Summary
植入相关感染是一个重要的临床并发症。这项研究描述了一种方法，使用富血小板血浆（PRP），以防止植入物相关感染，给出了协议，准备PRP血小板浓度不变，并报告新发现的抗菌性能的PRP和检查等抗菌性能的相关协议
Abstract
植入相关感染已成为全球范围内的医疗保健行业越来越具有挑战性由于越来越大的抗药性，抗生素有抗药性的细菌，动物和人类之间传播的，成本高，治疗感染。
在这项研究中，我们公开了一种新的策略，在防止植入物相关感染的基础上的潜在的富血小板血浆（PRP）的抗菌性能，可能是有效的。由于其促进愈合的研究，PRP（生物制品）已经被越来越多地用于临床应用，包括骨科手术，牙周和口腔外科，口腔颌面外科手术，整形外科，运动医学等。
PRP可能是一个先进的替代传统的抗生素治疗，防止植入相关感染。比常规抗生素治疗州市的PRP的使用可能是有利的NCE PRP是不太可能诱导抗生素耐药性和PRP的抗菌和愈合促进性能可能具有协同作用对预防感染。这是众所周知的，病原体和人类细胞竞相种植体表面，和PRP促进愈合的属性可以改善人类的细胞附着，从而减少了感染的几率。此外，PRP是固有的生物相容性，安全，无传染性疾病的风险。
我们的研究中，我们选择了一些临床中常见的骨科感染的细菌菌株和PRP检查是否有对这些细菌的体外抗菌性能。我们已经准备好PRP使用两次离心的做法，让所有的样品中获得相同的血小板浓度。我们已经取得了抗菌剂的研究结果一致，发现PRP具有较强的体外抗菌性能，对细菌，如methi的Cillin的敏感和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，A组链球菌 ， 淋球菌 。因此，使用的PRP可能有潜力以防止感染和昂贵的手术后的植入物相关的感染的治疗，以减少需要。
Introduction
种植体相关感染是一个显着的临床并发症。 金黄色葡萄球菌 （ 金黄色葡萄球菌 ）是孤立从植入物相关感染的最常见的微生物之一，。它是能够生产覆盖的植入物的表面，并可能会导致抗生素耐药性的感染1,2的生物膜。植入相关感染的治疗往往需要长期住院，反复清创术和静脉抗生素治疗时间延长。在抗生素有抗药性的情况下，去除植入物可能是必要的。上升抗生素对细菌的抵抗力也被称为中心疾病控制和预防中心（CDC）为“世界上最紧迫的健康问题之一。”随着时间的推移，如果没有新的有效的抗菌治疗的发展，它是多药耐药病原体与传统的抗生素是无法治愈的。植入相关的预防因此，感染是重要的和新的预防剂或方法是必要的，以防止这类感染。
富血小板血浆（PRP）是一个包含超过30的生长因子，可以帮助骨和骨移植愈合3-5的自体血浓度。已越来越多地在诊所报告，因为它的高浓度的各种生长因子，由血小板释放的PRP中的应用，以提高骨再生和软组织的成熟。
PRP几个特点表明，PRP可能还具有抗菌特性6-9。 PRP中包含了大量的血小板，白细胞高浓度的（其可以具有对细菌和真菌的宿主防御动作），和多个抗菌肽7,8,10。在最近的一大群心脏手术患者的研究中，据透露，术中使用PRP凝胶伤口愈合的显icantly的发病率下降的浅表和深部胸骨感染11。由于这些原因和观察，我们推测 ，PRP，除了其研究的愈合特性，具有抗菌性能。使用PRP，以防止感染的潜在优势，可包括：（ⅰ）PRP是不太可能诱导电阻相比，传统的抗生素治疗。 （ 二 ）PRP也有属性，促进愈合其中可能有一个协同效应对预防感染; PRP的愈合，促进属性可以提供密封，以防止细菌附着从而降低的几率为感染作为病原体和人类的细胞都竞相植入物表面12 ，13。 （ 三 ）PRP是固有的生物相容性，安全，无传染性疾病的风险。
我们的长期目标是使用PRP作为一种新的方法，以防止植入物相关infecti组件。本研究的目的是准备PRP使用两次离心的方法，检查PRP的体外抗菌性能，并描述协议，以评估这种抗菌性能。
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Protocol
1。 PRP的制备和激活
1.1抽血
- 麻醉家兔吸入异氟醚（2％O 2诱导和维护的1％）。
- 绘制2毫升0.129中号柠檬酸三钠（一种抗凝血剂的溶液）放入20毫升注射器。的柠檬酸三钠溶液的制备通过1.897克柠檬酸三钠溶解在50毫升蒸馏H 2 O，并用0.22μm的无菌过滤器过滤。
- 用70％乙醇消毒的兔耳。
- 绘制血液（ 例如 5毫升）通过连接到注射器的蝴蝶针（25 G）从兔耳缘静脉。
- 混血的柠檬酸三钠溶液中轻轻搅拌。血液和柠檬酸三钠溶液的体积比为9:1。
1.2 PRP制备（ 图1）
- 抗凝固处理的血液转移至50ml塑料离心管中。以10微升的等分试样血以确定基线血小板计数hemocytometry。
- 离心血在300×g离心10分钟，在室温（RT）在离心分离机的摆动离开转子。设置加速和制动速度为低（ 图1）。
- 离心分离后，血液被分离成三层。底层是主要的红血细胞，中间层（通常简称为“血沉棕黄层”）组成的浓缩血小板和白细胞，顶端层主要是等离子体，这是血液中的液体成分，和血小板（ 图1）。离心管小心地运送到细胞培养罩;不打扰层。塑料移液器使用1毫升到15毫升塑料管，将所有的血浆，棕黄色的大衣，和2-3毫米厚的红血细胞层。
- 离心传输的示例的第二时间，以3,000 xg离心15分钟，在RT。顶层（上清液），贫血小板血浆（PPP）被视为d被转移到新的管中。
- 获得PRP通过使用PPP，得到2.0×10 6血小板/μl（确定hemocytometry），在其它的血液试样中的血小板浓度调节。
1.3 PRP激活
- 准备PRP激活溶液用5毫升10％的氯化钙溶解5000 IU牛凝血酶的工作浓度1,000 IU / ml的。
- 添加活化液PRP和PPP，并反复吹打形成PRP和PPP凝胶混合溶液。 PRP或PPP的激活溶液的体积比为1:4。
2使用kill曲线法的PRP 的体外抗菌试验（ 图2）
- 用无菌接种环，增加数个殖民地的S.黄色葡萄球菌从它的平板培养过夜到5毫升的Mueller Hinton肉汤（MHB）的塑料管中。涡简要然后在37℃下孵育2小时样品下，细菌的介质的光密度，使用分光光度计测定，并调整至光密度等于〜1×10 8 CFU / ml为根据预先确定的标准曲线。
- 100倍稀释液，使用PBS，得到1×10 6 CFU /毫升的接种物并放置在冰上。
- 设置和无菌，一次性5 ml圆底聚苯乙烯管贴上标签，准备以下的样本组如表1中所示，在每个试管的最终体积为2ml。
- 加入PRP和PPP，或PBS第一聚苯乙烯管中，然后由用于激活的凝血酶溶液（凝胶的形成）。接下来，添加MHB，然后S.黄色葡萄球菌接种物（1×10 6 CFU /毫升），得到的最终浓度为1×10 5 CFU /毫升。
- 孵育在37℃下在150 rpm的搅拌与轨道管。
- 在预先确定的时间点（ 例如，0，1，和2小时），每个试管中混合的解决方案通过重复吸移的（这步骤是非常重要的，因为细菌可能会被困在里面的PRP凝胶）。取10微升的样品，用无菌的0.9％的生理盐水稀释串联，和移液100微升等分的各稀释到胰蛋白酶大豆琼脂（TSA，用5％羊血）CFU计数板。
- 文化的琼脂平板上，在37℃下过夜，然后计算和记录板菌落。标绘数据上logarithimic规模上的x轴和CFU /毫升在y-轴的时间（hr）。
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Representative Results
PRP的可重复使用两次离心的方法（ 图1）的制备。 PRP的发现呈现强（高达100倍减少的CFUs） 在体外的抗菌性能，对耐甲氧西林S.黄色葡萄球菌 （MRSA）（ 图3），这是常见的在世界各地的医院14。同样，，PRP具有较强的抗菌性能，对甲氧西林敏感的S.金黄色葡萄球菌 （MSSA），A组链球菌 ， 淋球菌 。
两次离心的方法使相同的血小板浓度（ 即 2.0×10 6血小板/μl），但收购PRP的浓度（血液中的基线〜10倍以上; 图4），使我们能够获得抗菌剂的研究结果一致，无显着差异在CFU结果之间的PRPs从不同的动物个体（ 即兔）中已观察。
| 组 | PRP / PPP / PBS | MHB | MRSA菌 |
| 控制 | 无 | 1800微升 | 200微升 |
| 控制 | 无 | 2000微升 | 无 |
| 控制 | PBS +凝血酶（200μl）中 | 1600微升 | 200微升 |
| PPP | PPP +凝血酶（200微升） | 1600微升 | 200微升 |
| PRP | PRP +凝血酶（200微升） | 1600微升 | 200微升 |
表1中。实验样品的抗菌评估PRP。
图1。 PRP准备使用两次离心过程。（A）第一离心。第一次离心后，形成有3层，并且顶部的两个层（ 即血浆和血沉棕黄层）和2-3毫米的底部层（ 即红血细胞层）被转移到第二个无菌离心管中。 （乙）第二离心。第二离心分离后，最佳的层被转移到新的无菌管中，并指定为PPP。剩余的用PPP调节血小板浓度2.0×10 6血小板/μl，并指定为PRP。
图2。评估的抗菌性质的实验装置s的PRP使用kill曲线法。首先，PRP或PPP被添加到试管中，并立即激活的凝血酶溶液。接着，MHB接着加入由细菌的接种物。的样品的等分试样在不同的时间点，并采取镀CFU计数。
图3。 PRP和PPP，或PBS放置一起凝血酶，MHB肉汤，和MRSA接种在无菌的5毫升聚苯乙烯试管中，然后孵育在37在预先确定的时间点（ 即 1和2℃下用轨道在150 rpm的搅拌。小时），等分样品，镀CFU计数。 CFU数据（A）和（B）代表板图像在10 -2稀释。显着降低（〜100倍，在2小时），MRSA增长得到全光照克PRP相比，PPP和PBS对照。这是真实的为MSSA，A组链球菌 ， 淋病奈瑟菌和细菌一样。
图4。的全血的血涂片（左）和两次离心的方法从制备PRP（右）。PRP具有〜10倍的数量相比，全血的血小板。
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Discussion
富血小板血浆已被越来越多地用于临床的应用，由于其促进愈合的特性15-17。在本研究中中，PRP提出了一种新的方法预防感染。 PRP发现对MRSA，MSSA，A组链球菌 ， 淋病奈瑟菌有较强的抗菌性能。 PRP的主要优势在于，相对于传统的抗生素治疗，预防感染包括：（1）目前的抗生素治疗所面临的挑战，包括日 益抗生素的耐药性14,18-20。 PRP可能是一个先进的替代品，因为（我）PRP的血小板杀菌蛋白可能具有趋化性质的免疫细胞如中性粒细胞，单核细胞和Ţ细胞其中发挥了重要作用，抵御病原体入侵21，（II）相比，传统的抗生素，血小板抗微生物蛋白是不易到inducing细菌的耐药性，由于在改变细菌膜结构22的难度。 （2）PRP不仅降低了感染，但也促进伤口愈合，创伤小，时间和金钱，是昂贵的。
PRP最近吸引的兴趣不断增加。但是，也有许多复杂的PRP制备的协议，包括起始的血小板数，使用抗凝剂，列入白细胞，和活化剂的使用23-27之间变化。的变化在PRP准备有助于在有争议的部分成果在动物实验和临床研究28。因此，一个大的PRP研究的问题是控制的变化。在目前的研究中，进行两次离心分离的方法，以及固定的PRP的血小板浓度在2×10 6个血小板/微升（〜10倍以上的在血液中的基线）的标准化的PRP制备的协议和限制的变异在PRP准备。两次离心介绍的方法很简单，可以很容易地适用于其他动物和人类的血液PRP隔离，在本研究中兔PRP的体外抗菌性能，并一致。然而，分歧仍然存在，因为化学品在或释放血小板可能会有所不同个体的细胞和动物的生长因子和其他一些细胞群（ 如白细胞）未得到控制。注意，富含白细胞的PRP制备和使用在本研究中，由于白细胞参与直接杀死细菌和抗原特异性免疫应答。的协议可进一步修改，以获得白血球穷人PRP只有顶层（ 即血浆和血小板部）（ 图1）第一次离心后进行的第二离心。
在这项研究中，使用了50毫升的全血，得到约5ml PRP。如果血液量是一个问题，汇集多种动物的血液可以用来准备PRP。如果凝块形式在抽血过程中和/或离心，最有可能一些血小板被激活，这将导致在低血小板收率。因此，足够的抗凝血剂和温和而彻底的混合是成功的PRP隔离的重要步骤。
PRP在本研究中使用的凝血酶激活。也可应用于其他方法，包括氯化钙，氯化钙带或不带外源或自体的凝血酶，机械应力（额外的高速离心），巴曲酶为PRP激活29-32。请注意，血小板凝血酶激活的，很可能释放其颗粒内容物比由其他化学品的血小板激活快得多。其原因是，除了其能力转换到夏，VIII因子XI VIIIA部，V，Va和纤维蛋白原纤维蛋白，凝血酶通过可促进血小板活化和聚集ctivation蛋白酶激活的血小板细胞膜上的受体33-35。
杀菌曲线分析，提出了评估的PRP的体外抗菌活性。不同的是琼脂纸片扩散法，杀曲线法允许的杀菌活性，随着时间的推移率的定量评估。绘制的一个关键步骤，妥善分散细菌计数CFU的是整个文化浑厚的移液彻底混合样品前，涡旋系列稀释，PRP凝胶可能会混淆一个人的能力适当地分散细菌。
总体而言，富血小板血浆对细菌具有较强的抗菌性能， 如 S 金黄色葡萄球菌 ，A组链球菌 ， 淋球菌 。除了其研究的愈合特性，，PRP可作为一种新的方法，以防止植入物相关感染。 PRP的抗菌性能的机制是直到未知的，在这方面的进一步调查是必要的。
本研究的限制包括，PRP没有完全消除的细菌在我们的实验条件下（1×10 5 CFU /毫升）。这可能是由于所使用的高毒力的我们的临床菌株; 1×10 2 CFU（0.1毫升）的S.金黄色葡萄球菌引起的严重感染， 体内 36-38。可替换地，富血小板血浆的量可以增加，以实现更好的细菌消除，或PRP可以一起使用，与全身或局部给药的常规抗生素预防感染;的PRP的双重影响（ 即抗菌和愈合促进性能）可能是有利的在促进愈合，同时防止感染。另一个限制是，不应该使用PRP谁已经全身感染（ 例如脓毒症患者）的患者。这是因为血液中的细菌可能会通过从PRP的应用程序，除非有适当的消毒技术应用。我们建议仔细检查前使用的PRP可能的细菌污染。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
感谢Therwa哈姆扎，约翰·E. TIDWELL，尼娜克洛维斯，和苏珊·史密斯的实验援助和苏珊·史密斯校对。作者还感谢提供临床分离的细菌和约翰·B·巴尼特博士对他的支持和使用的生物安全实验室在西弗吉尼亚大学微生物学，免疫学和细胞生物学系的约翰·托马斯博士。作者承认金融支持接骨和创伤护理基金会和美国国家科学基金会（＃1003907）。显微镜实验和图像分析技术在西弗吉尼亚大学的成像设备，这是支持部分的玛丽巴布伦道夫癌症中心和美国国立卫生研究院授予P20 RR016440。
动物使用的血液提请批准了西弗吉尼亚大学实验动物护理和使用委员会。所有的实验被处决符合所有相关guidelin的ES，法规和监管机构。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine thrombin | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | Thrombin (bovine origin) |
| Calcium chloride | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | 10% calcium chloride |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Mueller Hinton broth | Becton, Dickinson and Company | 275710 | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | R01202 | |
| Centrifuge | Kendro Laboratory Products | 750043077 | |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RS |
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