~ 01:03 en wordt 70-80% confluent 3-4 dagenDe cellen moeten goed gebruiken.
- Twee dagen voordat u Spin EB differentiatie (dag -2): Pass TrypLE aangepaste ES / iPS cellen op vers MEFs bij een dichtheid waardoor ze 70-80% confluent op de dag van differentiatie setup. We passeren meestal 48 uur voorafgaand aan EB setup Spin.
- Dag van Spin EB Setup in Fase I Differentiatie (dag 0): Ter voorbereiding van Spin EB plating, pipet 150 pi steriel water in de 36 buitenste wells van elke 96-well plaat om verdamping te minimaliseren. Gebruik alleen ronde bodem, lage gehechtheid platen met 96 putjes.
- Aspireren voedingsbodems off van ES / iPS cellen en voeg 1,0 ml voorverwarmde TrypLE Selecteer aan elk putje.
- Plaats platen in incubator (37 ° C) gedurende 5 minuten. Voorzichtig pipet cellen af van de plaat.
- Verzamel gedissocieerde cellen in een conische buis en pipet op en neer om uiteen te vallen bosjes. Verdun TrypLE met 1 gelijk volume BPEL media en tenminste 1 gelijk volume DPBS.
- Verwijder supernatant en resuspendeer decellen in 5 ml BPEL media plus 5 ml DPBS. Herhaal draai.
- Verwijder supernatant en resuspendeer cellen 5-10 ml BPEL media, afhankelijk van het verwachte aantal cellen. Passeren cellen door 70 urn filter (BD Falcon # 352350) in een frisse 50 ml conische om klonten (die kunnen interfereren met EB vorming) te verwijderen.
- Tel gefilterde cellen. Aliquot cellen, bestemd voor plateren in een 50 ml conische en spin. Voor plating: 3000 ES cellen / well, 60 wells / plaat = 1.8x10 5 ES-cellen / plaat.
- Na het centrifugeren, zal cellen moeten worden gesuspendeerd tot 3x10 4 cellen / ml (100 ul volume / goed, 3000 ES cellen / well).
- Bereid een volume van BPEL media + cytokines voldoende voor resuspenderen van de cellen (dit zal 6 ml / plaat zijn). Voor fase I differentiatie, gebruiken we SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml) en VEGF (20 ng / ml) voor het afleiden van hematopoietische progenitorcellen.
- Plaat 100 ul cellen / well (= 3000 cellen / putje) in elk van de binnenste 60 putjes van de prepared 96-well platen. Dit is het gemakkelijkst bij het gebruik van een multichannel pipet en steriele trog. Zorg ervoor dat cellen mengen door pipetteren alvorens in trog en werkt snel, zodat cellen een kans om zich te vestigen op niet beschikken.
- Draai de 96-well platen in gekoelde centrifuge gedurende 4 minuten bij 1500 rpm ~, 8 ° C.
- Overdracht zorgvuldig platen van centrifuge tot 37 ° C incubator. Vermijd zoveel mogelijk verstoren van de platen. Controleer platen om ervoor te zorgen dat de cellen gevormde uniform pellets op de bodem van de putjes.
- Fase I spinnen EBS mag niet worden gevoerd of anderszins verstoord door de dagen 3-4 differentiatie totdat de EBS hebben gevormd een meer duurzame buitenlaag. Als EBS zal worden achtergelaten in stadium I daarbuiten 10-12 dagen, we soms voeden EBs met 50 ui verse BPEL media met cytokinen aan elk putje (schakel eerst 50 ul van oude media uit elk putje). Binnen 24 uur moet de cellen beginnen met een 3-D structuur te vormen EB, en dag 3-5 een afzonderlijke buitenste laag te hebben, en start ontwikkeling van cystische structuren.
5. Dissociëren Fase I EBs voor FACS-analyse
Verzamel around18-36 spin-EB voor FACS-analyse. Als de analyse van cellen voor dag 6, zijn meer bronnen nodig zijn om voldoende cel aantallen te verkrijgen.
- Bereid noodzakelijke volume van trypsine met 2% kip serum. Doe in 37 ° C waterbad tot gebruik.
- Overdracht rotatie EBS en media van 96-well platen 15 ml conische buizen.
- Laat EBS te vestigen naar onderkant van conische buizen. Met een 5 ml pipet, voorzichtig pipet uit de supernatant en transfer naar een aparte buis (u kunt het zwembad al het bovenstaande in een 15 ml of 50 ml conische buis). Zoals sommige hematopoietische cellen zijn al vrijgegeven, de spin EB tussen dag 9 en 11 scheiden van de supernatant die deze cellen voorkomt overmatige trypsine.
- Hersuspenderen EBS in trypsine + 2% kippenserum: 3-4 ml aan elke 15 ml conische buis. Plaats EBS met trypsine in 37 ° C waterbath voor 3-7 minuten. Schudden of voorzichtig vortex elke 1-2 minuten. Bij eerdere tijdstippen (vóór dag 8), EBS uit elkaar gemakkelijker breken en kan slechts 3 minuten duren. Op latere tijdstippen (dag 8 +) de EBS kan langer duren om te distantiëren. We meestal laat ze niet trypsinize voor meer dan 5 minuten bij 37 ° C. Let op, dit keer zijn slechts een leidraad. Voor een bepaalde cellijn of EB differentiatie, kan het meer of minder tijd in beslag nemen om de EBS dissociëren. Nauwlettend toezien op de dissociatie. Belangrijk cellen niet verlaten trypsine te lang. Het is beter om de trypsine dissociatie wanneer slechts een paar kleine klontjes zichtbaar blijven in plaats van te proberen om alle bosjes weg te stoppen.
- Quench trypsine met tenminste 1 gelijk volume FBS bevattende media. Spin down cellen (1500 rpm, 5 min, 8 ° C).
- Resuspendeer cellen in een geschikt volume medium voor het tellen (meestal 3-5 ml).
- Filtercellen door een 100 um cel zeef. Verwijder een monster van cellen te tellen. Doorgaan met cellenom standaardpracticum FACS protocollen.
6. Ontwikkeling, uitbreiding, en karakterisering van de NK-cellen uit HPSC-afgeleide progenitorcellen
Omdat de rotatie EBS bevatten een hoog percentage van hematopoietische progenitorcellen, kunnen zij direct worden overgebracht naar NK celkweek op dag 11. De spin EVSA kan worden overgedragen aan 24 well platen met of zonder feeders. We hebben aangetoond dat er geen verschil in fenotype of functie tussen NK cellen afkomstig in elke conditie. Daarom, wij over het algemeen over te dragen aan culturen zonder feeders om een volledig gedefinieerde systeem voor NK-cel ontwikkeling te hebben. Bij gebruik van een hESC / IPSC lijn met suboptimale hematopoietische differentiatie van het gebruik van feeder lagen wordt aanbevolen 7,8.
- Met behulp van een multichannel pipet ingesteld op 100 ul, overdracht 6 draai EBS aan elk putje van een 24 wells plaat.
- Met Feeders: overdracht draai EBS tot 24-well platen met 100.000 bestraalde (3000 cGY) EL08-1D2 (een muizen embryonic lever cellijn) cellen per putje. Zonder feeders: overdracht EBS direct naar ongecoat, 24 well platen.
- Voeg 400 ul NK differentiatie medium met cytokinen (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, allen van Peprotech) zodat het totale volume in elk putje is ~ 1 ml.
- Plaats cellen in de broedstoof en voeden elke 5-7 dagen met NK differentiatie media met alle cytokines in stap 6.3, behalve IL-3.
- NK-cellen zal een volwassen fenotype uitdrukken op dag 28 na de overdracht naar NK celdifferentiatie cultuur (Figuur 2).
- NK-cel cytotoxiciteit testen, kan een 4 hr chromium afgifte assay uitgevoerd 8.
- Bij grote aantallen cellen zijn nodig voor in vivo studies, kunnen co-cultuur met kunstmatige antigeenpresenterende cellen (aAPCs) a 2-log of grotere expansie opleveren. Voor een gedetailleerd protocol, bezoek http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.
7. In vivo TL en Bioluminescent Imaging naar hESC-afgeleide NK cellen en tumorcellen Monitor in Immunodeficiënte Muizen
We gebruiken obese diabetische / ernstige gecombineerde immunodeficiëntie met gamma-keten knockout (NOD / SCID / γC - / -) muizen die 6 tot 8 weken oud in al onze experimenten. We maken gebruik van een dual imaging model om gelijktijdig te volgen tumorprogressie (turboFP650 verslaggever) en hESC-NK-cellen kinetiek (Fluc verslaggever uitgedrukt in bovenliggende ES-cellen) in vivo. Deze beeldvorming regeling is breed toepasbaar op andere dan de anti-tumor model hier getoonde systemen. De IVIS Spectrum (Remklauw Life Sciences) is optimaal voor simultane fluorescentie en bioluminescentie in vivo beeldvorming.
- 24 uur vóór tumorcelinjectie, irradiate muizen (225-250 cGY).
- Resuspendeer gewenste aantaltumorcellen (1 x 10 6 K562 cellen zijn getoond) in 200 pl Iscove gemodificeerde Dulbecco medium (IMDM), aangevuld met 20% FBS. Tumorcel dosering kan worden gevarieerd afhankelijk van het gebruikte model. TurboFP650 kan ook worden uitgedrukt in niet-tumor types. Het is best afgebeeld met cellen gelokaliseerd op een enkele anatomische locatie.
- Injecteer tumorcellen subcutaan in de linker thorax van de muizen met een 27 of 28 gauge naald en laat inenten voor 4 dagen. De cellen moeten een bel vormen onder de huid van de muis. Muizen kunnen worden geschoren in dit gedeelte van het lichaam injectie beter te visualiseren. Het stelt ook het gebied voor betere in vivo fluorescentie beeldvorming. Injectie in de thorax van de muizen werd in dit model omdat het ip geïnjecteerd NK cellen best weergegeven terwijl de muis op de rug ligt. Alternatieve methoden van subcutane toedieningsvorm, waaronder de rug of flank, zijn minder belastend voor het dier en moet worden beschouwd.
- Resuspendeer het gewenste aantal hESC-derived NK-cellen (10 x 10 6 NK-cellen zijn getoond) in 300 pl Iscove gemodificeerde Dulbecco medium (IMDM), aangevuld met 20% FBS zonder antibiotica.
- Injecteren hESC-afgeleide NK-cellen in elke muis intraperitoneaal (IP) met behulp van een 27 of 28 gauge naald. Voor alle experimenten bevatten muizen die geen tumor of infusie NK cel als negatieve controle.
- NK celpopulaties in vivo behouden, geef muizen een 250 ul IP injectie van IL-2 (1x10 4 U / muis) en IL-15 (10 ng / muis) in steriele DPBS elke dag gedurende de eerste 7 dagen, gevolgd door IL- 2 slechts om de 2 tot 3 dagen tot de tijd van offeren.
- Monitor innesteling van hESC-afgeleide NK-cellen door bioluminescentie beeldvorming. Injecteer elke muis IP met 120 ul D-luciferine (150 mg / kg). Beeld de muizen 10 minuten na D-luciferine injectie.
- Verdoven muizen met behulp van een kamer waardoor isofluraan binnenkomst in het vak op 0,8 l / min. Zorg ervoor dat er ook zuurstof in de kamer.
- Plaats verdoofdmuizen in IVIS Spectrum en veilige muizen op hun rug met tape of klittenband en laten isofluraan binnenkomst in het vak bij 0,5 l / min tot anesthesie te onderhouden.
- Stel IVIS machine imaging platform corrigeren (D 4-5 muizen, C voor 3 of minder muizen), ingesteld binning tot medium, f / stop naar 1 en afbeelding te verkrijgen gedurende 1 minuut.
- Om fluorescerende beeldvorming voor turboFP650 + cellen uit te voeren, gebruikt u de imaging wizard voor het instellen van een emissie-scan meet de sonde van belang, alsmede als achtergrond signaal. Uit de lijst van de sondes kiezen Input Em / Ex, en voer in de juiste excitatie en emissie. Voor turboFP650, gebruikt 605 excitatie en 660-720 emissie naar tumor-signaal en 570 excitatie en 640-720 emissie naar achtergrond signaal te meten. Gebruik automatische belichtingsinstellingen en selecteer de gewenste imaging platform. De gehele beeldvormingssequentie zal meestal 3-5 min. te verwerven.
- Laat muizen om volledig te herstellen van anesthesie voorafgaand aan het transport van het imaging systeem. Analyseren van beelden met behulp van de LiVing Beeld softwarepakket versie 4.2 (Remklauw Life Sciences).
- Kwantificeren lichtgevende signaal met behulp van een regio van belang (ROI) ingesteld op de totale flux (fotonen / sec) of de gemiddelde straling (fotonen / sec / cm 2 / sr) en zet alle afbeeldingen op dezelfde schaal (figuur 3). Hier, worden representatieve beelden worden gebruikt om zowel celpopulaties in elke muis (figuur 3) tonen. Andere studies uit ons lab hebben aangetoond colocalization met deze techniek 20. Colocalisatie timing zal moeten worden geoptimaliseerd op basis van het experimentele model gebruikt.
- Om fluorescent signaal kwantificeren van de emissie scanreeks gebruik maken van de "Spectral unmixing"-functie in Living Beeld. Selecteer de afbeeldingen om in de analyse en teken een masker over het gebied van de muis met het signaal van belang, in dit geval de bovenste thorax. Selecteer weefsel autofluorescense en onbekende sonde te onvermengd. Als muizen worden gegeven voedsel met alfalfa, voedsel kan het signaal ook unmixed van de sonde van interesse en weefsel autofluorescentie.
- Als de beelden niet een gelijkmatige verdeling van weefsel autofluorescentie (inclusief het gebied waar het signaal zich bevindt) vertonen beperkingen worden ingesteld op consistentere en betere scheiding van de componenten die onvermengd krijgen. Dit is typisch en vaak noodzakelijk om probes die niet in de software en als specifiek signaal laag is, of bijna achtergrondsignaal. Stel een high-pass filter, vinden onder de tab-update, voor 640 nm, wat overeenkomt met het onderste uiteinde van de emissie-curve voor turboFP650. Een laagdoorlaatfilter constraint kan ook worden ingesteld, maar het niet nodig voor de beeldvorming analyse hier was.
- Kwantificeren fluorescerend signaal van de ongemengde beeld met behulp van een regio van belang (ROI) ingesteld op stralende efficiëntie (fotonen / sec / cm 2 / sr) / μW) en zet alle afbeeldingen op dezelfde schaal (figuur 3).
- Op een gewenst tijdstip, kunnen muizen worden opgeofferd en geanalyseerd engraftment van hESC-afgeleide cellen door flowcytometrie. Voor intraperitoneaal NK cellen we doorgaans analyseren perifeer bloed (gezicht ader bleed), milt en peritoneum. Peritoneale wassingen worden uitgevoerd door het blootstellen alleen de peritoneale membraan en die een mediale incisie net breed genoeg om een glazen Pasteur pipet om de peritoneale holte. Met steriele PBS, voeren enkele wasbeurten van de buikholte en zorg ervoor om de oplossing goed te mengen door het draaien van de muis. Verzamel genoeg vocht tot je een zichtbare pellet volgende centrifugeren (gewoonlijk 5-10 ml van het wasgoed).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De generatie van hematopoietische stamcellen met behulp van de spin EB aanpak zorgt voor een optimale NK cel ontwikkeling van hESCs en iPSCs. Zoals in figuur 2, de 11e rotatie EBS bevatten hoge percentages progenitor cellen die CD34, CD45, CD43 en CD31. Hoge niveaus van CD34 en CD45 maakt directe overdracht naar NK omstandigheden zonder noodzaak voor het sorteren of ondersteunende stromale cellen. Als er optimaal rotatie EB differentiatie, wordt aanbevolen dat stromale cellen zoals EL08-1D2 worden in de secundaire NK voorwaarden. Na 4 weken van de cultuur van de spin EBS aanleiding geven tot grote aantallen NK-cellen (ongeveer 1-2 x 10 6 cellen per putje van een 24-wells plaat). Culturen kan ook worden gefenotypeerd op eerdere tijdstippen aan de geleidelijke progressie van NK-cel ontwikkeling te zien in dit systeem 7. NK-cellen behouden de expressie van de reporter genen die werden gewijzigd in het moederbedrijf ES / iPS lijn en daarom kan dan worden gevolgd
Figuur 1. Dual imaging regeling en ontwikkelingsstoornissen tijdlijn. A) Schematische voorstelling van in vivo model. Muizen worden geïnjecteerd IP met luciferine, en volgen van de juiste incubatietijd worden vuurvliegluciferase + cellen afgebeeld voor lichtgevende signaal. Na de overname van de lichtgevende afbeelding, fluorescent signaal van TurboFP650 + cellen kunnen worden afgebeeld. B) Tijdlijn voor het ontwikkelen en testen van hESC-derived. NK-cellen.
Figuur 2. Fenotype van spin EBs en NK-cellen afkomstig van hESCs en iPSCs. A) Na 11 dagen kweek in spin EB kunnen cellen worden geanalyseerd door flow cytometrie. De dag 11 tijdstip geeft hoge percentages van CD34, CD43, CD45 en CD31 tot expressie brengen optimaal voor NK-cel differentiatie. B) NK-cellen kunnen worden gedetecteerd met behulp van flowcytometrie na 4 weken van NK celkweek. Cellen in de lymfocytpoort (FSC / SSC plot) worden geanalyseerd op de expressie van CD56. CD56 + cellen kunnen verder worden geanalyseerd voor co-expressie van merkers zoals CD117, CD94, NKp46 of anderen. hier grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. TL-en bioluminescentie beeldvorming in vivo met behulp van de IVIS Spectrum. In vivo controle is het primaire doel van dit protocol. Daarom zijn muizen niet uit gevolgd voor tumor klaring. De verslag (met 200.000 K562 cellen) toont aan dat tumor speling optreedt bij drie weken 7. A) Bioluminescent beeldvorming van Fluc + hESC-afgeleide NK-cellen op dag 0, 7 en 14 na NK cel injectie in de bovenste rij. Fluorescente beeldvorming van TurboFP650 + K562 cellen op dag 0, 7 en 14 na injectie NK-cel in de onderste rij. Fluorescerende beelden werden onmiddellijk verworven na bioluminescentie beeldopname. B) Sequence tonen weefsel autofluorescentie en fluorescerend signaal van turboFP650 +-cellen, gegenereerd met behulp van de spectrale unmixing functie in Living Image software. De muis op de uiterst links in elk beeld is een non-injectie controle en toont alleen de achtergrond signaal. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hESCs zijn een ideaal platform om verschillende celtypes te bestuderen en te houden opmerkelijke potentieel voor klinische vertaling. We maken gebruik van een gedefinieerde, draai EB benadering van hESC / iPSCs differentiëren naar hematopoietische stamcellen. De spin EB aanpak consistente afleiding van hematopoietische stamcellen en differentiatie naar NK-cellen opgeleverd, maar toch, variatie bestaat nog steeds in differentiatie efficiëntie in cellijnen en moet mogelijk worden aangepast voor het genereren van andere hematopoietische cellijnen. Hoewel vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen in andere afleiding EB stromale kweekmethoden is dit systeem serumvrij en vertegenwoordigt een gedefinieerde benadering voor het produceren van hematopoëtische voorlopers vergelijking met andere methoden. We hebben ook een efficiënte gestandaardiseerde afleiding van NK cellen uit deze hematopoietische voorlopers in een soortgelijke voedingsvrije wijze die een grote zorg voor klinische toepassing overwint. Het biedt ook een bepaald systeem om NK-cel ONTWIKKELI studerent in vitro. Uitgebreide pre-klinische in vivo karakterisering van hematopoietische cellen, zoals NK-cellen, is ook nodig om specifiek deze experimenteel bepaald celtypes en de uitvoering ervan voor klinische trials.
Vooruitgang in beeldvorming en microscopie technieken hebben op lange termijn en niet-invasieve in vivo monitoring van cellen die bioluminescente en fluorescerende reporters 15-17,19,21 ingeschakeld. Het meest opvallend is het gebruik van de vuurvlieg luciferase construct dat werd gebruikt om diverse celtypen visualiseren sinds de eerste karakterisering. Dit is een ideale reporter voor in vivo beeldvorming, maar is beperkt tot slechts bewaken van een celpopulatie. Het grootste voordeel van een dual-reporter systeem is de mogelijkheid om de interactie tussen twee verschillende celpopulaties volgen. Er zijn echter weinig verslaggevers ontwikkeld die zowel gemakkelijk te afbeelding in vivo en voldoende en kwantificeerbaar signaal bovenachtergrond.
TurboFP650, het fluorescerend eiwit gebruikt in onze dual-imaging systeem, is ver-rood verschoven, welk signaal onderscheiden van achtergrond autofluorescence geeft. Echter, het gebruik van spectrale unmixing methoden in Living Image software (Remklauw Life Sciences) was nodig om het signaal naar de achtergrond verhouding in ons systeem te maximaliseren. Er zijn vele mogelijkheden in de Living Beeld software in staat om te helpen met de intrinsieke uitdagingen van fluorescerend eiwit beeldvorming. Toch signaal penetrantie blijft een uitdaging. Het systeem heeft verder optimalisatie voor beeldvorming van kleine celpopulaties of beeldvorming van gedispergeerde cellen, zoals het geval zou zijn wanneer de tumorcellen werden IP geïnjecteerd. Echter, de consistentie en het gemak van fluorescerende beeldvorming maakt het gebruik ervan een ideaal platform om te gebruiken in een dual imaging model. De dieren onder narcose minder tijd en er is geen noodzaak om een tweede substraat leveren zoals bij de meeste dual-luciferase systemen.
Deze methodevan afleiding, expansie, en dual-imaging in vivo biedt een consistente benadering voor het produceren van hESC-afgeleide of IPSC-afgeleide NK-cellen en hun evaluatie, die nodig zijn om de huidige NK cel adoptie therapieën te verbeteren is. De dubbele TL-en bioluminescentie beeldvorming model is breed toepasbaar voor de lange-termijn studie van twee verschillende cellen anders dan anti-tumor model dat we hebben laten zien populaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd ondersteund door NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) en door NIH MSTP subsidie T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology Training Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Undergraduate Research Kansen Programma (UROP) Grant, University of Minnesota (AMB), het Fonds van de Universiteit van Minnesota Cancer Center, en de William L en Blanche Hughes Stichting Leukemie Onderzoek.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Melinda Hexum bedanken voor aanvang van de spin EB-protocol binnen ons lab. We zouden graag bedanken voor andere leden van het lab, waaronder Laura E. Bendzick, Michael Lepley en Zhenya Ni voor hun technische ondersteuning bij dit werk. De auteurs willen ook Brad Taylor danken aan de Beugel Life Sciences voor zijn deskundig technisch advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercapt–thanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R & D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells |  MD Anderson, Houston, TX |
contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section | |
Materials Table. |
|||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al.
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S.
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
