Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung, Expansion und in-vivo-Bildgebung von NK-Zellen aus hES-und iPS-Zellen abgeleitet.
Abstract
Wir präsentieren eine Methode zur Ableitung natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) aus undifferenzierten hES und iPS mit einem Feeder-freien Ansatz. Diese Methode ergibt sich ein hohes Maß an NK-Zellen nach 4 Wochen Kultur und weitere 2-log Expansion mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen zu unterziehen. hESC-und iPS-abgeleiteten NK-Zellen in diesem System entwickelt haben eine reife Phänotyp und Funktion. Die Produktion einer großen Anzahl von NK-Zellen genetisch veränderbar gilt sowohl für grundlegende mechanistische sowie Anti-Tumor-Studien. Expression der Firefly-Luciferase in hES-Zellen abgeleiteten NK ermöglicht eine nicht-invasive Ansatz zur NK-Zell-Transplantation, Verteilung und Funktion folgen. Wir beschreiben auch ein Dual-Bildgebungsverfahren, das eine getrennte Überwachung von zwei verschiedenen Zellpopulationen zu deutlicher charakterisieren ihre Wechselwirkungen in vivo ermöglicht. Diese Art der Ableitung, Expansion und zwei in-vivo-Bildgebung eine zuverlässige Methode zur Herstellung von NK-Zellen und deren ausgewertetation, die zur aktuellen NK-Zell-Therapien Adoptiveltern zu verbessern.
Introduction
Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sind undifferenzierte, pluripotente Zellen, die sich unbegrenzt Selbsterneuerung und Differenzierung multi-Linie. hESCs wurden erfolgreich in reifen und funktionale Untergruppen von jedem Keimblatt, einschließlich Zellen des blutbildenden Systems 1-3 unterschieden. Natürliche Killerzellen (NK)-Zellen sind Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, von HES durch Bildung von embryoid bodies (EBs) 4,5 oder Co-Kultur mit Zelllinien 1,2,6-8 Stromazellen abgeleitet werden. NK-Zellen besitzen anti-virale und anti-Tumor-Fähigkeiten und das Potential haben, sich gegen ein breites Spektrum von Tumoren wirksam, da sie keiner vorherigen Antigen-Stimulation zu ihren Effektorfunktionen durchzuführen. Somit sind hESC abgeleiteten NK-Zellen eine attraktive Quelle von Zellen für die Immuntherapie. Zusätzlich stellt die Ableitung von NK-Zellen aus HES ein genetisch zugänglich, um den normalen Entwicklung zu studieren <em> in vitro.
Weil sie eine genetisch manipulierbaren System bereitzustellen, kann hESC abgeleiteten NK Zellen experimentell modifiziert werden, um Fluoreszenz-und Biolumineszenz Reporter exprimieren einen optimalen Modell NK-Zell-Effektorfunktionen in vitro und in vivo zu studieren. hESC abgeleiteten NK-Zellen besitzen Wirkung gegen eine Reihe von Zielen, einschließlich HIV 9, Leukämie (K562) und andere Krebsarten 7,8. Jedoch ist die Fähigkeit, effizient ableiten genug NK Zellen, zur Behandlung von Patienten vor ein erhebliches Hindernis für die klinische Übersetzung und zu einem geringeren Grad, eine Beschränkung für umfangreiche präklinischen in vivo-Untersuchungen der NK-Zell-Entwicklung und Anti-Krebs-Funktionen. Hier verwenden wir ein Spin EB Ansatz zur Ableitung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus hESCs 4,5,10. Nach 11 Tage der Spin EBs sind NK-Zell-Kultur mit oder ohne Feeder für 28 Tage übertragen. Nach 4 Wochen in NK Zellkulturmedium, NK-Zellen transferred zu Co-Kultur mit K562-Zellen modifiziert werden, um membrangebundene Interleukin 21 (IL-21), die als künstliche Antigen präsentierende Zellen (aAPCs) dienen auszudrücken. Anpassung ein Protokoll für den Ausbau der peripheren Blut NK-Zellen mit diesen künstlichen APCs 11,12, sind wir in der Lage zu expandieren NK-Zellen 2-Protokolle unter Beibehaltung einer reifen Phänotyp und zytotoxische Fähigkeiten.
Dieser Prozess der Entwicklung und Expansion bietet ausreichend hESC abgeleiteten NK-Zellen für umfangreiche in vivo Charakterisierung. Für in-vivo-Studien, können wir nicht-invasiv überwacht langfristig Transplantation und die Kinetik der injizierten Glühwürmchenluciferase sind Ausdruck (Fluc +), hESC abgeleiteten NK-Zellen mit Biolumineszenz-Bildgebung. Darüber hinaus sind wir in der Lage, NK-Zell-Interaktionen mit Tumorzellen mit einem Dual, Biolumineszenz oder Fluoreszenz-Imaging-Schema folgen. Eine frühere Studie von unserer Gruppe verwendet Biolumineszenz-Bildgebung in einem Anti-Tumor-Modell bis zur Tumorprogression und cle folgenarance von Fluc + K562-Zellen in vivo 7. Nun, von Engineering bis hESCs unsere ausdrückliche Glühwürmchenluciferase 13,14 können wir die biologische Verteilung und Handel von NK Zellen K562 Tumorzellen, die das kürzlich charakterisierten fluoreszierendes Protein exprimieren turboFP650 15 folgen. Wir haben dieses duale System Reporter ausgewählt, um gleichzeitig folgen die beiden Zellpopulationen in vivo (Abbildung 1). Die meisten Dual Imaging Modelle haben Dual-Luciferase-Systeme, aber diese Systeme technisch eine Herausforderung aufgrund der Lieferbedingungen von Coelenterazin, das Substrat für die Expression der meisten Renilla Luciferase Reporter und Gaussia 16-18 erforderlich. Fluorescent Reporter haben eine einfache Überwachung von vielen Zelllinien und Konstrukte in vitro erlaubt, hat aber nur begrenzten Erfolg hatten in-vivo-Bildgebung aufgrund der Überlappung zwischen Gewebe und Fell Autofluoreszenz und Emissionsspektren von vielen commonly verwendet fluoreszierenden Reporter einschließlich GFP, DsRed und tdTomato 15,19. Diese Sorge hat die Entwicklung der weit rot fluoreszierende Proteine, die für eine bessere Gewebe Penetranz und höhere spezifische Signal im Vergleich zu 15,19 Hintergrund erlauben gefördert. TurboFP650, das fluoreszierende Protein in diesem System gezeigt, ist weit-Rot verschoben und überwindet viele der Probleme, mit bildgebenden fluoreszierenden Proteinen in lebenden Tieren.
Dieses Verfahren für die Entwicklung und den Ausbau von NK-Zellen hESCs abgeleitet hat uns erlaubt, weiter zu charakterisieren hESC abgeleiteten NK-Zellen in vitro und in vivo, die erforderlich sind, um besser zu verstehen, NK-Zell-Funktion und klinisch wichtig, aktuelle NK-Zell-Therapien Adoptiveltern zu verbessern. Es ist auch offen für die Ableitung und Erweiterung iPSC abgeleiteten NK-Zellen. Das duale Fluoreszenz und Biolumineszenz-Imaging-System ist breit anwendbar auf andere Systeme als die Anti-Tumor-Modell, das wir hier gezeigt haben.
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Protocol
1. Anpassung hESCs oder iPSCs in TrypLE für Spin EB Kulturen
- Die anfängliche Dissoziation TrypLE funktioniert am besten, wenn die ES / iPS Kolonien von den Kollagenase-passagierten Kulturen relativ klein sind. Der Ausgangspunkt ES / iPS Populationen sollte Zellen bestanden nicht länger als 4-5 Tage zurück. 4-5 Tage vor Beginn der TrypLE Durchgang passieren ES-Zellen in einer Dichte, die es den Zellen zu ca. 70% konfluent innerhalb von 4 Tagen Zeit sein wird. Verwenden Sie reguläre ES Medien für Kultur von TrypLE-passagierten ES-Zellen. Hier werden wir mit hESCs stabil mit einem Luciferase-Reporter-Konstrukt (Werkstoff-Tabelle) modifiziert. Das Protokoll arbeitet auch mit iPSCs mit unveränderten iPSCs zum Vergleich von hämatopoetischen Progenitorzellen und NK-Zell-Entwicklung.
- Vier Tage vor Beginn der TrypLE Durchgang passieren ES / iPS-Zellen mit Kollagenase IV, nach einem normalen Durchgang Protokoll. Wir gehen in der Regel 1:1 in den ersten Durchgang mit TrypLE. Erweitern ES / iPS-Zellen entsprechend vorher.
- Sorgfältig pflücken differenzierte Kolonien (solche, die eine umschriebene Grenze fehlt oder Fibroblasten / epithelialen Eigenschaften), bevor Sie mit TrypLE Dissoziation. Differenzierte Zellen übernehmen kann die Kultur relativ leicht mit TrypLE Durchgang, so ist es wichtig, sicherzustellen, dass Ihr Ausgangspunkt Bevölkerung ist sehr sauber.
- Saugen Medien aus Brunnen und 1,0 ml vorgewärmten TrypLE pro Vertiefung Wählen.
- Incubate ES / iPS-Zellen in TrypLE für 5 min in einem 37 ° C Inkubator. Nach 5 min sanft Pipette ES-Zellen aus dem Boden des Brunnens.
- Sammeln Sie die TrypLE Zellsuspension aus Brunnen und Transfer zu einem konischen Rohr. Pipette auf und ab gently 2-3 mal zu ermutigen, die größten Klumpen auseinander zu brechen. Verdünnen TrypLE mit mindestens 1 gleiches Volumen ES Medien und 1 gleichen Volumen DPBS. TrypLE nicht von Kulturmedien abgeschreckt, so ist es wichtig, die Medien und TrypLE mit DPBS verdünnt nach Entfernen von Zellen von der Platte. Wir verwenden DPBS + Medien für Waschungen zu ES Medien zu speichern.
- Spin down Zellen bei 1500 rpm für 5 min in Kühlzentrifuge (8 ° C).
- Absaugen so viel von der Überstand wie möglich TrypLE entfernen.
- Die Zellen in 4 ml ES Medien plus 4 ml DPBS und wiederholen Spin loswerden restlichen Spuren TrypLE.
- Absaugen Überstand und resuspendieren in geeigneten Volumen ES Medien für die Beschichtung.
- Teller ES-Zellen 1:1 (oder 2.01 wenn nötig) auf Low-Density-MEFs in ES Medien.
- Nach 24 Stunden, füttern Zellen mit frischem ES Medien. Es wird wahrscheinlich viele einzelne Zellen, die nicht an sein wollte. Füttern Sie täglich mit ES-Zellen ES Medien.
- Pass mit TrypLE auf frische MEFs (0.9-1 x 10
- Für die ersten mehreren Passagen (bis Durchgang 5-10), werden die Zellen benötigen vorbei auf 1:1. Dies macht die Erweiterung der Zellen schwierig. Nach unserer Erfahrung Platierungseffizienz der ES-Zellen sinkt dramatisch um Passagen 4-5 und dann kommt wieder innerhalb von ein paar Passagen. Nach 5-7 Passagen, können Sie in der Lage sein zu beginnen vorbei an den Zellen bei 1:2 und schließlich, 1:3. Über Kanal 20 können Sie brauchen, um das Bestehen der Zellen bei 1.05 oder 1.06. Achten Sie darauf, die Platte ES-Zellen mit einer hohen Dichte die ersten 5-10 Passagen. Wenn Sie zu einem Punkt kommen, wo die Zellen Platte unten effizient genug, dass sie ~ 70% Konfluenz innerhalb von zwei Tagen nach dem Durchgang zu erreichen, können Sie versuchen zu starten vorbei am 1:2 und schließlich sollten in der Lage sein, um 1:3 oder passieren 1:4 beträgt. iPSCs, insbesondere, wenn auch nicht dicht genug, bevor eine voll passagiertdapted, neigen dazu, zu unterscheiden.
2. Stammlösungen für Einrichten Spin EB Kulturen
- 10% BSA-Lösung in IMDM: Suspend 4 g BSA in 35 ml IMDM (in einem 50 ml konischen). Anschließend Lösung bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden ruhen lassen, damit BSA vollständig aufzulösen. Stellen Gesamtvolumen auf 40 ml mit IMDM, um eine Endkonzentration von 10% zu erhalten. Kommerziell erhältliche BSA kann zytotoxischen ES-Zellen. Deionisierung die Lösung kann die Potenzial für Zytotoxizität. Um deionize, fügen ~ 1,3 g Harz Perlen zu 40 ml BSA-Lösung und gut schütteln zu mischen.
- Platz BSA-Lösung (mit Harz Perlen) bei 4 ° C bis Perlen wechseln ihre Farbe von blau-grün bis gelb (dh der Austausch-Kapazität erschöpft ist).
- Schütteln Lösung jedes 20-30 min zum Austausch erleichtern
- Jeder Austausch kann bis zu 2 Stunden. Bei Austausch abgeschlossen ist, zentrifugieren Lösung für 2 min bei 1.000 rpm zu Pellet Perlen am Boden des Röhrchens.
- Pipette BSA-Lösung in ein frisches 50 ml konischen, so dass Perlen verworfen werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.5 mindestens zwei weitere Male für insgesamt drei oder mehr Austausch. Während dem letzten Austausch kann die Kapazität der Perlen nicht vollständig selbst nach 2 Stunden Inkubation mit den Perlen erschöpft sein.
- Sterilfilter der BSA-Lösung und entfernen Sie alle verbleibenden Perlen.
- Die BSA-Lösung sollte bei 4 ° C stabil während mindestens 2 Monaten.
- 5% PVA-Lösung: Messen Sie 100 ml Millipore H 2 O in 125 ml Glasflasche.
- In 5 g PVA zum Wasser. Es ist wichtig, die PVA zum Wasser, so dass die PVA wird "nass". Wenn Sie das Wasser hinzufügen, um die PVA, wird es eine sehr lange Zeit für die PVA in Lösung gehen.
- PVA wird nicht sofort auflösen. Platz PVA / Wasser-Lösung bei 4 ° C über Nacht.
- Am nächsten Morgen, Ort PVA / Wasser-Lösung in 37 ° C im Wasserbad für 4-8 Std. PVA sollte meist in Lösung Ende seindie Inkubationszeit.
- Platz Flasche zurück in 4 ° C für weitere 24-48 h, oder bis vollständig aufgelöst. Lösung könnte etwas zähflüssig.
- PVA Lösungen sollten bei 4 ° C stabil für mindestens 6 Wochen.
- Linol-und Linolensäure (10.000 X Lösungen): Verdünnen auf 1 mg / ml in 200-Liter Ethanol. 10 ml reines Öl auf 10 ml Ethanol. Aliquot und bei -20 ° C
- α-MTG Stammlösung: Verdünnen Sie 13 ul α-MTG in 1 ml IMDM.
- Ascorbinsäure-2-Phosphat-Lösung (100X): Machen Sie eine 5 mg / ml Lösung. 250 mg Ascorbinsäure-2-Phosphat in 50 ml sterile, Gewebe-culture grade H 2 O. Löst sich leicht.
3. Versammlung der BPEL Medien (für ~ 200 ml Gesamtvolumen)
- Machen Sie eine PVA-Lipide Mischung (dieser Schritt verhindert, dass die PVA die Bildung von unlöslichen Tröpfchen in dem Medium, das raus würde gefiltert).
- 20 ml und 20 ml IMDM F-12 Nährstoffmischung bis 50ml konischen Röhrchen.
- 10 ml 5% PVA Lager, 0,4 ml synthechol, 20 ul Linolensäure und Linolsäure 20 ul für 200 ml BPEL Medien. Schütteln Rohr gut zu mischen. Beiseite, während andere Medien Komponenten zusammengebaut werden.
- In alle übrigen Medien Komponenten nach oben von 250 ml Stericup Filteranlage. Fügen Sie das Gleichgewicht der erforderlichen IMDM und F-12 Bände (66 ml), BSA, a-MTG, 100X ITS, Glutamax I, Pen / Strep, Protein-freie Hybridom Mischung II und Ascorbinsäure. Fügen Sie die PVA-Lipide Mischung aus Schritt 1 an die Spitze des Stericup. Filtern des Mediums. Medium sollte bei 4 ° C stabil für mindestens 2 Wochen. Verwenden Sie die alte Medium für Waschschritte.
4. Einrichten TrypLE-passagierten ES-Zellen in Stufe I Spin EBs
Verwenden ES / iPS-Zellen, die angepasst wurden, um den Durchgang zu geringerer Dichte MEFs (dh ES / iPS-Zellen, die mit TrypLE mindestens 5-7 mal wurden passagiert) TrypLE. Wenn Zellen können bei ~ 1.03 weitergegeben werden und zu 70-80% konfluent in 3-4 TagenSollten die Zellen gut zu bedienen.
- Zwei Tage vor dem Einrichten Spin EB Differenzierung (Tag -2): Pass-TrypLE angepasst ES / iPS-Zellen auf frische MEFs bei einer Dichte so dass sie zu 70-80% konfluent am Tag der Differenzierung eingerichtet werden. Wir passieren in der Regel 48 Stunden vor dem EB Setup Spin.
- Day of Spin EB-Setup in Stufe I Differenzierung (Tag 0): Um für Spin EB Beschichtung vorzubereiten, Pipette 150 ul sterilem Wasser in die 36 äußeren Vertiefungen jeder 96-Well-Platte, um Verdunstung zu minimieren. Mit rundem Boden, niedrige Befestigung 96-Well-Platten nur.
- Saugen Kulturmedien off von ES / iPS-Zellen und 1,0 ml vorgewärmten TrypLE in jede Vertiefung wählen.
- Platz Platten im Inkubator (37 ° C) für 5 min. Gently Pipette Zellen aus der Platte.
- Sammle dissoziierten Zellen in einem konischen Rohr und Pipette auf und ab auseinander zu brechen Klumpen. Verdünnen TrypLE mit 1 gleichen Volumen BPEL Medien und mindestens 1 gleiches Volumen DPBS.
- Überstand entfernen und die resuspendierenZellen in 5 ml BPEL Medien zuzüglich 5 ml DPBS. Wiederholen Spin.
- Überstand entfernen und Zellen in 5-10 ml BPEL Medien, je nach zu erwartenden Zellzahl. Pass Zellen durch 70 um-Filter (BD Falcon # 352350) in ein frisches 50 ml konischen um Klumpen (die mit EB Bildung stören) zu entfernen.
- Graf gefiltert Zellen. Aliquot Zellen, die zur Beschichtung in einem 50 ml konischen und Spin verwendet werden. Für Überzug: 3.000 ES Zellen / Well, 60 Wells / Platte = 1.8x10 5 ES Zellen / Platte.
- Nach der Zentrifugation werden die Zellen brauchen, um zu 3x10 4 Zellen / ml (100 ul / Well, 3000 ES-Zellen / well) suspendiert werden.
- Bereiten Sie ein Volumen von BPEL media + Zytokine ausreichen Resuspendieren der Zellen (dies wird 6 ml / Platte sein). Für die Stufe I Differenzierung, verwenden wir SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml) und VEGF (20 ng / ml) für die Ableitung von hämatopoetischen Vorläuferzellen.
- Platte 100 ul Zellen / well (= 3.000 Zellen / Well) in jeder der inneren 60 Vertiefungen der preparED 96-Well-Platten. Dies ist am einfachsten mit einem Mehrkanal-Pipette und sterile Trog. Achten Sie darauf, Zellen durch Pipettieren, bevor Sie in der Wanne mischen und schnell arbeiten, so dass Zellen nicht eine Chance haben, sich aus.
- Drehen Sie die 96-Well-Platten in gekühlten Zentrifuge für 4 min bei ~ 1.500 rpm, 8 ° C.
- Sorgfältig übertragen Platten aus der Zentrifuge bis 37 ° C Inkubator. Nicht zu stören die Platten so weit wie möglich. Prüfen Platten, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig Pellets geformt in den Boden der Vertiefungen.
- Stufe I drehen, bis der ebs eine haltbarere äußere Schicht gebildet haben EBs sollten nicht gefüttert oder anderweitig gestört durch 3-4 Tage Differenzierung. Wenn EBs im Stadium I über 10-12 Tage werden wir manchmal füttern EBs mit 50 ul frisch BPEL Medien mit Zytokinen in jede Vertiefung (zunächst aus 50 ul alten Medien aus jedem Well). Innerhalb von 24 h, sind die Zellen beginnen, eine 3-D EB Struktur zu bilden, und von Tag 3-5 muß ein deutlicher äußeren Schicht haben, und starten Entloping zystischer Strukturen.
5. Distanziert Stage I EVG für FACS Analyse
Sammle around18-36 Spin-EB für FACS-Analyse. Bei der Analyse Zellen vor dem Tag 6, mehr Brunnen erforderlich, um eine ausreichende Zellzahl zu erhalten.
- Bereiten Sie notwendige Volumen von Trypsin mit 2% Hühnerserum. Platz in der 37 ° C im Wasserbad bis zur Verwendung.
- Übertragen Spin EBs und Medien aus 96-Well-Platten zu 15 ml konischen Röhrchen.
- Erlauben EBs zu Boden konische Röhrchen zu begleichen. Mit einer 5 ml Pipette vorsichtig pipettieren Sie den Überstand und Überweisung auf ein separates Rohr (Sie können alle Pool der Überstand in ein 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen). Da einige hämatopoetischen Zellen bereits von der Spin EB zwischen den Tagen 9 und 11 veröffentlicht worden, die Trennung der Überstand enthalten diese Zellen verhindert übermäßige Trypsinierung.
- Resuspendieren EBs in Trypsin + 2% Hühnerserum: 3-4 ml bis 15 ml je konischen Rohr. Zeigen EBs mit Trypsin in 37 ° C waterbath für 3-7 min. Schütteln oder vorsichtig vortexen alle 1-2 min. Bei früheren Zeitpunkten (vor Tag 8), wird EBs auseinander brechen leichter und kann so wenig wie 3 min dauern. Zu späteren Zeitpunkten (Tag 8 +) Das EBS kann länger dauern, distanzieren. Wir in der Regel lassen Sie sie nicht länger als 5 min trypsinize bei 37 ° C Beachten Sie, sind diese Zeiten nur ein Guide. Für eine bestimmte Zelllinie oder EB Differenzierung, kann es mehr oder weniger Zeit, um die EBs distanzieren. Überwacht die Dissoziation. Es ist wichtig, nicht auf Zellen in Trypsin verlassen zu lange. Es ist besser, um das Trypsin Dissoziation, wenn nur ein paar kleine Klumpen sichtbar bleiben anstatt zu versuchen, alle Klumpen beseitigen zu stoppen.
- Quench Trypsin mit mindestens 1 gleichen Volumen FBS enthaltendem Medium. Spin down Zellen (1.500 rpm, 5 min, 8 ° C).
- Die Zellen in einem geeigneten Volumen von Medien für die Zählung (in der Regel 3-5 ml).
- Filter Zellen durch eine 100 um Zellsieb. Entfernen einer Teilmenge von Zellen zum Zählen. Fahren Sie mit ZellenStandard-Labor FACS-Protokolle.
6. Entwicklung, Expansion und Charakterisierung von NK Zellen aus HPSC-Vorläuferzellen
Da der Spin EBs enthalten einen hohen Anteil von hämatopoetischen Vorläuferzellen, können sie direkt auf NK Zellkultur werden am Tag 11 übertragen. Der Spin EBs auf 24-Well-Platten mit oder ohne Feeder übertragen werden. Wir haben keinen Unterschied im Phänotyp oder Funktion zwischen NK-Zellen in jeder Bedingung abgeleitet gezeigt. Deshalb haben wir in der Regel zu den Kulturen ohne Abzweige zu übertragen, um eine vollständig definiertes System zur NK-Zell-Entwicklung haben. Bei Verwendung eines hESC / iPSC Einklang mit suboptimal hämatopoetische Differenzierung der Einsatz von Feeder-Schichten ist 7,8 empfohlen.
- Mit einer Mehrkanal-Pipette auf 100 ul, Transfer 6 Spin EBs in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- Mit Feeder: Transfer Spin EBs auf 24-Well-Platten mit 100.000 bestrahlten (3.000 cGY) EL08-1D2 (a murine embryonic Leber) Zellen pro Vertiefung. Ohne Abzweige: Transfer EBs direkt auf unbeschichtete, 24-Well-Platten.
- In 400 ul NK Differenzierungsmedium mit Zytokinen (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, alle von Peprotech) so das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung ~ 1 ml.
- Platz Zellen im Inkubator und füttern alle 5-7 Tage mit NK Differenzierung Medien, die alle in Schritt 6.3 Zytokine außer IL-3.
- NK-Zellen wird eine reife Phänotyp an Tag 28 nach der Übertragung auf NK-Zell-Differenzierung Kultur (Abbildung 2) zum Ausdruck bringen.
- Um NK-Zell-Zytotoxizität zu testen, kann ein 4 hr Chromfreisetzungsassay 8 durchgeführt werden.
- Wenn eine große Anzahl von Zellen für die in-vivo-Studien benötigt werden, können Co-Kultur mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (aAPCs) ergeben eine 2-log oder größere Ausdehnung. Für ein ausführliches Protokoll, besuchen http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.
7. In vivo Fluoreszenz und Biolumineszenz Imaging hESC abgeleiteten NK Zellen und Tumorzellen in Mäuse Immundefiziente überwachen
Wir verwenden nonobese Diabetiker / schwere kombinierte Immundefizienz mit gamma-Kette Knockout (NOD / SCID / yc - / -) Mäusen, die 6 bis 8 Wochen alt sind in allen unseren Experimenten. Wir verwenden eine Dual Imaging Modell gleichzeitig verfolgen Tumorprogression (turboFP650 reporter) und HES-NK-Zellen Kinetik (Fluc Reporter in übergeordneten ES-Zellen exprimiert) in vivo. Dieses bildgebende System ist breit anwendbar auf andere Systeme als die Anti-Tumor-Modell abgebildet. Die IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences) ist optimal für die gleichzeitige Leuchtstoff-und in vivo Biolumineszenz-Bildgebung.
- 24 Stunden vor der Injektion der Tumorzellen, bestrahlen Mäusen (225-250 cGY).
- Resuspendieren gewünschte Anzahl vonTumor-Zellen (1 × 10 6 Zellen K562 dargestellt) in 200 ul Iscove modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM) mit 20% FBS ergänzt. Tumorzelle Dosis kann in Abhängigkeit von dem Modell verwendet werden. TurboFP650 könnte auch in Nicht-Tumor-Arten ausgedrückt werden. Es ist am besten mit Zellen lokalisiert auf eine einzige anatomische Lage abgebildet.
- Spritzen Tumorzellen subkutan in der oberen linken Brustkorb der Mäuse mit einer 27 oder 28-Gauge-Nadel und lassen Sie sie für 4 Tage engraft. Die Zellen sollten eine Blase unter der Haut der Maus bilden. Mäuse können in diesem Bereich des Körpers besser zu visualisieren Injektion rasiert werden. Es macht auch den Bereich für eine bessere in vivo Fluoreszenz-Bildgebung. Injection um den Brustkorb der Mäuse wurde in diesem Modell verwendet werden, da die IP-NK-Zellen injiziert besten visualisiert werden, während die Maus liegt auf dem Rücken. Alternative Methoden der subkutanen Lieferung, einschließlich der Rücken oder Flanke, sind weniger belastend für das Tier und sollte in Betracht gezogen werden.
- Resuspendieren Sie die gewünschte Anzahl von hES-derived NK-Zellen (10 x 10 6 NK-Zellen sind gezeigt) in 300 ul Iscove modifizierten Dulbecco-Medium (IMDM) mit 20% FBS ohne Antibiotika ergänzt.
- Spritzen hESC abgeleiteten NK-Zellen in jeder Maus intraperitoneal (IP) mit einem 27 oder 28-Gauge-Nadel. Für alle Versuche gehören Mäuse, die kein Tumor oder NK-Zell-Infusion als eine negative Kontrolle.
- Um NK-Zell-Populationen in vivo zu erhalten, geben Mäuse eine 250 ul IP Injektion von IL-2 (1x10 4 U / Maus) und IL-15 (10 ng / Maus) in sterilen DPBS jeden Tag für die ersten 7 Tage, gefolgt von IL- 2 nur alle 2 bis 3 Tage, bis zum Zeitpunkt der Tötung.
- Überwachen Verpflanzung von hES-Zellen abgeleiteten NK durch Biolumineszenz-Bildgebung. Spritzen jede Maus IP mit 120 ul D-Luciferin (150 mg / kg). Bild der Mäuse 10 min nach D-Luciferin Injektion.
- Anesthetize Mäusen mit einer Kammer ermöglicht Isofluran Eintrag in das Feld bei 0,8 l / min. Stellen Sie sicher, es gibt auch Sauerstoff in die Kammer.
- Zeigen narkotisiertenMäuse in IVIS Spectrum und sichere Mäuse auf dem Rücken mit Klebeband oder Klettband und erlauben Isofluran Eintrag in das Feld bei 0,5 l / min auf die Anästhesie zu halten.
- Set IVIS Maschine Imaging-Plattform korrigieren (D für 4-5 Mäuse, C für 3 oder weniger Mäuse), setzen Binning bis mittel, f / stop, um 1 und erwerben für 1 min.
- Um Fluoreszenz-Bildgebung für turboFP650 + Zellen durchzuführen, verwenden Sie die Imaging-Assistenten, um eine Emission Scan Messung der Sonde von Interesse sowie Hintergrund-Signal. Aus der Liste der Sonden wählen Eingang Em / Ex, und geben Sie in der richtigen Anregung und Emission. Für turboFP650, verwenden 605 660-720 Anregung und Emission in Tumor-Signal und 570 Anregung und Emission 640-720 in den Hintergrund Signal messen. Verwenden Sie automatische Belichtung Einstellungen und wählen Sie die gewünschte Imaging-Plattform. Die gesamte Bildsequenz erfolgt in der Regel 3-5 min zu erwerben.
- Erlauben Mäusen vollständig aus der Narkose zu erholen, bevor Transport aus dem Imaging-System. Analysieren Sie Bilder mit der LiVing Bild Softwarepaket Version 4.2 (Caliper Life Sciences).
- Quantifizierung Biolumineszenz-Signal mit einer Region of Interest (ROI) auf insgesamt Fluss (Photonen / sec) oder durchschnittliche Ausstrahlung (Photonen / sec / cm 2 / sr) und stellen Sie alle Bilder im gleichen Maßstab (Abbildung 3). Hier sind repräsentative Bilder verwendet, um beide Zellpopulationen in jeder Maus (3) zeigen. Andere Studien aus unserem Labor haben Kolokalisation mit dieser Technik 20 demonstriert. Colokalisation Zeitpunkt müssen auf der Grundlage der experimentellen Modells optimiert werden.
- Um Fluoreszenzsignal aus dem Emissions-Scan-Sequenz quantifizieren die "Entmischung"-Funktion in lebendiges Bild. Wählen Sie die Bilder in der Analyse enthalten und stellt eine Maske über den Bereich der Maus, die das Signal von Interesse, in diesem Fall die oberen Brustkorb. Wählen Sie Gewebe autofluorescense und unbekannte Sonde unvermischt werden. Wenn Mäuse Lebensmittel, die Luzerne gegeben sind, können Lebensmittel Signal auch u seinnmixed von der Sonde von Interesse und Gewebeautofluoreszenz.
- Wenn die resultierenden Bilder nicht zeigen eine gleichmäßige Verteilung der Gewebeautofluoreszenz (einschließlich des Bereichs, wo das Signal befindet) Einschränkungen kann auf gleichmäßige Verteilung und eine bessere Trennung der Komponenten sortenrein zu erhalten. Dies ist typisch und oft notwendig für Sonden, die nicht in der Software und als spezifische Signal schwach ist, oder in der Nähe von Hintergrund-Signal. Legen Sie ein Hochpassfilter, unter der Registerkarte Update gefunden, für 640 nm, die mit dem unteren Ende der Emissions-Kurve entspricht für turboFP650. Ein Tiefpassfilter Einschränkung kann auch eingestellt werden, aber es war nicht nötig für die Bildanalyse hier gezeigt.
- Quantifizierung fluoreszierende Signal von der unvermischt Bild mit einer Region of Interest (ROI) auf Lichtausbeute (Photonen / sec / cm 2 / sr) / uW) und stellen Sie alle Bilder im gleichen Maßstab (Abbildung 3).
- Zu einem gewünschten Zeitpunkt, können die Mäuse getötet und für en analysiert werdengraftment von hES-Zellen abgeleiteten mittels Durchflusszytometrie. Für intraperitoneal NK-Zellen analysieren wir in der Regel dem peripheren Blut (Vena facialis Beschnitt), Milz und Bauchfell. Peritoneal wäscht, indem nur das Bauchfell und macht eine mediale Inzision gerade breit genug ist, um ein Glas Pasteur Pipette in die Bauchhöhle Zugriff ausgeführt werden. Mit einer sterilen PBS, führen mehrere Wäschen der Bauchhöhle und achten Sie auf Lösung gründlich mischen durch Drehen der Maus. Sammeln Sie genug Flüssigkeit, bis Sie eine sichtbare Pellet nach Zentrifugation (in der Regel 5-10 ml der Wäsche) haben.
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Representative Results
Die Erzeugung von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit dem Spin EB Ansatz ermöglicht eine optimale NK-Zell-Entwicklung von hES und iPS-Zellen. Wie in 2 gezeigt, enthält Tag 11 Spin EBs hohe Anteile an Vorläuferzellen CD34 exprimieren, CD45, CD43, CD31 und. Hohe Konzentrationen von CD34 und CD45 ermöglicht die direkte Übertragung auf NK Bedingungen, ohne dass für die Sortierung oder die Unterstützung Stromazellen. Wenn es nicht optimal Spin EB Differenzierung, wird empfohlen, dass Stromazellen wie EL08-1D2 in der sekundären NK Bedingungen verwendet werden. Nach 4-wöchiger Kultur der Spin EBs führen zu einer großen Anzahl von NK-Zellen (ca. 1-2 x 10 6 Zellen pro Well einer 24-Well-Platte). Kulturen können auch zu früheren Zeitpunkten Phänotyp für die schrittweise Fortschreiten der NK-Zell-Entwicklung in diesem System 7 zu sehen. NK-Zellen halten die Expression von Genen, die Reporter in die Muttergesellschaft ES / iPS Linie verändert wurden und deshalb dann verfolgt werden kann
Abbildung 1. Dual-Imaging-System und Entwicklungsstörungen Timeline. A) Schematische Darstellung der in vivo-Modell. Mäuse IP mit Luciferin injiziert und nach einer ordnungsgemäßen Inkubationszeit werden Glühwürmchenluciferase + Zellen für Biolumineszenz-Signal abgebildet. Nach Erwerb der Biolumineszenz Bild, fluoreszierende Signal von TurboFP650 + Zellen können abgebildet werden. B) Timeline für die Entwicklung und Erprobung von hES-Derivatened NK-Zellen.
Abbildung 2. Phänotyp von Spin EBs und NK-Zellen aus hES-und iPS-Zellen abgeleitet. A) Nach der 11 Tage im Spin EB Kultur können Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Der Tag 11 Zeitpunkt gibt hohe Prozentsätze an CD34, CD43, CD45, CD31 und exprimieren Zellen optimal für NK-Zell-Differenzierung. B) NK-Zellen können mittels Durchflusszytometrie detektiert nach 4 Wochen NK-Zell-Kultur werden. Zellen innerhalb des Lymphozyten-Gatter (FSC / SSC Plot) sind für die Expression von CD56 analysiert. CD56 +-Zellen können weiter für die Co-Expression von Markern wie CD117, CD94, NKp46, oder andere analysiert werden. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. Leuchtstoff-und Biolumineszenz-Bildgebung in vivo mit dem IVIS Spectrum. In vivo-Überwachung ist das primäre Ziel dieses Protokolls. Daher werden die Mäuse nicht für die Tumor-Clearance gefolgt. Unsere vorherigen Bericht (über 200.000 K562-Zellen) zeigt, dass Tumor-Clearance tritt drei Wochen 7. A) Bioluminescent Bildgebung von Fluc + hESC abgeleiteten NK-Zellen am Tag 0, 7 und 14 nach der NK-Zell-Injektion in der oberen Zeile angezeigt wird. Das Fluoreszenz-Imaging von TurboFP650 + K562-Zellen am Tag 0, 7 und 14 nach der NK-Zell-Injektion ist in der unteren Zeile angezeigt. Fluoreszierende Bilder wurden unmittelbar nach bioluminescent Bildaufnahme erworben. B) Sequenz zeigt Gewebeautofluoreszenz und fluoreszierende Signal von turboFP650 + Zellen, unter Verwendung der Entmischung Funktion in lebendiges Bild Software. Die Maus auf der anderen in jedem Bild links ist eine Non-Einspritz-Steuerung und zeigt nur den Hintergrund Signal. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
hESCs sind eine ideale Plattform, um verschiedene Zelltypen zu studieren und halten bemerkenswerte Potenzial für die klinische Übersetzung. Wir verwenden eine definierte, Spin EB Ansatz hESC / iPSCs auf hämatopoetischen Vorläuferzellen zu differenzieren. Der Spin EB Ansatz konsistente Ableitung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und Differenzierung auf NK-Zellen ergab, doch, Variation existiert noch in Differenzierung Effizienz in Zelllinien und müssen für die Erzeugung von anderen hämatopoetischen Zelllinien geändert werden. Während vergleichbare Ergebnisse aus Ableitung in anderen EB oder Stromazellen Kultur Methoden erhalten werden können, ist dieses System serumfreien und stellt eine weitere definierte Ansatz zur Herstellung von hämatopoetischen Vorläuferzellen im Vergleich zu anderen Methoden. Wir haben auch eine effiziente standardisierte Verfahren zum Ableiten von NK-Zellen aus diesen hämatopoetischen Vorläuferzellen in einem ähnlich Feeder-freie Weise, die ein wichtiges Anliegen für die klinische Umsetzung überwindet. Es bietet auch ein definiertes System zu NK-Zellen zu studieren development in vitro. Umfangreiche präklinischen in vivo Charakterisierung von hämatopoetischen Zellen wie NK-Zellen, ist es notwendig, genau zu definieren diese experimentell ermittelten Zell-Typen und deren Umsetzung zu den klinischen Studien.
Fortschritte in der Bildgebung und Mikroskopie-Techniken aktiviert haben langfristige und nicht-invasive in vivo Monitoring von Zellen, die Biolumineszenz-und Fluoreszenz-Reporter 15-17,19,21. Am bemerkenswertesten ist die Verwendung der Glühwürmchen-Luciferase-Konstrukt, das verwendet wurde, um verschiedene Zelltypen visualisieren seit seiner erstmaligen Beschreibung. Dies ist ein idealer Reporter in-vivo-Bildgebung, sondern nur die Überwachung einer Zellpopulation begrenzt. Der größte Vorteil der Dual-Reporter-Systems ist die Fähigkeit, die Wechselwirkung zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen zu folgen. Jedoch haben nur wenige Journalisten entwickelt, sind beide einfach zu Bild in vivo und über ausreichende und quantifizierbaren Signals überHintergrund.
TurboFP650, das fluoreszierende Protein in unserer Dual-Imaging-System verwendet wird, ist weit-Rot verschoben, was gibt Signal unterscheidet sich von Hintergrund-Autofluoreszenz. Allerdings war Auslastung der Entmischung Methoden in Wohn-Image Software (Caliper Life Sciences) notwendig, um das Signal zu Hintergrund-Verhältnis in unserem System zu maximieren. Es gibt viele Funktionen in der lebenden Bild Software in der Lage, mit den Herausforderungen der intrinsische fluoreszierende Protein Imaging helfen. Dennoch bleibt das Signal Penetranz eine Herausforderung. Das System benötigt eine weitere Optimierung für die Aufnahme kleiner Zellpopulationen oder Abbildung dispergierten Zellen, wie es der Fall wäre, wenn die Tumorzellen injiziert wurden IP. Allerdings macht die Konsistenz und Einfachheit der Fluoreszenz-Bildgebung ihre Verwendung eine ideale Plattform, um in einer Dual Imaging-Modell verwenden. Die Tiere werden unter Vollnarkose weniger lange und es besteht keine Notwendigkeit, ein zweites Substrat, wie bei den meisten Dual-Luciferase-Systeme liefern.
Dieses Verfahrender Ableitung, Expansion bietet, und Dual-Bildgebung in vivo einen einheitlichen Ansatz für die Herstellung von embryonalen Stammzellen abgeleitete oder iPSC abgeleiteten NK-Zellen und deren Auswertung, die zur aktuellen NK-Zell-Therapien Adoptiveltern zu verbessern. Das duale Fluoreszenz und Biolumineszenz-Imaging-Modell ist breit anwendbar für Langzeit-Studie von zwei verschiedenen Zellpopulationen andere als Anti-Tumor-Modell haben wir gezeigt.
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Disclosures
Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) und NIH MSTP Zuschuss T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology Ausbildungsförderung T32 (DAK) (T32HD060536), Undergraduate Research Opportunities Program (UROP) Grant, University of Minnesota unterstützt (AMB), der Leukemia Research Fund der University of Minnesota Cancer Center, und der William L und Blanche Hughes Foundation.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Melinda Hexum zur Initiierung der Spin EB Protokoll danken in unserem Labor. Wir möchten an die anderen Mitglieder des Labors, darunter Laura E. Bendzick, Michael Lepley und Zhenya Ni für ihre technische Unterstützung bei dieser Arbeit danken. Die Autoren möchte auch Brad Taylor bei Caliper Life Sciences danken für seine kompetente technische Beratung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercapt–thanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R & D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells |  MD Anderson, Houston, TX |
contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section | |
Materials Table. |
|||
References
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