Summary
임플란트 - 관련 감염은 중요한 임상 합병증입니다. 이 연구는 임플란트 - 관련 감염을 방지하기 위해 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)를 사용하여 접근 방식을 설명 지속적인 혈소판 농도와 PRP를 준비 프로토콜을 제시하고, PRP의 새로 확인 된 항균 특성 및 항균 특성을 조사에 대한 관련 프로토콜을보고
Abstract
임플란트 - 관련 감염 항생제 저항, 동물과 인간 사이의 항생제 내성 박테리아의 전송과 감염을 치료의 높은 비용을 증가로 인해 점점 더 의료 산업에 더 도전 세계적되고 있습니다.
본 연구에서는, 우리는 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 잠재적 인 항균 특성을 바탕으로 임플란트 - 관련 감염을 예방에 효과가있을 수 있습니다 새로운 전략을 공개. 치유를 촉진위한 잘 연구 특성으로 인해, PRP는 (생물 제품) 점점 정형 외과 수술, 치주 및 구강 수술, 악안면 수술, 플라스틱 수술, 스포츠 의학 등 임상 응용에 사용되었습니다
PRP는 임플란트 - 관련 감염을 예방 기존의 항생제 치료에 대한 고급 대안이 될 수 있습니다. PRP의 사용은 기존의 항생제 치료시에 비해 유리할 수있다PRP는 항생제 저항을 유도 할 수 있고 PRP의 항균 및 치료 - 홍보 속성이 감염 예방에 시너지 효과가있을 수 있습니다 적은 가능성이 nce. 그것은 잘 병원균과 인간의 세포가 이식 표면에 경주하는 알려져 있으며, 홍보 치유의 PRP의 속성함으로써 감염 가능성을 줄여 인간의 세포 첨부 파일을 향상 수 있습니다. 또한, PRP는 본질적으로 biocompatible하고, 안전하고 전도 할 수있는 질병의 위험에서 무료입니다.
우리의 연구를 들어, 우리는 일반적으로 정형 외과 감염에서 발견하고 PRP이 박테리아에 대한 체외 항균 속성에 있는지 여부를 검사 몇 가지 임상 박테리아 변종을 선택했습니다. 우리는 같은 혈소판 농도가 모든 샘플에 대해 얻을 수 할 수있는 두 번 원심 분리 방식을 사용하여 PRP를 준비했습니다. 우리는 일관성있는 항균 결과를 달성하고 PRP는 methi 같은 세균에 대한 시험 관내 항균 속성에 강한 것으로 나타났습니다cillin에 민감한와 methicillin - 내성 황색 포도상 구균, 그룹 연쇄상 구균과 Neisseria gonorrhoeae. 따라서, PRP의 사용은 감염을 예방하고 임플란트 - 관련 감염의 비용이 많이 드는 수술 치료의 필요성을 줄일 수있는 가능성이있을 수 있습니다.
Introduction
임플란트 - 관련 감염은 상당한 임상 합병증입니다. 포도상 구균 (S. 구균)이 임플란트 - 관련 감염으로부터 격리 가장 흔한 미생물 중 하나입니다. 그것은 임플란트의 표면을 커버하고 항생제 내성 감염 1,2으로 이어질 수있는 biofilm을 생산 할 수 있습니다. 임플란트 - 관련 감염의 치료가 자주 반복 debridements과 장기간 비경 항생제 치료 장기 입원이 필요합니다. 항생제 내성의 경우, 보형물의 제거가 필요할 수 있습니다. 항생제에 대한 박테리아의 증가 저항도 등의 질병 통제 및 예방 (CDC)의 센터에 의해 참조되었습니다 "세계에서 가장 급박 한 건강 문제 중 하나입니다." 시간이, 새로운과 효과적인 항균 요법의 개발없이, 그것은 다중 약물 내성 병원균은 기존의 항생제와 untreatable 될 가능성이 있습니다. 임플란트 - 관련 예방감염 것이 중요하며, 새로운 예방 대리인 또는 접근 방법은 이러한 감염을 예방하기 위해 필요합니다.
혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)은 뼈와 뼈 이식 치료 3-5으로 도움을 줄 수 30 성장 요인을 포함 autologous 혈액의 농도이다. 뼈 재생과 부드러운 조직 성숙을 향상시키는 PRP의 응용 프로그램이 점점 때문에 혈소판에 의해 발표 다양한 성장 요인의 높은 농도의 병원에서보고되었습니다.
PRP의 여러 특성은 PRP는 항균 특성에게 6-9있을 수 있습니다 것으로 나타났습니다. PRP는 혈소판의 큰 번호, 백혈구의 높은 농도 (세균 및 곰팡이에 대한 호스트 방어 동작을 가지고 할 수있는), 그리고 여러 항균 펩티드 7,8,10가 포함되어 있습니다. 심장 수술 환자의 큰 일대의 최근 연구에서,이 드러났다 그 상처 폐쇄 signif 동안 PRP-젤의 intraoperative 사용icantly 표면과 깊은 가슴 감염 (11)의 발생률을 감소. 이러한 이유와 관찰의 경우, 우리는 PRP는 그 잘 공부 치료 - 추진 특성 외에, 항균 특성을 가지고 가상. 감염을 방지하기 위해 PRP를 사용하는 잠재적 인 장점이 포함될 수 있습니다 :은 (i) PRP는 기존의 항생제 치료에 비해 저항을 유도 할 가능성이 적습니다. PRP의 치료 - 홍보 특성은 병원균과 인간의 세포가 이식 표면 12 질주를하고 같이함으로써 감염 가능성을 줄여 세균 첨부 파일을 방지하기 위해 인감을 제공 할 수 경우, (ii) PRP는 감염 예방에 시너지 효과가있을 수 있습니다 치유를 촉진 속성을 가지고 있습니다 13. (III) PRP는 본질적으로 biocompatible하고, 안전하고 전도 할 수있는 질병의 위험에서 무료입니다.
우리의 장기 목표는 임플란트 - 관련 infecti을 방지하기 위해 새로운 접근 방법으로 PRP를 사용하는 것입니다기능. 본 연구의 목적은 체외 항균 속성에 PRP의를 검사하기 위해, 두 번 원심 분리 방식을 사용하여 PRP를 준비하고, 이러한 항균 속성을 평가하기위한 프로토콜을 설명하는 것이 었습니다.
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Protocol
1. 준비와 PRP의 활성화
1.1 혈액 무승부
- isoflurane의 흡입 (유도를위한 O 2 2 % 유지 보수 1 %)에서 토끼를 마취.
- 20 ML의 주사기로 2 ML 0.129 M 트라이 - 나트륨 구연산을 (anticoagulent 솔루션)립니다. 트라이 나트륨 구연산 솔루션은 50 ML 증류수 H 2 O에 1.897 g 트라이 - 나트륨 구연산을 용해하고 0.22 μm 살균 필터로 필터링하여 준비가되어 있습니다.
- 70 % 에탄올을 사용하여 토끼 귀를 살균.
- 나비 바늘 (25 G) 주사기에 연결을 통해 토끼 귀 정맥에서 (예를 들면 5 ML) 혈액을 그립니다.
- 부드러운 교반하여 트라이 나트륨 구연산 솔루션으로 피를 섞는다. 혈액 및 트라이 - 나트륨 구연산 솔루션의 볼륨 비율이 9시 1분입니다.
1.2 PRP 준비 (그림 1)
- 50 ML 플라스틱 원심 분리기 튜브에 anticoagulated 혈액을 전송합니다. 10 μl의 나누어지는 해hemocytometry를 사용하여 기준 혈소판 수를 확인하기 위해 혈액.
- 스윙 아웃 로터와 원심 분리기에 실온에서 10 분 (RT) 300 XG에서 혈액을 원심 분리기. 낮은 가속 및 브레이크 속도 (그림 1)을 설정합니다.
- 원심 분리 후, 피가 3 층으로 분리된다. 아래 층은 주로 적혈구이며, 중간 층 (일반적으로 '버피 코트 "이라한다) 농축 혈소판과 백혈구로 구성하고, 상단 층은 주로 혈액의 액체 성분이 플라즈마, 그리고 혈소판 (입니다 그림 1). 세포 배양 후드에 원심 분리기 튜브를 조심스럽게 수송, 레이어를 방해하지 않습니다. 1 ML 플라스틱 pipettor를 사용하여 15 ML 플라스틱 튜브에 플라즈마의 모든 버피 코트, 그리고 2~3밀리미터 두께 적혈구 레이어를 전송합니다.
- RT에서 15 분 3,000 XG에서 이전 샘플 두 번째 시간을 원심 분리기. 상단 층 (표면에 뜨는)는 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)로 간주됩니다D는 새로운 튜브로 전송됩니다.
- PPP 2.0 X 10 6 혈소판 / μl를 (hemocytometry에 의해 결정)을 획득하는 데 사용 나머지 혈액 샘플에서 혈소판 농도를 조정하여 PRP를 구합니다.
1.3 PRP 활성화
- 1000 IU / ML의 작업 농도에 5 ML 10 % 염화칼슘과 5,000 IU 소 트롬빈을 용해하여 PRP 활성화 솔루션을 준비합니다.
- PRP와 PPP에 활성화 솔루션을 추가하고 반복적으로 PRP와 PPP-젤을 형성하기 위해 pipetting하여 솔루션을 섞는다. PRP 또는 PPP를 활성화 솔루션의 볼륨 비율이 1시 4분입니다.
2. 죽 곡선 분석을 사용하여 PRP의 체외 항균 시험 (그림 2)에서
- 멸균 inoculating 루프를 사용 S. 여러 식민지를 추가 플라스틱 관 뮐러 힌튼 국물 (MHB)의 5 ML에 자사의 하룻밤 판 문화의 구균. 소용돌이가 잠시 후 37 2 시간 동안 샘플을 품다 ° C. 다음, 박테리아 미디어의 광학 밀도 분광 광도계를 사용하여 결정하고 ~ 1 이상으로 광학 밀도로 조정 된 X 10 8 CFU / 미리 정해진 표준 곡선에 따라 ML.
- 1 개 10 6 CFU / ML을 취득과 얼음에 inoculums을 배치 PBS를 사용하여 100x 희석하십시오.
- 설정 및 살균, 일회용 5 ML 왕복 아래 폴리스티렌 튜브를 라벨 및 각 관 2 ML의 최종 볼륨에 대해 표 1에 표시된 다음 예제 그룹을 준비합니다.
- 활성화 (겔 형성)에 대한 트롬빈 솔루션 다음 폴리스티렌 튜브 먼저 PRP, PPP, 또는 PBS를 추가합니다. 다음 MHB를 추가 한 후 S. 구균의 inoculums (1 X 10 6 CFU / ML) 1 × 10 5 CFU / ML의 최종 농도를 얻을 수 있습니다.
- ° C 150 rpm으로 궤도 동요와 함께 37 튜브를 품다.
- 미리 정해진 시간 포인트 (예 : 0, 1, 2 시간)에서 반복 pipetting (이 통해 각 튜브의 솔루션을 혼합박테리아는 PRP 젤 안에 갇혀 될 수 있기 때문에 단계) 중요합니다. , 샘플의 10 μl를 멸균 0.9 %의 식염수에 순차적으로 희석하고, Tryptic 간장 한천 (TSA, 5 %의 양 피) CFU 계산을위한 플레이트로 각 희석의 100 μl 나누어지는을 피펫.
- 37 번 밤 문화 한천 플레이트 ° C 한 다음 계산과 판 식민지를 기록합니다. 플롯 X-축과 CFU / y 축에 ML에서 시간 (시간)와 logarithimic 규모 데이터입니다.
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Representative Results
PRP는 reproducibly 두 번 원심 분리 방식 (그림 1)를 사용하여 준비가되어 있습니다. PRP는 methicillin 내성 S.에 대한 체외 항균 속성에 (CFUs에서 최대 100 배 감소) 강한 제시 찾을 수 있습니다 구균 (MRSA) (그림 3)은, 그는 일반적으로 전세계 병원 14에서 발견됩니다. 마찬가지로, PRP는 methicillin에 민감한 S.에 대한 강력한 항균 특성을 가지고 구균 (MSSA), 그룹 연쇄상 구균과 Neisseria gonorrhoeae.
두 번 원심 분리 방식은 동일한 혈소판 농도 (즉, 2.0 X 10 6 혈소판 / μl)는 있지만 PRP 취득을 허용하지 농축 (~ 10 배 혈액의 기준 위, 그림 4)와 우리 일관된 항균 결과를 얻을 수 있습니다, 더 큰 차이 다른 개인 동물 (즉,에서 PRPs 중 CFU 결과에토끼)이 관찰되었습니다.
| 그룹 | PRP / PPP / PBS | MHB | MRSA inoculum |
| 제어 | ...의 어느 조금도 ... 않다 | 1800 μl | 200 μl |
| 제어 | ...의 어느 조금도 ... 않다 | 2000 μl | ...의 어느 조금도 ... 않다 |
| 제어 | PBS + 트롬빈 (200 μl) | 1600 μl | 200 μl |
| PPP | PPP + 트롬빈 (200 μl) | 1600 μl | 200 μl |
| PRP | PRP + 트롬빈 (200 μl) | 1600 μl | 200 μl |
표 1. PRP의 항균 평가를위한 실험 샘플.
1 그림. PRP의 준비가 두 번 원심 분리 절차를 사용합니다. (A) 첫 번째 원심 분리합니다. 첫 번째 원심 분리 후, 3 층이 형성되며, 상단 두 레이어 (즉, 플라즈마와 버피 코트 층)과 아래쪽 레이어 (즉, 붉은 혈액 세포 층)의 2~3mm는 두 번째 멸균 원심 분리기 튜브로 전송됩니다. (B) 두 번째 원심 분리. 두 번째 원심 분리 후, 상단 층은 새 멸균 튜브로 전송됩니다 및 PPP로 지정. 나머지는 2.0 X 10 6 혈소판 / μl의 혈소판 농도에 PPP로 조정하고 PRP로 지정되어 있습니다.
그림 2. 항균 propertie을 평가하기위한 설정 실험살인 곡선 분석을 사용하여 PRP의 s입니다. 먼저, PRP이나 PPP는 테스트 튜브에 추가되며, 즉시 트롬빈 솔루션 활성화. 다음 MHB는 세균 inoculums 뒤에 추가됩니다. 샘플 Aliquots은 다른 시간 지점에서 촬영하고 CFU 카운트에 도금되어 있습니다.
그림 3. PRP, PPP, 또는 PBS는 37 트롬빈, MHB 국물, 그리고 MRSA inoculum과 함께 살균 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 배치하고 incubated 아르 ° C 150 rpm으로 궤도 동요와. 미리 정해진 시간 포인트 (즉, 1과 2에서 시간), 시료의 aliquots는 CFU 카운트에 대한 촬영 및 도금되어 있습니다. (A) CFU 데이터와 (B) 대표 판 이미지 10 -2 희석시. MRSA의 성장의 중요한 감소 (2 시간에서 ~ 100 배) 취득 쓰겠다고g PRP는 PPP와 PBS 컨트롤에 비해. 이뿐만 아니라 MSSA, 그룹 연쇄상 구균 및 Neisseria gonorrhoeae와 같은 박테리아에 대한 사실입니다.
4 그림. 두 번 원심 분리 방식에서 준비 전체 혈액의 피 묻은 얼룩 (왼쪽)와 PRP (오른쪽). PRP는 전체 혈액에 비해 혈소판의 ~ 10 배 수 있습니다.
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Discussion
혈소판이 풍부한 혈장은 점점 그 치유 - 홍보 등록 15-17으로 인해 임상 응용에 사용되었습니다. 본 연구에서는 PRP는 감염 예방을위한 새로운 접근 방법으로 제시되었다. PRP는 MRSA, MSSA, 그룹 연쇄상 구균 및 Neisseria gonorrhoeae에 대한 강력한 항균 특성을 가지고 발견되었습니다. 기존의 항생제 치료에 비해 PRP의 주요 장점은, 감염 예방을 위해 포함 : (1) 현재 항생제 치료는 점점 더보고 항생제 저항 14,18-20 등의 도전에 직면하고 있습니다. PRP는 혈소판은 (i) PRP의 혈소판 microbicidal 단백질 등 호중구, 단핵 세포와 병원체 공격 21에 대한 방어에 중요한 역할을 T 세포 등 면역 세포에 대한 chemotactic 속성을 가지고 할 수 있기 때문에 고급 대안, 그리고 (ii) 기존의 항생제에 비해 수 microbicidal 단백질은 내가이 적은 경향이세균 막 구조 22를 변경 어려움으로 인해 박테리아 저항을 nducing. (2) PRP는 감염을 감소뿐만 아니라 상처 치유를 촉진뿐만 아니라, 모두 외상, 시간 및 돈을 측면에서 비용이 많이 드는 있습니다.
PRP는 최근 증가 관심을 모으고있다. 그러나, 혈소판의 시작 번호, anticoagulants의 사용, 백혈구의 포함과 activators 23-27의 사용을 포함 PRP 준비 프로토콜 중에서 여러 복잡한 변화가 있습니다. PRP 준비의 변형 동물과 임상 연구 28 모두 논란이 결과에 일부 기여하고있다. 그 결과, PRP 연구에 큰 문제는 변화를 제어 할 수 있습니다. 현재 연구에서, 두 번 원심 분리 방식이 수행되고, PRP의 혈소판 농도는 PRP 준비 프로토콜을 표준화하고 다양성을 제한 할 2 X 10 6 혈소판 / μl (~ 10 배 혈액의 기준 위)에서 해결되었습니다PRP 준비 인치 제시 두 번 원심 분리 방식은 간단합니다, 쉽게 다른 동물과 인간의 혈액의 PRP의 분리에 적용 할 수 있으며, 본 연구에서 토끼 PRP의 체외 항균 속성에 일관성하게되었다. 그러나, 차이는 여전히 개별 셀과 동물 사이에 다를 수 있습니다 내 또는 혈소판에서 발표 된 성장 요인 및 기타 화학 물질 때문에 발생할 수 있습니다, 일부 세포 집단 (예 백혈구) 제어되지 않았습니다. 백혈구가 직접 박테리아를 죽이는와 항원 특정 면역 반응에 관여되어 있기 때문에 백혈구 풍부한 PRP가이 연구에 준비 사용되었습니다 있습니다. 프로토콜은 상기 제 1 원심 분리 (그림 1) 후는 상단 층 (즉, 플라즈마 및 혈소판 부분)의 두 번째 원심 분리를 수행하여 백혈구 - 가난한 PRP를 얻기 위해 수정이 될 수 있습니다.
본 연구에서는, 50 ML 전체 혈액은 약 5 ML PRP를 얻을하는 데 사용 된. 혈액 볼륨이 우려 경우, 여러 동물의 풀링 된 혈액은 PRP를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 혈액 그리기 및 / 또는 원심 분리 동안 혈전 양식, 가능성이 가장 높은 일부 혈소판이 활성화 된 경우 이는 낮은 혈소판 수율이 높아집니다. 따라서, 충분한 anticoagulants 부드러운하지만 혼합 철저한는 성공적인 PRP 절연을위한 중요한 단계입니다.
PRP는 본 연구에서 트롬빈을 사용하여 활성화되었습니다. 칼슘 염화물 칼슘 염화물에 상관없이 외인성 또는 autologous 트롬빈, 기계적 스트레스 (추가 고속 원심 분리), 그리고 batroxobin 등 다른 방법도 PRP 활성화 29-32에 적용 할 수 있습니다. 트롬빈에 의해 활성화 혈소판 가능성이 더 빠른 다른 화학 물질에 의해 활성화 혈소판보다 훨씬 자신의 과립의 내용을 공개 할 수도 있습니다. 원인은 달리고, 그리고 섬유소를 피브리노겐에 VIIIa, V에 쌰, VIII에 XI 요소를 변환하기위한 기능 외에, 트롬빈은 혈소판을 통해 활성화 및 집계를 홍보 할 수 있다는 것입니다혈소판 세포 멤브레인 33-35에서 단백 분해 효소 활성화 수용체의 ctivation.
살인 곡선 분석은 PRP의 체외 항균 활동을 평가하기 위해 제시되었다. 한천 디스크 확산 분석과는 달리, 살인 곡선 분석은 시간이 지남에 bactericidal 활동의 속도의 양적 평가를 할 수 있습니다. CFUs를 계산하면 샘플 전에 활발한 pipetting하여 철저하게 전체 문화를 혼합하는 것입니다 때 제대로 세균을 분산하는 한 중요한 단계는 PRP 젤 년 5 월 혼동 제대로 박테리아를 분산하는 사람의 능력으로, 시리얼 dilutions을 위해 그려와 vortexed 있습니다.
전반적으로, 혈소판이 풍부한 혈장은 S. 등의 세균에 대한 강력한 항균 특성을 가지고 구균, 그룹 연쇄상 구균과 Neisseria gonorrhoeae. 는 잘 공부 치료 - 추진 특성 외에, PRP는 임플란트 - 관련 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 사용할 수 있습니다. PRP의 항균 속성의 메커니즘 s입니다이 지역의 알 수없는 및 추가 조사가 필요합니다 때까지.
본 연구의 한계 PRP 완전히 (1 × 10 5 CFU / ML)의 실험 조건 하에서 박테리아를 제거하지 않은 있습니다. 이 사용되었습니다 우리의 임상 박테리아 변종의 높은 독성으로 인해 수 있습니다, S. 1 X 10 2 CFU (0.1 ML) 구균은 생체 36-38에 심각한 감염을 유발. 또는 PRP의 양이 더 나은 세균 제거, 또는 PRP는 감염 방지를 위해 기존 항생제의 조직 또는 지역 관리와 함께 사용할 수 있습니다 달성하기 위해 증가 될 수있다, PRP의 이중 효과는 (즉, 항균 및 치료 - 홍보 속성) 바람직 할 수있다 감염을 방지하면서 치료를 촉진 인치 또 다른 제한은 PRP가 이미 (예 : 패혈증 환자) 체계적으로 감염된 환자를 사용할 수 없습니다 때문입니다. 피에 박테리아가 통과 될 수 있기 때문입니다에드 적절한 살균 기술이 적용되지 않는 PRP에서 응용 프로그램 사이트에 있습니다. 우리는 사용하기 전에 PRP의 가능한 세균 contaminations을 조심 검사를하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 Therwa 함자, 존 E. Tidwell, 니나 클로비스, 그리고 실험 지원 및 교정을위한 수잔 스미스 수잔 스미스 감사드립니다. 저자는 자신의 지원과 미생물학, 면역학 및 웨스트 버지니아 대학에서 세포 생물학의 부에있는 생물 안전 실험실의 사용에 대한 세균의 임상 격리하고 존 B. 바넷, 박사 학위를 제공하는 존 토마스, 박사 학위를 감사합니다. 저자 Osteosynthesis 및 외상 관리 재단과 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (# 1003907)에서 재정 지원을 인정합니다. 현미경 실험 및 이미지 분석도 메리 Babb 랜돌프 암 센터와 NIH 보조금 P20 RR016440에 의해 부분적으로 지원되는 웨스트 버지니아 대학 이미징 시설에서 수행되었다.
피를 동물 사용은 웨스트 버지니아 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다립니다. 모든 실험은 모든 관련 guidelin을 준수 실행 된어, 규정 및 규제 기관.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine thrombin | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | Thrombin (bovine origin) |
| Calcium chloride | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | 10% calcium chloride |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Mueller Hinton broth | Becton, Dickinson and Company | 275710 | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | R01202 | |
| Centrifuge | Kendro Laboratory Products | 750043077 | |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RS |
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