Summary
Этот протокол описывает развитие, расширение, а в естественных изображений NK клетки, полученные из ЭСК и ИПСК.
Abstract
Мы представляем метод для получения естественных киллеров (NK) клетки из недифференцированных ЭСК и ИПСК с помощью кормушки-свободный подход. Этот способ приводит к высокому уровню НК-клеток после 4 недель и культуры могут пройти дальше 2-журнала расширения с искусственным антигенпрезентирующих клетках. ЭСК и ИПСК полученных НК-клеток разработаны в этой системе есть зрелая фенотипа и функции. Производство большого числа генетически модифицируемых клетки NK применяется как основное механистической, а также противоопухолевые исследований. Экспрессия люциферазы светляков в чЭСК НК-клеток позволяет неинвазивным подходом следовать НК приживления ячейки, распределение и функции. Мы также описываем двойного изображения схеме, что позволяет отдельным мониторинг двух различных клеточных популяций, чтобы более отчетливо характеризуют их взаимодействия в естественных условиях. Этот способ вывода, расширения и двойного прижизненного изображения обеспечивает надежный подход к производству НК-клеток и их оценAtion которые необходимо улучшить текущую NK клетки приемных терапии.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) недифференцированных плюрипотентных клеток, способных неограниченное самообновлению и мульти-линии дифференциации. ЭСК были успешно дифференцировались в зрелые и функциональные подмножества каждый слой зародышей, включая клетки кроветворной системы 1-3. Природных киллеров (NK) клетки лимфоцитов врожденной иммунной системы, которые могут быть получены из ЭСК путем формирования эмбриональных телец (ЕВ) 4,5 или совместное культивирование с стромальных клеточных линий 1,2,6-8. NK-клетки обладают антивирусной и противоопухолевой возможности и имеют потенциал, чтобы быть эффективным против широкого спектра злокачественных опухолей, так как они не требуют предварительного антигенной стимуляции выполнять свои эффекторные функции. Таким образом, чЭСК NK-клетки являются привлекательными источник клеток для иммунотерапии. Кроме того, при выводе NK клеток из ЭСК обеспечивает генетически поддаются системы для изучения нормального развития <EM> в пробирке.
Потому что они обеспечивают генетически послушный системы, чЭСК НК-клеток может быть экспериментально изменен, чтобы выразить флуоресцентные и биолюминесцентными журналистам обеспечения оптимальной моделью для изучения НК клетки эффекторных функций в пробирке и в естественных условиях. чЭСК НК-клетки обладают активностью против ряда целей, включая ВИЧ 9, лейкоз (К562) и другие типы рака 7,8. Тем не менее, способность эффективно получать достаточно NK-клеток, способных к лечению пациентов остается важным барьером для клинического перевода и, в меньшей степени, ограничение на обширные доклинические в естественных условиях исследования НК развитие клеток и противораковые функции. Здесь мы используем подход спина EB для получения кроветворных предшественников из ЭСК 4,5,10. После 11 дней спина ЭТ передаются НК клеточной культуры с или без питателей течение 28 дней. Через 4 недели в НК среду для культивирования клеток, NK клетки Transferred в совместной культуре с К562 модифицированный выразить мембраной интерлейкина 21 (IL-21), которые служат в качестве искусственного антигенпрезентирующих клетках (aAPCs). Адаптация протокола для расширения периферической крови NK клеток с использованием этих искусственных БТР 11,12, мы можем расширить НК-клеток 2-журналы, сохраняя зрелый фенотип и цитотоксических возможностями.
Этот процесс развития и расширения обеспечивает достаточную чЭСК NK клеток для обширных в естественных характеристик. Для прижизненного исследования, мы имеем возможность неинвазивного мониторинга долгосрочного приживления и кинетики впрыском люциферазы светляков, выражающие (Fluc +), чЭСК NK клеток с использованием биолюминесценции изображений. Кроме того, мы в состоянии следовать НК взаимодействия клетки с клетками опухоли используя двойной, биолюминесцентными или флуоресцентные изображения схемы. В более раннем исследовании нашей группы использовали биолюминесценции изображений в противоопухолевой примером для подражания прогрессирования опухоли и НКУArance из Fluc К562 + клеток в живом 7. Теперь, на основе технического наших ЭСК, чтобы выразить люциферазы светляков 13,14 мы можем следовать биораспределении и торговли НК-клеток К562 опухолевые клетки, которые выражают в последнее время характеризуется флуоресцентный белок, turboFP650 15. Мы выбрали это двойная система репортера, чтобы одновременно следить за две клеточные популяции в естественных условиях (рис. 1). Наиболее модели с двумя изображениями были двойного люциферазы системы, но эти системы могут быть технически сложной задачей из-за требования к поставке коэлентеразина, подложка необходим для экспрессии наиболее Renilla и Gaussia люциферазы репортеров 16-18. Флуоресцентные журналистам позволили легкий контроль многих клеточных линий и конструкций в лабораторных условиях, но имел ограниченный успех в естественных изображений из-за перекрытия между тканью и мехом флуоресценции и спектры излучения многих сотрудничестваmmonly использовали флуоресцентные журналистам в том числе GFP, DsRed и TdTomato 15,19. Это беспокойство способствовал освоению дальнего красного флуоресцентного белка, которые позволяют лучше пенетрантности ткани и более высокой удельной сигнала по сравнению с фоном 15,19. TurboFP650, флуоресцентный белок показано в этой системе, далеко-красные изменилось, и преодолевает многие вопросы, связанные с изображениями флуоресцентных белков в живых животных.
Этот метод для развития и расширения NK клетки, полученные из ЭСК позволила нам для дальнейшей характеризации чЭСК НК-клеток в пробирке и в естественных, которая необходима, чтобы лучше понять функции NK клеток и клинически значимое улучшение текущей клетки NK приемных терапии. Это также поддаются вывода и расширения ИПСК полученных НК-клеток. Двойной флуоресцентный и биолюминесцентного изображения схема может широко применяться в системах, отличных от противоопухолевой модели мы показали здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Адаптация ЭСК или токов в TrypLE для культур Спин EB
- Начальное диссоциации с TrypLE работает лучше, если ES / плюрипотентных колоний от коллагеназы пассированный культур являются относительно небольшими. Исходным ES / IP населения должны быть клетки не прошло не более 4-5 дней предыдущего. За 4-5 дней до начала TrypLE проезд, пройти ЭС клетки при плотности, которая позволит клеткам ~ 70% сливной в 4 раза дней. Используйте обычные средства массовой информации ES по культуре TrypLE пассированный ЭС клеток. Здесь мы используем ЭСК стабильно модифицированные конструкции репортера люциферазы (Материалы таблицу). Протокол также работает с ИПСК, на обычную ИПСК для сравнения гемопоэтических клеток-предшественников и развитие клетки NK.
- За четыре дня до начала TrypLE проезд, пройти ES / плюрипотентных клеток коллагеназы IV, после нормального протокола проход. Мы обычно проходят 1:01 при первом прохождении с TrypLE. Развернуть ES / плюрипотентных клеток соответственно заранее.
- Тщательно обрывать дифференцированных колонии (те, которые не имеют ограниченного границу или есть фибробластов / эпителиальных характеристик) прежде чем приступить к TrypLE диссоциации. Дифференцированные клетки могут взять на себя культура относительно легко с TrypLE прохождения, поэтому очень важно убедиться, что ваш исходной популяции очень чистое.
- Аспирируйте СМИ из колодцев и добавить 1,0 мл подогретого TrypLE Выберите на лунку.
- Инкубировать ES / плюрипотентных клеток в TrypLE в течение 5 мин при 37 ° C инкубатора. Через 5 минут, осторожно пипеткой ЭС клетки со дна скважины.
- Соберите TrypLE клеточной суспензии из колодцев и перенести в коническую трубку. Внесите вверх и вниз GEntly 2-3 раза, чтобы побудить как сгустки разбиваются на части. Развести TrypLE по крайней мере с равным объемом 1 ES средств массовой информации и равные 1 DPBS объема. TrypLE не гасили культуральной среде, поэтому очень важно, чтобы разбавить TrypLE со средой DPBS и после удаления клеток от пластины. Мы используем DPBS + носители для мытья, чтобы сохранить ES средств массовой информации.
- Спином вниз клетки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин в охлаждаемой центрифуге (8 ° C).
- Аспирируйте от, как большая часть супернатанта, как можно удалить TrypLE.
- Ресуспендируют клеток в 4 мл среды ES Plus 4 DPBS мл и повторить спина, чтобы избавиться от оставшихся следов TrypLE.
- Аспирируйте от супернатант и ресуспендируют в соответствующем объеме ES средств массовой информации для обшивки.
- Пластина ЭС клетки 1:01 (или 2:01, если это необходимо) на низкой плотности MEFs в ES средств массовой информации.
- Через 24 ч клетки кормить свежей средой ES. Там, скорее всего, многие одинокие клетки, которые не придавали. Кормить ЭС клетки ежедневно со средствами массовой информации ES.
- Прошло с TrypLE на свежие MEFs (0,9-1 х 10
- За первые несколько проходов (до проход 5-10), клетки потребует проходящий в 1:01. Это делает расширение клетки трудно. По нашему опыту, эффективность посева из ЭС клеток резко падает около 4-5 проходов, а затем возвращается в рабочий режим в течение нескольких проходов. После проходы 5-7, вы можете начать прохождение клеток при 1:2, и в конечном итоге, 1:3. За прохождение 20, вам может понадобиться, чтобы начать прохождение клеток на 1:05 или 1:06. Убедитесь, что пластина ЭС клеток с высокой плотностью первых 5-10 пассажей. Как только вы дойдете до точки, где клетки тарелку достаточно эффективно, что они могут достигать ~ 70% слияния в течение двух дней после прохождения, вы можете попробовать начать проходить на 1:02, и в конечном счете должны быть в состоянии пройти в 1:3 или 1:4. ИПСК, в частности, если не пассировать достаточно плотно до полногоdapted, как правило, дифференцировать.
2. Подготовка растворов для Настройка культур Спин EB
- 10% раствор БСА в IMDM: приостановить 4 г BSA в 35 мл IMDM (в 50 мл коническую). Разрешить решение постоять при комнатной температуре в течение 1-2 часов, чтобы позволить BSA, чтобы полностью раствориться. Отрегулировать общий объем до 40 мл IMDM, чтобы получить конечную концентрацию 10%. Коммерчески доступные BSA может быть цитотоксическое действие на клетки ES. Деионизации решение может уменьшить вероятность цитотоксичности. Для деионизации, добавить ~ 1,3 г смолы бисера до 40 мл раствора БСА и хорошо встряхните, чтобы перемешать.
- Место BSA решение (с гранулами смолы) при 4 ° С до бисера меняют цвет от сине-зеленого до желтого (указывает, что обменная емкость была исчерпана).
- Встряхнуть раствора каждые 20-30 минут, чтобы облегчить обмен
- Каждый обмен может занять до 2 часов. Когда обмен завершается, центрифугируют раствор в течение 2 мин при 1000 оборотах в минуту для осаждения шариков в нижней части трубки.
- ПипЕтт раствора БСА в свежем 50 мл конические, в результате чего шарики должны быть отброшены.
- Повторите шаги 2.2-2.5 по крайней мере еще дважды, в общей сложности три или более обменов. В течение последних обмена, емкость шариков не может быть полностью исчерпан даже после двух часов инкубации с шариками.
- Стерильный фильтр решение БСА и удалите оставшуюся бисером.
- Раствор BSA должен быть стабильным при 4 ° С в течение не менее 2 месяцев.
- 5% раствора поливинилового спирта: Измерение 100 мл Millipore H 2 O в 125 мл стеклянная бутылка.
- Добавить 5 г ПВА с водой. Важно, чтобы добавить PVA в воде так, чтобы ПВА становится полностью "мокрого". Если вы добавляете воду, чтобы ПВА, это займет очень много времени для ПВА переходят в раствор.
- ПВА не растворяются немедленно. Место поливинилового спирта / воды при 4 ° С в течение ночи.
- На следующее утро, место PVA / воды в 37 ° С водяной бане в течение 4-8 часов. PVA должна быть в основном в раствор к концуинкубации.
- Место не бутылку обратно в 4 ° С в течение еще 24-48 ч, или до полного растворения. Решение может быть немного вязким.
- PVA растворы должны быть стабильными при 4 ° С в течение по крайней мере 6 недель.
- Линолевой и линоленовой кислот (10000 X решений): развести до 1 мг / мл в 200-этанол пробы. Добавьте 10 мл чистого масла в 10 мл этанола. Алиготе и хранить при температуре -20 ° С.
- α-MTG раствора: Развести 13 мкл α-MTG в 1 мл IMDM.
- Аскорбиновая кислота 2-фосфатом раствор (100X): сделать 5 мг / мл раствора. 250 мг аскорбиновой кислоты 2-фосфат в 50 мл стерильного, культуры ткани класса H 2 O. Легко растворяется.
3. Собрание BPEL носителя (~ 200 мл общего объема)
- Сделайте PVA-смесь липидов (этот шаг предотвращает PVA от образования нерастворимых капель в среду, что бы получить отфильтровываются).
- Добавьте 20 мл IMDM и 20 мл F-12 питательную смесь до 50мл коническую трубку.
- Добавить 10 мл 5%-PVA акции, 0,4 мл synthechol, 20 мкл-линоленовой кислоты, и 20 мкл линолевой кислоты на 200 мл BPEL СМИ. Встряхнуть трубки хорошо перемешать. Отложите в то время как другие компоненты средств массовой информации собрались.
- Добавить все остальные компоненты средств массовой информации к началу 250 мл блок фильтрации Stericup. Добавить баланс необходимых IMDM и F-12 томах (66 мл каждый), BSA,-MTG, 100X ЕЕ, Glutamax I, пенициллина / стрептомицина, Безбелковые гибридома смесь II и аскорбиновую кислоту. Добавить PVA-липиды смеси со стадии 1 в верхней части Stericup. Фильтр среды. Средний должно быть стабильным при 4 ° С в течение не менее 2 недель. Использование старой среды для промывания.
4. Настройка TrypLE пассированный ЭС клеток в I этап Спин ЭТ
Используйте ES / плюрипотентных клеток, которые были адаптированы к TrypLE перехода на меньшей плотности MEFs (т.е. ES / плюрипотентных клеток, которые были пассировать с TrypLE не менее 5-7 раз). Если клетки могут быть переданы в ~ 1:03 и стать 70-80% сливной через 3-4 дня, Клетки должны быть хорошо использовать.
- За два дня до создания Спин EB дифференциации (день -2): Передайте TrypLE адаптированных ES / плюрипотентных клеток на свежие MEFs при плотности позволяет им быть 70-80% сливной в день дифференциацию установки. Как правило, мы пройти 48 часа до момента реорганизации EB установки.
- День Спин EB установки в стадии I дифференциации (день 0): Для подготовки к Спин покрытие EB, пипетки 150 мкл стерильной воды в 36 внешней скважин каждого 96-луночный планшет для минимизации испарения. Используйте с круглым дном, низкой привязанности 96-луночные планшеты только.
- Аспирируйте культуральной среде офф ES / плюрипотентных клеток и добавляют 1,0 мл предварительно нагретого TrypLE Выберите в каждую лунку.
- Место пластин в инкубаторе (37 ° С) в течение 5 мин. Аккуратно пипетки клетки от пластины.
- Сбора разложенных клеток в коническую трубку и пипетку вверх и вниз, разбиваются на части скопления. Развести 1 TrypLE с равным объемом BPEL СМИ и не менее 1 DPBS равной громкости.
- Удалите супернатант и ресуспендируютклеток в 5 мл BPEL Media Plus 5 мл DPBS. Повторите спина.
- Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 5-10 мл BPEL средствах массовой информации, в зависимости от ожидаемого количества клеток. Проход клеток через 70 мкм фильтр (BD Фалькон # 352350) в свежем 50 мл коническую для того, чтобы удалить сгустки (которые могут мешать формирование ИС).
- Граф отфильтрованных ячеек. Аликвотные клетки, которые будут использоваться для покрытия в 50 мл коническую и спина. Для покрытия: 3000 ЭС клеток / лунку, 60 скважин / пластина = 1.8x10 5 клеток ES / пластины.
- После центрифугирования клетки должны быть повторно суспендируют до 3х10 4 клеток / мл (100 мкл / лунку, 3000 ЭС клеток / лунку).
- Подготовить объем BPEL СМИ + цитокинов достаточно для ресуспендирования клеток (это будет 6 мл / пластина). На этапе I дифференциации, мы используем SCF (40 нг / мл), BMP4 (20 нг / мл) и VEGF (20 нг / мл) для вывода гемопоэтических клеток-предшественников.
- Пластина 100 мкл клеток / лунку (= 3000 клеток / лунку) в каждой из внутренних 60 скважин подгоиздание 96-луночных планшетах. Это легче при использовании многоканальных дозаторов и стерильные корыто. Необходимо тщательно смешать клетки с помощью пипетки, прежде чем положить в корыто и работать быстро, так что клетки не имеют шансов для исправления проблемы.
- Спин 96-луночных планшетах в охлаждаемой центрифуге в течение 4 мин при температуре ~ 1500 оборотов в минуту, 8 ° C.
- Тщательно передачи пластин от центрифуги к 37 ° C инкубатора. Избежать нарушения пластин в максимально возможной степени. Проверьте пластины, чтобы убедиться, что клетки формируется равномерный гранул в нижней части скважины.
- I этап спина ЭТ, не должны подаваться или иным образом нарушенных через 3-4 дней, пока дифференциации ЭТ не сформировали более прочным внешним слоем. Если ЭТ останется в этапе я за 10-12 дней, мы иногда кормить ЭТ с 50 мкл свежей среды BPEL с цитокинами в каждую лунку (первый вывезти 50 мкл старые средства массовой информации из каждой лунки). В течение 24 часов, клетки должны начать с образованием 3-D EB структуры, а также на 3-5 день должен иметь отличную наружного слоя, и начинают развивприпрыжку кистозные структуры.
5. ДИССОЦИИРУЮЩЕГО I этап ЭТ для анализа FACS
Сбор around18-36 EB спина для анализа FACS. Если в результате анализа клеток перед 6-й день, более скважин, необходимых для получения достаточного количества клеток.
- Подготовьте необходимый объем трипсина с 2% куриной сыворотки. Место в 37 ° С в водяной бане до использования.
- Передача спин ЭТ и средств массовой информации из 96-луночных планшетах в 15 мл конические пробирки.
- Разрешить ЭТ оседают на нижней части конических труб. С 5 мл пипетки, пипетки из тщательно супернатант и передачи в отдельную пробирку (вы можете объединить все в одну супернатант 15 мл или 50 мл коническую трубку). В некоторых гемопоэтических клеток уже были освобождены от спин EB дней между 9 и 11, отделение надосадочной жидкости, содержащие эти клетки предотвращает чрезмерное трипсином.
- Ресуспендируйте ЭТ в трипсин + 2% куриной сыворотки: 3-4 мл на каждые 15 мл коническую трубку. Наведите ЭТ трипсином в 37 ° C водоснаrbath в течение 3-7 мин. Встряхнуть или слегка вихрь каждые 1-2 мин. На более ранних временных точках (до 8-й день), ЭТ развалится большей готовностью и может занять всего лишь 3 мин. В более поздние временные периоды (день 8 +) ЭТ может занять больше времени для диссоциации. Мы обычно не позволяйте им Trypsinize более 5 мин при 37 ° C. Обратите внимание, что эти времена являются только руководство. Для любого конкретного клеточной линии или EB дифференциации, это может занять больше или меньше времени для диссоциации EB. Внимательно следить за диссоциации. Важно не оставить клеток в трипсин слишком долго. Лучше остановить трипсина диссоциации, когда лишь несколько небольших скоплений остаются видимыми, а не пытаться устранить все сгустки.
- Гасят трипсин, по крайней мере один равным объемом FBS-содержащей среде. Спином вниз клетки (1500 оборотов в минуту, 5 мин, 8 ° C).
- Ресуспендируют клеток в соответствующем объеме среды для подсчета (обычно 3-5 мл).
- Фильтр клеток через клеточный фильтр 100 мкм. Удалить аликвоту клеток для подсчета. Продолжать с клеткамик стандартной лаборатории FACS протоколов.
6. Развитие, расширение, и характеристика натуральных киллеров у HPSC полученных клеток-предшественников
Поскольку спин ЭТ содержат высокий процент гемопоэтических клеток-предшественников, они могут быть непосредственно передан НК культуре клеток на 11 день. Спин ЭТ может быть передана 24-луночные планшеты с или без фидеров. Мы не показали никакой разницы в фенотип или функцию между NK клеток, полученных в каждом состоянии. Таким образом, мы, как правило передать культур без питателей иметь полностью определяется системой для развития клетки NK. При использовании ЭСК / ИПСК соответствие с оптимальной дифференциации кроветворных использование фидера слои рекомендуется 7,8.
- С помощью многоканальной пипетки установлен на 100 мкл, передача 6 спин ЭТ в каждую лунку 24-луночного планшета.
- С питатели: передача спин ЭТ в 24-луночные планшеты, содержащие 100 000 облученных (3000 сГр) EL08-1D2 (мышиное embryoniС линии клеток печени) клеток на лунку. Без подачи: передача ЭТ непосредственно без покрытия, 24-луночные планшеты.
- Добавить 400 мкл среды NK дифференциации содержащей цитокины (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, все из Peprotech), так что общий объем в каждой лунке ~ 1 мл.
- Место клеток в инкубаторе и кормить каждые 5-7 дней с НК СМИ дифференциации, содержащий все цитокинов в шаге 6.3, за исключением IL-3.
- НК-клеток выразят зрелого фенотипа на 28 день после перевода в Нагорный Карабах культуре дифференцировки клеток (рис. 2).
- Чтобы проверить NK клеточную цитотоксичность, 4 ч хрома анализе высвобождения могут быть выполнены 8.
- Если большое количество клеток, необходимых для в естественных условиях исследования, совместное культивирование с искусственным антигенпрезентирующих клетках (aAPCs) может дать 2-журнала или большего расширения. Для подробного протокола, посетите http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.
7. В естественных условиях и Биолюминесцентный Флуоресцентные изображения на монитор чЭСК NK-клетки и опухолевых клеток в иммунодефицитных мышей
Мы используем не страдающих ожирением диабетических / тяжелый комбинированный иммунодефицит с гамма-цепи нокаутом (NOD / SCID / γC - / -) мышей, от 6 до 8 недель во всех наших экспериментах. Мы используем модель с двумя изображениями одновременно отслеживать прогрессирование опухоли (turboFP650 репортер) и ЭСК-НК клетки кинетики (Fluc репортер экспрессируется в клетках родителей ES) в естественных условиях. Это изображение схемы широко применима к системам, кроме противоопухолевого качестве примера здесь. Спектр IVIS (суппорт Life Sciences) является оптимальным для одновременного люминесцентные и биолюминесцентными в естественных изображений.
- 24 ч до инъекции опухолевых клеток, облучают мышей (225-250 сГр).
- Ресуспендируют желаемое количествоопухолевых клеток (1 × 10 6 клеток К562 показаны) в 200 мкл Исков модифицированный Дульбекко среде (IMDM) с добавлением 20% FBS. Опухолевые клетки доза может варьироваться в зависимости от используемой модели. TurboFP650 также может быть выражено в неопухолевые типов. Лучше всего, полученную с использованием клетки, локализованные в одной анатомической локализации.
- Введите опухолевых клеток подкожно в левый верхний грудной клетки мышей с использованием 27 или 28 иглы и позволяют привить течение 4 дней. Клетки должны сформировать пузырь под кожу мыши. Мыши могут быть бритой в этой части тела для лучшей визуализации инъекции. Он также предоставляет область для лучшего в естественных условиях флуоресцентные изображения. Инъекции вокруг грудной клетки мышей были использованы в этой модели, поскольку вводили внутрибрюшинно NK-клетки являются лучшими визуализированы в то время как мыши спине. Альтернативные способы доставки подкожные, в том числе задней или фланг, менее стрессовой для животного и должны быть рассмотрены.
- Ресуспендируют желаемое количество чЭСК Деривед клетки NK (10 х 10 6 NK-клетки показано) в 300 мкл Исков модифицированный Дульбекко среде (IMDM), дополненной 20% FBS, без антибиотиков.
- Введите чЭСК НК-клеток в каждой мыши внутрибрюшинно (IP) с использованием 27 или 28 иглы. Во всех опытах включают мышей, не получавших опухоли или NK-клетки инфузии в качестве отрицательного контроля.
- Для поддержания популяции клеток NK в живом организме, дать мышам 250 мкл IP инъекции IL-2 (1x10 4 U / мышь) и Ил-15 (10 нг / мышь) в стерильных DPBS каждый день в течение первых 7 дней, после чего Ил- 2 только каждые 2 до 3 дней до времени жертвы.
- Монитор приживление чЭСК NK клеток биолюминесцентными изображений. Введите каждой мыши IP с 120 мкл D-люциферин (150 мг / кг). Изображение мышей через 10 минут после D-люциферином инъекции.
- Обезболить мышей с использованием камеры позволяет изофлурана вступления в поле в 0,8 л / мин. Убедитесь, что имеется также поток кислорода в камеру.
- Поместите под наркозомМышей в IVIS спектра и безопасный мышей на спине с помощью липкой ленты или липучки и позволяют изофлурана вступления в поле в 0,5 л / мин для поддержания анестезии.
- Установить IVIS машины исправить изображений платформы (D в течение 4-5 мышей, С в течение 3 или меньше мышей), установить биннинге к средству, F / стоп на 1 и получить изображение со сканера в течение 1 мин.
- Для выполнения флуоресцентные изображения для turboFP650 + клеток, используйте визуализации мастер настройки создания эмиссионного сканирования измерений зонда интерес, а также фонового сигнала. Из списка выберите зонды Входной Em / EX, и введите в правильном возбуждения и эмиссии. Для turboFP650, используйте 605 660-720 возбуждения и излучения для измерения сигнала опухоли и 570 640-720 возбуждения и излучения для измерения фонового сигнала. Используйте настройки автоматической экспозиции и выберите нужное изображение платформы. Вся последовательность изображений обычно занимает 3-5 минут, чтобы приобрести.
- Разрешить мышей, чтобы полностью восстановиться от анестезии перед транспортировкой от системы формирования изображения. Анализ изображений с помощью LiВинг Изображение пакет программного обеспечения версии 4.2 (суппорт Life Sciences).
- Количественно биолюминесцентными сигнала с использованием области интереса (ROI) установлен в общий поток (фотонов / сек) или среднее сияние (фотонов / сек / см 2 / SR) и установить все изображения в одном масштабе (рис. 3). Здесь, представитель изображения используются для демонстрации и клеточных популяций в каждой мыши (рис. 3). Другие исследования, проведенные в нашей лаборатории показали, колокализации с помощью этой техники 20. Колокализации времени необходимо будет оптимизировано на основе экспериментальной модели.
- Для количественного флуоресцентного сигнала из последовательности сканирования выбросов использовать "Спектральный расслоении" функцию в живой образ. Выберите изображения, которые включают в анализе и сделать маску на площади мышь содержащий сигнал, представляющий интерес, в данном случае, верхней части грудной клетки. Выберите autofluorescense ткани и неизвестных зонд несмешанным. Если мышей приведены пищевые продукты, содержащие люцерну, пищевой сигнал может быть также Unmixed от зонда интересов и ткани флуоресценции.
- Если в результате изображения не показывают равномерное распределение флуоресценции тканей (в том числе области, где сигнал находится) ограничения могут быть установлены, чтобы получить равномерное распределение и лучшее разделение компонентов будучи несмешанные. Это характерно и часто необходимы для зондов, которые не в программном обеспечении и когда конкретный сигнал имеет низкий уровень, или близко к фоновому сигналу. Установить фильтр высоких частот, найти на вкладке обновления для 640 нм, что соответствует нижнему концу кривой эмиссии для turboFP650. Низкое ограничение фильтра нижних частот также может быть установлен, но это было ненужным для анализа изображений показаны здесь.
- Количественно флуоресцентный сигнал от несмешанных изображение с помощью области интереса (ROI) установлен в сияющий эффективности (фотонов / сек / см 2 / SR) / мкВт) и установить все изображения в одном масштабе (рис. 3).
- На заданной временной точке, мыши могут быть принесены в жертву и анализировали на ENgraftment чЭСК клеток, полученных методом проточной цитометрии. Для внутрибрюшинно вводили НК-клеток мы обычно анализируют периферической крови (лицевой кровотечение вены), селезенки и брюшины. Перитонеальный моющие средства могут быть выполнены путем воздействия только перитонеальной мембраны и делая медиальной разрез просто достаточно широкими, чтобы стекло пипетки Пастера для доступа в брюшную полость. Использование стерильного PBS, выполните нескольких стирок брюшной полости и обязательно тщательно перемешать раствор, вращая мышью. Соберите достаточное количество жидкости, пока вы не иметь видимый осадок после центрифугирования (обычно 5-10 мл промывка).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поколения гемопоэтических клеток-предшественников с использованием подхода спин EB обеспечивает оптимальную NK развития В-клеток из ЭСК и ИПСК. Как показано на рисунке 2, день 11 спина ЭТ содержат высокий процент предшественников клеток, экспрессирующих CD34, CD45, CD43 и CD31. Высокие уровни CD34 и CD45 позволяет прямым переводом на NK условиях без необходимости сортировки или поддержки стромальных клеток. Если есть субоптимальные дифференциации EB спина, рекомендуется, что стромальные клетки, такие как EL08-1D2 используются во вторичном NK условиях. После 4 недель культивирования спин ЭТ приводит к большому количеству НК-клеток (примерно 1-2 × 10 6 клеток на лунку 24-луночного планшета). Культуры могут быть phenotyped на более ранних моментов времени, чтобы увидеть постепенное прогрессирование развития клетки NK в этой системе 7. NK клетки сохраняют выражение генов-репортеров, которые были изменены в ES родителя / IP-линии и, следовательно, может тогда сопровождаться
Рисунок 1. Двойная схема обработки изображений и сроки развития. А) Схема модели в естественных условиях. Мышам вводили IP с люциферином, и после надлежащего периода инкубации, люциферазы светляков + клеток в образ будут включены для биолюминесцентными сигнала. После приобретения биолюминесцентными изображения, флуоресцентный сигнал от TurboFP650 + клетки могут быть отображены. B) график разработки и тестирования чЭСК производныеЭд NK клеток.
Рисунок 2. Фенотип спиновых ЭТ и NK клеток, полученных из ЭСК и ИПСК. ) После 11 дней в культуре спин EB, клетки могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии. День 11 момент времени дает высокий процент CD34, CD43, CD45, CD31 и экспрессирующие клетки NK оптимальным для дифференцировки клеток. B) NK клетки могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии после 4 недель культивирования клеток NK. Клетки внутри лимфоцитов ворота (ПКП / ВКП участка) анализируют на экспрессию CD56. CD56 + клетки могут дополнительно проанализированы на совместной экспрессии маркеров, таких как CD117, CD94, NKp46, или другие. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Люминесцентные и биолюминесцентными изображения в естественных условиях использования IVIS Spectrum. В естественных условиях мониторинга является основной целью этого протокола. Таким образом, мышей не последовало за опухоль оформления. Наш предыдущий доклад (с использованием 200 000 К562) показывает, что опухоль оформление происходит в три недели 7.) Биолюминесцентный изображений Fluc + чЭСК НК-клеток в день 0, 7, и 14 день после инъекции клеток NK показан в верхнем ряду. Флуоресцентные изображения из TurboFP650 + К562 на 0 сутки, 7, и 14 день после инъекции клеток NK показан в нижнем ряду. Флуоресцентные изображения были получены сразу после биолюминесцентными захвата изображений. B) Последовательность показывает аутофлюоресценция ткани и флуоресцентный сигнал от turboFP650 + клеток, генерируется с использованием спектральной особенности расслоении в живых образа ПО. Мыши на крайней левой в каждом изображении не является управление впрыском и показывает только фоновый сигнал. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ЭСК являются идеальной платформой для изучения разных типах клеток и удерживать значительный потенциал для клинического перевода. Мы используем определены, спина EB дифференцировать подход к ЭСК / ИПСК в гемопоэтические клетки-предшественники. Подход спин EB дал последовательный вывод гемопоэтических клеток-предшественников и дифференцировке в NK-клеток, тем не менее, все еще существует изменение в дифференцировке эффективность через клеточные линии и, возможно, должны быть изменены для генерации других гемопоэтических клеточных линий. В то время как сопоставимые результаты могут быть получены из выводе в других EB или стромальных методов культуры, эта система бессывороточной и представляет собой более определенный подход к производству гематопоэтические предшественники по сравнению с другими методами. У нас есть также стандартизированные эффективный метод получения NK-клетки этих гемопоэтических предшественников в таком же фидерных свободной манере, которая преодолевает серьезной проблемой для клинического перевода. Она также обеспечивает определенную системы для изучения клетки NK РАЗВИТИЕT в пробирке. Обширные доклинических, в естественных условиях характеристика гемопоэтических клеток, таких как НК-клетки, также необходимо четко определить эти полученные экспериментальным путем типов клеток и их внедрение в клинических испытаниях.
Достижения в области визуализации и микроскопии позволили долгосрочные и неинвазивный мониторинг в естественных клеток, экспрессирующих биолюминесцентными и флуоресцентные журналистам 15-17,19,21. Наиболее заметным является использование люциферазы светлячка конструкцию, которая была использована для визуализации разных типах клеток с момента ее первоначального характеристики. Это идеальный репортером в естественных изображений, но ограничивается только одним мониторинга клеточной популяции. Самое большое преимущество двойного репортер системы является способность следовать взаимодействия между двумя различными клеточных популяций. Тем не менее, несколько журналистов были разработаны, которые являются одновременно легко изображения в естественных условиях и имеют достаточное и количественному сигнала вышефоне.
TurboFP650, флуоресцентный белок используется в нашей двойного изображения схемы, далеко-красные сместился, что дает сигнал отличного от фона флуоресценции. Тем не менее, использование спектральных методов расслоении в живых программного обеспечения изображения (суппорт Life Sciences) был необходим для максимального сигнала к фону в нашей системе. Есть много возможностей в программном обеспечении Изображение гостиная в состоянии помочь с собственными проблемами флуоресцентные изображения белка. Тем не менее, сигнал пенетрантности остается проблемой. Система нуждается в дальнейшей оптимизации для работы с изображениями небольших популяций клеток или изображений дисперсных клетки, как было бы в случае, если опухолевые клетки вводили IP. Тем не менее, последовательность и простота флуоресцентные изображения делает его использование идеальной платформой для использования в моделях с двумя изображениями. Животных под наркозом в течение меньшего времени, и нет никакой необходимости, чтобы доставить вторую подложку, как и большинство двойного люциферазы систем.
Этот методвывода, расширения и двойного изображения в естественных условиях обеспечивает последовательный подход к производству чЭСК или ИПСК полученных НК-клеток и их оценка, которая необходима для улучшения текущей клетки NK приемных терапии. Двойного флуоресцентного изображения и биолюминесцентными модель широко применяется для долгосрочного исследования двух различных клеточных популяций, кроме противоопухолевого модель, которую мы показали.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была поддержана NIH / NHLBI R01-HL77923 (ДСК) и грант NIH MSTP T32 GM008244 (ДАК), биологии стволовой клетки Обучение Грант T32 (ДАК) (T32HD060536), Бакалавриат Исследовательские возможности программы (UROP) Грант, Университет Миннесоты (AMB), лейкемии фонда исследований Университета Миннесоты онкологического центра, а William L и Бланш Хьюз Foundation.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Мелинда Hexum для начала протокол EB спина в нашей лаборатории. Мы хотели бы поблагодарить других членов лаборатории, в том числе Laura E. Bendzick, Майкл леплю, и Женя Ni за техническую помощь в этой работе. Авторы также хотели бы поблагодарить Брэда Тейлора в суппорт Life Sciences за его экспертные технические консультации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercapt–thanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R & D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells |  MD Anderson, Houston, TX |
contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section | |
Materials Table. |
|||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al.
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S.
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
