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Immunology and Infection

PRP als neuer Ansatz, um eine Infektion zu verhindern: Vorbereitung und doi: 10.3791/50351 Published: April 9, 2013

Summary

Implantat-assoziierten Infektion ist eine signifikante klinische Komplikation. Diese Studie beschreibt einen Ansatz mit plättchenreichem Plasma (PRP) zu implantieren-assoziierten Infektionen zu verhindern, stellt das Protokoll zur Herstellung PRP mit konstanter Blutplättchenkonzentration, und meldet die neu identifizierten antimikrobiellen Eigenschaften von PRP und verwandten Protokollen für die Prüfung wie antimikrobielle Eigenschaften

Abstract

Implantat-assoziierte Infektion wird immer schwieriger, die Healthcare-Industrie weltweit durch die zunehmende Antibiotika-Resistenz, die Übertragung von Antibiotika-resistenten Bakterien zwischen Tieren und Menschen, und die hohen Kosten der Behandlung von Infektionen.

In dieser Studie offenbaren wir eine neue Strategie, die wirksam bei der Verhinderung Implantat-assoziierten Infektion basierend auf den potentiellen antimikrobiellen Eigenschaften von plättchenreichem Plasma (PRP) kann. Aufgrund seiner gut untersuchten Eigenschaften zur Förderung der Heilung hat PRP (ein biologisches Produkt) zunehmend für klinische Anwendungen einschließlich der orthopädischen Operationen, parodontalen und oralen Chirurgie, Kiefer-Operationen, Schönheitsoperationen, Sportmedizin, etc. verwendet

PRP könnte eine erweiterte Alternative zu herkömmlichen Antibiotika zu verhindern Implantat-assoziierten Infektionen. Der Einsatz von PRP kann vorteilhaft sein, im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika since PRP ist weniger wahrscheinlich zu Antibiotikaresistenz induzieren und PRP Die antimikrobielle und Heilung fördernden Eigenschaften können einen synergistischen Effekt auf die Infektionsprävention haben. Es ist wohlbekannt, daß Erreger und menschliche Zellen werden für Implantatoberflächen Renn, und PRP die Eigenschaften der Förderung der Heilung könnte menschlichen Zellanheftung zu verbessern wodurch die Chancen für Infektion. Darüber hinaus ist PRP inhärent biokompatibel und sicher und frei von der Gefahr von übertragbaren Krankheiten.

Für unsere Studie haben wir verschiedene klinische Bakterienstämme, die üblicherweise in der orthopädischen Infektionen gefunden und untersucht, ob PRP in vitro antimikrobielle Eigenschaften gegen diese Bakterien ausgewählt hat. Wir haben PRP hergestellt unter Verwendung eines doppelten Zentrifugation Ansatz, der die gleiche Thrombozytenkonzentration für alle Proben erhalten werden können. Wir haben konsequente antimikrobielle Ergebnisse erreicht und festgestellt, dass PRP starke weist in vitro eine antimikrobielle Eigenschaften gegen Bakterien wie methicillin-sensitiv und Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus, Streptococcus der Gruppe A, und Neisseria gonorrhoeae. Daher kann der Einsatz von PRP haben das Potenzial, Infektion zu verhindern und die Notwendigkeit für kostspielige Nachbehandlung von Implantat-assoziierten Infektionen zu reduzieren.

Introduction

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Implantat-assoziierten Infektion eine signifikante klinische Komplikation. Staphylococcus aureus (S. aureus) ist eine der häufigsten Mikroorganismen aus Implantat-assoziierten Infektionen isoliert. Es ist geeignet zur Herstellung einer Biofilm, die die Oberflächen von Implantaten abdeckt und kann zu antibiotikaresistenten Infektion 1,2 führen. Behandlung von Implantat-assoziierten Infektionen erfordert häufig langfristige Krankenhausaufenthalte für wiederholte Debridements und verlängerte parenterale antibiotische Therapie. In antibiotikaresistente Fällen kann die Entfernung des Implantats erforderlich sein. Die steigende Resistenz von Bakterien gegen Antibiotika hat auch wurde von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) als "eines der weltweit drängendsten Gesundheitsprobleme." In der Zeit, ohne die Entwicklung von neuen und wirksame antimikrobielle Behandlungen, ist es möglich, dass multiresistenten Krankheitserreger werden mit herkömmlichen Antibiotika behandelbar. Prävention von Implantat-assoziiertenInfektion ist daher wichtig und neuartige prophylaktische Mittel oder Ansätze zur Verhinderung solcher Infektionen benötigt.

Platelet-Rich Plasma (PRP) ist eine Konzentration von Eigenblut, die über 30 Wachstumsfaktoren, die mit Knochen und Knochenersatzmaterialien Heilung 3-5 helfen kann enthält. Die Anwendung des PRP, um Knochenregeneration und Weichgewebe Reifung Verbesserung wurde zunehmend in Kliniken wegen seiner hohen Konzentration verschiedener Wachstumsfaktoren durch Plättchen freigesetzt gemeldet.

Mehrere Merkmale des PRP zeigen, dass PRP kann auch antimikrobielle Eigenschaften 9.6. PRP enthält eine Vielzahl von Plättchen, die eine hohe Konzentration von Leukozyten (der Host-Abwehrmaßnahmen gegen Bakterien und Pilze besitzen) und mehrere antimikrobielle Peptide 7,8,10. In einer aktuellen Studie von einer großen Kohorte von herzchirurgischen Patienten zeigte sich, dass die intraoperative Anwendung von PRP-Gel während Wundverschluss significantly verringert das Auftreten von oberflächlichen und tiefen Brustbein Infektion 11. Aus diesen Gründen und Beobachtungen stellten wir die Hypothese, dass PRP, neben seiner gut untersuchten die Heilung fördernden Eigenschaften hat antimikrobielle Eigenschaften. Die potentiellen Vorteile der Verwendung von PRP eine Infektion verhindern können gehören: (i) PRP ist weniger wahrscheinlich, Resistenz zu induzieren im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika. (Ii) PRP hat auch Eigenschaften, Heilung, die eine synergistische Wirkung auf Infektionsprävention aufweisen kann fördern; PRP die Heilung fördernden Eigenschaften könnten eine Dichtung zu schaffen, um bakterielle Anbringung verhindern wodurch die Chancen für Infektion als Krankheitserreger und menschlichen Zellen für Implantatoberflächen 12 sind Rennen , 13. (Iii) PRP ist inhärent biokompatibel und sicher und frei von der Gefahr von übertragbaren Krankheiten.

Unser langfristiges Ziel ist es, PRP als neuer Ansatz verwenden, um Implantat-assoziierten infecti verhindernons. Das Ziel dieser Studie war es, PRP Vorbereitung mit einem doppelten Zentrifugation Ansatz, PRP in vitro antimikrobielle Eigenschaften zu untersuchen und die Protokolle zur Auswertung wie antimikrobielle Eigenschaften zu beschreiben.

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Protocol

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Ein. Vorbereitung und Aktivierung von PRP

1,1 Blutentnahme

  1. Anesthetize Kaninchen durch Inhalation von Isofluran (2% in O 2 für die Induktion und 1% für Wartung).
  2. Ziehe 2 ml 0,129 M Tri-Natriumcitrat (ein anticoagulent Lösung) in einen 20-ml-Spritze. Die Tri-Natriumcitrat-Lösung wird durch Auflösen von 1,897 g Trinatriumcitrat in 50 ml destilliertem H 2 O und eine Filterung mit einer 0,22 um Sterilfilter hergestellt.
  3. Sterilisieren rabbit ear mit 70% Ethanol.
  4. Ziehen Blut (zB 5 ml) aus dem Kaninchen Ohrvene über einen Butterfly-Nadel (25 G), die mit der Spritze.
  5. Mischen Sie das Blut mit dem tri-Natriumcitrat-Lösung durch vorsichtiges Schütteln. Das Volumenverhältnis von Blut und Tri-Natriumcitrat-Lösung ist 9:1.

1,2 PRP Zubereitung (Abbildung 1)

  1. Übertragen der antikoaguliertem Blut zu einer 50-ml-Kunststoffröhrchen Zentrifugenröhrchen. Nehmen Sie ein Aliquot von 10 ulBlut in den Thrombozytenausgangswert mit hemocytometry bestimmen.
  2. Zentrifuge das Blut bei 300 xg für 10 min bei Raumtemperatur (RT) in einer Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor. Stellen Sie die Beschleunigung und Bremse Geschwindigkeit zu niedrig ist (Abbildung 1).
  3. Nach Zentrifugation wird das Blut in drei Schichten getrennt. Die untere Schicht ist hauptsächlich roten Blutkörperchen wird die mittlere Schicht (gemeinhin als "Leukozytenmanschette" bezeichnet) von konzentrierten Blutplättchen und Leukozyten besteht und die oberste Schicht ist hauptsächlich Plasma, welches die flüssige Komponente des Blutes ist, und Plättchen ( Abbildung 1). Vorsichtig transportieren Zentrifugenröhrchen zu einer Zellkultur Kapuze; nicht stören die Schichten. Übertragen das Plasma, Buffy-Coat und 2-3 mm dicke Schicht roter Blutkörperchen in einem 15 ml Plastikröhrchen mit einer 1 ml Kunststoff-Pipette.
  4. Zentrifuge die übertragenen Probe ein zweites Mal bei 3000 xg für 15 min bei RT. Die obere Schicht (Überstand) wird als plättchenarmes Plasma (PPP) eind wird in ein neues Röhrchen überführt.
  5. PRP erhalten durch Einstellen der Blutplättchenkonzentration in dem verbleibenden Blutprobe mittels PPP bis 2,0 x 10 6 Blutplättchen / ul (bestimmt durch hemocytometry) zu erhalten.

1,3 PRP-Aktivierung

  1. Planen PRP Aktivierung durch Auflösen 5.000 IU bovines Thrombin mit 5 ml 10% Calciumchlorid der Arbeitskonzentration von 1.000 IU / ml.
  2. Fügen Sie die Aktivierung Lösung PRP und PPP, und mischen Sie die Lösung durch wiederholtes Pipettieren zu PRP und PPP-Gele bilden. Das Volumenverhältnis der Aktivierungslösung zum PRP oder PPP ist 1:4.

2. In vitro Antimicrobial Test der PRP mit kill Curve Assay (Abbildung 2)

  1. Mit einer sterilen Impföse, fügen Sie mehrere Kolonien von S. aureus von seinem Plattenkultur über Nacht in 5 ml Mueller-Hinton-Bouillon (MHB) in einem Kunststoffrohr. Vortex kurz und dann inkubieren Sie die Probe für 2 Stunden bei 37 ° C. NächsteDie optische Dichte der Bakterien-Medium wurde mit einem Spektralphotometer und auf eine optische Dichte von ~ 1 × 10 8 CFU / ml auf der vorbestimmten Standardkurve berechnet.
  2. Machen Sie eine 100x Verdünnung mit PBS auf 1 x 10 6 CFU / ml zu erhalten und legen Sie die Inokulums auf Eis.
  3. Einrichten und beschriften sterilen Einweg 5 ml Rundkolben Polystyrolröhrchen, und bereiten Sie die folgenden Beispieldaten Gruppen, wie in Tabelle 1 für ein Endvolumen von 2 ml in jedem Röhrchen angegeben.
  4. Hinzufügen PRP, PPP, oder PBS ersten bis Polystyrolröhrchen, durch den Thrombin-Lösung zur Aktivierung (Gelbildung) gefolgt. Als Nächstes fügen MHB und dann die S. aureus Impfkulturen (1 x 10 6 CFU / ml), um die Endkonzentration von 1 × 10 5 CFU / ml.
  5. Die Röhrchen bei 37 ° C unter kreisförmigen Schütteln bei 150 Upm.
  6. Zu vorbestimmten Zeitpunkten (zB 0, 1, und 2 h), Mischen der Lösungen in jedem Rohr über Wiederholung Pipettieren (dieserSchritt ist wichtig, da Bakterien in dem PRP-Gel eingeschlossen werden kann). Nehmen Sie sich 10 ul Probe verdünnen seriell mit steriler 0,9% iger Kochsalzlösung und pipettieren 100 ul Aliquot jeder Verdünnung auf eine CASO-Agar (TSA mit 5% Schafblut) Platte für CFU Zählen.
  7. Kultur die Agarplatten über Nacht bei 37 ° C, dann zählen und notieren Sie die Platte Kolonien. Plotdaten auf einer Skala mit logarithimic Zeit (h) auf der x-Achse und CFU / ml auf der y-Achse.

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Representative Results

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PRP wird reproduzierbar hergestellt unter Verwendung einer doppelten Zentrifugation Ansatz (Abbildung 1). PRP wird festgestellt präsentieren starke (bis zu 100-fache Verringerung der KBE) in vitro antimikrobielle Eigenschaften gegen Methicillin resistenten S. aureus (MRSA) (Abbildung 3), die üblicherweise in Krankenhäusern weltweit 14 gefunden. Ebenso hat PRP starke antimikrobielle Eigenschaften gegen Methicillin sensiblen S. aureus (MSSA), Gruppe A Streptococcus und Neisseria gonorrhoeae.

Der zweimalige Zentrifugation Ansatz ermöglicht Erwerb von PRP mit der gleichen Thrombozytenkonzentration (dh 2,0 x 10 6 Thrombozyten / ul), sondern konzentriert (~ 10 Mal über der Basislinie im Blut; Abbildung 4) und ermöglicht uns eine konsequente antimikrobielle Erkenntnisse zu erhalten; keine signifikanten Unterschiede in CFU Befunde bei PRPs aus verschiedenen einzelnen Tieren (dhKaninchen) wurden beobachtet.

Gruppen PRP / PPP / PBS MHB MRSA Inokulum
Steuern Keiner 1.800 ul 200 ul
Steuern Keiner 2.000 ul Keiner
Steuern PBS + Thrombin (200 ul) 1.600 ul 200 ul
PPP PPP + Thrombin (200 ul) 1.600 ul 200 ul
PRP PRP + Thrombin (200 ul) 1.600 ul 200 ul

Tabelle 1. Experimentelle Proben für antimikrobielle Beurteilung der PRP.


Abbildung 1. PRP-Präparat unter Verwendung einer doppelt Zentrifugationsverfahren. (A) Erste Zentrifugation. Nach der ersten Zentrifugation werden drei Schichten gebildet ist und die beiden oberen Schichten (dh Plasma und Buffy-Coat-Schichten) und 2-3 mm von der unteren Schicht (dh rote Blutkörperchen-Schicht) mit einer zweiten sterilen Zentrifugenröhrchen überführt. (B) Zweite Zentrifugation. Nach der zweiten Zentrifugierung wird die Deckschicht auf eine neue sterile Röhrchen überführt und als PPP. Das verbleibende wird mit einem PPP Thrombozytenkonzentration von 2,0 x 10 6 Blutplättchen / ul eingestellt und als PRP.

Abbildung 2
Abbildung 2. Versuchsanordnung für die Bewertung der antimikrobiellen properties unter Verwendung von PRP das Kill Kurve Assay. Zuerst wird PRP oder PPP zu den Teströhrchen gegeben und sofort mit Thrombinlösung aktiviert. Als nächstes wird MHB zugegeben, gefolgt von bakteriellen Inokulums. Aliquots von Proben zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und ausplattiert für CFU zählt.

Abbildung 3
Abbildung 3. PRP, PPP, oder PBS in einer sterilen 5 ml Polystyrolröhrchen zusammen mit Thrombin, MHB Brühe und MRSA Inokulums gegeben und dann bei 37 ° C unter kreisförmigen Schütteln bei 150 Upm. Zu vorbestimmten Zeitpunkten (zB 1 und 2 h) werden Aliquots entnommen und für CFU Zählungen ausplattiert. (A) CFU Daten und (B) repräsentative Platte Bildern bei 10 -2 Verdünnung. Signifikante Reduktion (~ 100-fach bei 2 h) von MRSA Wachstum erhalten using PRP, PPP-und PBS-Kontrollen verglichen. Dies gilt für Bakterien wie MSSA, Gruppe A Streptococcus und Neisseria gonorrhoeae sowie.

Abbildung 4
Abbildung 4. Blutausstrichen Vollblut (links) und PRP (rechts). PRP aus der zweifach Zentrifugation Ansatz hergestellte ~ 10 Mal die Anzahl der Thrombozyten im Vergleich zum Vollblut.

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Discussion

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Platelet-Rich Plasma wurde zunehmend für klinische Anwendungen aufgrund seiner Heilung fördernden Eigenschaften 15-17 verwendet. In der vorliegenden Studie wurde PRP als neuer Ansatz für die Infektionsprävention vorgestellt. PRP wurde festgestellt, dass starke antimikrobielle Eigenschaften gegen MRSA, MSSA, Gruppe A Streptococcus und Neisseria gonorrhoeae haben. Die wichtigsten Vorteile von PRP im Vergleich zu konventionellen Antibiotika, für Infektionsprävention gehören: (1) Aktuelle antibiotische Therapien stehen vor Herausforderungen wie immer berichtet Antibiotikaresistenz 14,18-20. PRP kann eine fortschrittliche Alternative sein, weil (i) PRP Blutplättchen mikrobizide Proteine ​​können chemotaktischen Eigenschaften für Immunzellen wie Neutrophilen, Monozyten und T-Zellen, die eine wichtige Rolle spielen bei der Abwehr Pathogenbefall 21 besitzen, und (ii) zu herkömmlichen Antibiotika verglichen, von Blutplättchen mikrobizide Proteine ​​sind weniger anfällig für inducing bakteriellen Resistenz aufgrund der Schwierigkeit bei der Veränderung Bakterienmembran Strukturen 22. (2) PRP reduziert nicht nur Infektionen, sondern fördert auch die Wundheilung, beide sind bezüglich des Traumas, Zeit und Geld kostspielig.

PRP wurde kürzlich erhöhte Interesse. Es gibt jedoch zahlreiche komplexe Variationen unter PRP Herstellung Protokolle einschließlich der Startnummer von Plättchen, die Verwendung von Antikoagulanzien, die Aufnahme von Leukozyten und die Verwendung von Aktivatoren 23-27. Die Variation in PRP Herstellung beiträgt teilweise zu den umstrittenen Ergebnissen sowohl in der Tier und klinischen Studien 28. Als Ergebnis ist ein großes Problem für PRP Studien um die Variation zu kontrollieren. In der aktuellen Studie wurde eine doppelte Zentrifugation Ansatz durchgeführt, und die Thrombozyten-Konzentration von PRP wurde auf 2 x 10 6 Thrombozyten / ul (~ 10 Mal über der Basislinie im Blut) befestigt, um die PRP-Präparat Protokoll zu standardisieren und die Variabilität zu begrenzenin PRP Vorbereitung. Der zweimalige Zentrifugation vorgestellte Ansatz ist einfach, leicht zur Isolierung von PRP aus dem Blut von anderen Tieren und Menschen angewendet werden, und hat konsequent in vitro antimikrobielle Eigenschaften von Kaninchen PRP in der vorliegenden Studie leitete. Jedoch kann, da die Unterschiede noch Wachstumsfaktoren und anderen Chemikalien innerhalb oder Freigabe von Thrombozyten kann zwischen einzelnen Zellen und Tieren variieren existieren; einige Zellpopulationen (zB Leukozyten) wurden nicht angesteuert. Beachten Sie, dass leukozytenreiche PRP wurde hergestellt und in dieser Studie verwendet, da Leukozyten in direkten Abtöten der Bakterien und Antigen-spezifische Immunantwort beteiligt sind. Die Protokolle können weiter modifiziert werden, um Leukozyten-arme PRP durch Ausführen einer zweiten Zentrifugation von nur der oberen Schicht (dh Plasma und Thrombozyten aufweist) nach der ersten Zentrifugation (Abbildung 1) zu erhalten.

In dieser Studie wurden 50 ml Vollblut verwendet werden, um ungefähr 5 ml PRP erhalten. Wenn das Blutvolumen ist ein Anliegen, kann gepoolten Blut von mehreren Tieren verwendet werden, um PRP vorzubereiten. Wenn Blutgerinnsel bilden sich während Blutentnahme und / oder Zentrifugieren, wahrscheinlich einige Thrombozyten aktiviert werden, die sich in tiefer Plättchenausbeute führen. Daher sind ausreichende Antikoagulantien und sanft, aber Durchmischung wichtige Schritte für eine erfolgreiche PRP Isolation.

PRP wurde unter Verwendung von Thrombin in der vorliegenden Studie. Andere Ansätze, einschließlich Calciumchlorid, exogenen oder autologen Thrombin mit oder ohne Calciumchlorid, mechanischer Belastung (zusätzliche Hochgeschwindigkeitszentrifugation) und Batroxobin kann auch zur Aktivierung PRP 29-32 aufgebracht werden. Beachten Sie, dass Blutplättchen durch Thrombin aktiviert werden wahrscheinlich veröffentlichen ihre Granulat Inhalte viel schneller als Thrombozyten durch andere Chemikalien aktiviert. Die Ursache ist, dass neben seiner Fähigkeit, Faktor XI XIa, VIII VIIIa, V konvertieren Va und Fibrinogen zu Fibrin, Thrombin kann Thrombozytenaktivierung und Aggregation über eine Förderungctivation von Protease-aktivierten Rezeptoren auf Thrombozyten Zellmembranen 33-35.

Der Kill-Kurve Assay wurde vorgestellt in vitro antimikrobielle Aktivität von PRP beurteilen. Anders als der Agar Platte Diffusion Assay erlaubt die Abtötung Kurve Assay quantitative Bewertung der Rate der bakterizide Aktivität über die Zeit. Ein wichtiger Schritt, um richtig zu verteilen Bakterien beim Zählen CFUs ist es, die gesamte Kultur gründlich mischen durch kräftiges Pipettieren bevor die Probe gezogen und für serielle Verdünnungen verwirbelt, wie PRP Gel kann verwirren die Fähigkeit, richtig zu verteilen Bakterien.

Insgesamt plättchenreichem Plasma weist starke antimikrobielle Eigenschaften gegenüber Bakterien, wie S. aureus, Streptokokken der Gruppe A und Neisseria gonorrhoeae. Neben der gut untersuchten die Heilung fördernden Eigenschaften kann PRP als neuer Ansatz, um das Implantat-assoziierten Infektionen zu verhindern dienen. Der Mechanismus der antimikrobiellen Eigenschaften PRP ist sbis unbekannt und weitere Untersuchungen in diesem Bereich benötigt werden.

Die Grenzen dieser Studie sind, dass PRP nicht vollständig zu eliminieren die Bakterien unter unseren experimentellen Bedingungen (1 x 10 5 CFU / ml). Dies kann aufgrund der hohen Giftigkeit der klinischen Bakterienstämme, die verwendet wurden; 1 x 10 2 KBE (0,1 ml) von S. aureus induzierten schweren Infektionen in vivo 36-38. Alternativ kann die Menge an PRP erhöht werden, um eine bessere Bakterienabtötung oder PRP kann zusammen mit einer systemischen oder lokalen Verabreichung von herkömmlichen Antibiotika zur Infektionsprophylaxe verwendet werden erreichen; die dualen Wirkungen (dh antimikrobielle und Heilung fördernden Eigenschaften) von PRP kann vorteilhaft bei der Förderung der Heilung und verhindert Infektionen. Eine weitere Einschränkung ist, dass PRP sollte nicht für Patienten, die bereits seit systemisch infizierten (zB Sepsispatienten) verwendet werden. Dies liegt daran, Bakterien im Blut werden passieren kanned auf von PRP auf die Anwendung vor Ort, wenn nicht geeignete Sterilisationsverfahren angewendet werden. Wir empfehlen sorgfältige Prüfung möglicher bakterieller Kontaminationen von PRP vor seiner Verwendung.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis und Suzanne Smith für experimentelle Unterstützung und Suzanne Smith für das Korrekturlesen. Die Autoren danken John Thomas, PhD für die Bereitstellung der bakteriellen klinischen Isolaten und John B. Barnett, PhD für seine Unterstützung und die Nutzung der biologischen Sicherheit Labor an der Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Zellbiologie an der West Virginia University. Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die Osteosynthese und Trauma Care Foundation und der National Science Foundation (# 1003907). Microscope Experimente und Bildanalyse wurden auch in der West Virginia University Imaging Facility, die zum Teil von der Mary Babb Randolph Cancer Center und NIH P20 RR016440 unterstützt wird durchgeführt.

Verwendung von Tieren für die Blutabnahmen wurden von der West Virginia University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit allen relevanten guidelin hingerichtetes, Vorschriften und Regulierungsbehörden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine thrombin King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 Thrombin (bovine origin)
Calcium chloride King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 10% calcium chloride
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Isoflurane Baxter 1001936060
Mueller Hinton broth Becton, Dickinson and Company 275710
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8662
Tri-sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Tryptic soy agar Fisher Scientific R01202
Centrifuge Kendro Laboratory Products 750043077
Syringe filter Millipore SLGP033RS

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References

  1. Gristina, A. G. Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration. Science. 237, 1588-1595 (1987).
  2. Gristina, A. G., Costerton, J. W. Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis. J. Bone Joint Surg. Am. 67, 264-273 (1985).
  3. Everts, P. A., et al. Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery. Eur. Surg. Res. 39, 199-207 (2007).
  4. Marx, R. E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP. Implant. Dent. 10, 225-228 (2001).
  5. Toscano, N., Holtzclaw, D. Surgical considerations in the use of platelet-rich plasma. Compend. Contin. Educ. Dent. 29, 182-185 (2008).
  6. Cieslik-Bielecka, A., Gazdzik, T. S., Bielecki, T. M., Cieslik, T. Why the platelet-rich gel has antimicrobial activity? Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 103, 303-306 (2007).
  7. Yeaman, M. R. The role of platelets in antimicrobial host defense. Clin. Infect. Dis. 25, 951-970 (1997).
  8. Tang, Y. Q., Yeaman, M. R., Selsted, M. E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infect Immun. 70, 6524-6533 (2002).
  9. El-Sharkawy, H., et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties. J. Periodontol. 78, 661-669 (2007).
  10. Krijgsveld, J., et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines. J. Biol. Chem. 275, 20374-20381 (2000).
  11. Trowbridge, C. C., et al. Use of platelet gel and its effects on infection in cardiac surgery. J. Extra Corpor. Technol. 37, 381-386 (2005).
  12. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface. Med. Prog. Technol. 14, 205-224 (1988).
  13. Subbiahdoss, G., Kuijer, R., Grijpma, D. W., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Microbial biofilm growth vs. tissue integration: "the race for the surface" experimentally studied. Acta Biomater. 5, 1399-1404 (2009).
  14. Klevens, R. M., et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 298, 1763-1771 (2007).
  15. Foster, T. E., Puskas, B. L., Mandelbaum, B. R., Gerhardt, M. B., Rodeo, S. A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am. J. Sports Med. 37, 2259-2272 (2009).
  16. Carlson, N. E., Roach, R. B. Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry. J. Am. Dent. Assoc. 133, 1383-1386 (2002).
  17. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237 (2001).
  18. Fridkin, S. K., et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin. Infect. Dis. 36, 429-439 (1997).
  19. Jackson, C. R., Fedorka-Cray, P. J., Davis, J. A., Barrett, J. B., Frye, J. G. Prevalence, species distribution and antimicrobial resistance of enterococci isolated from dogs and cats in the United States. J. Appl. Microbiol. 107, 1269-1278 (2009).
  20. Murray, C. K., et al. Recovery of multidrug-resistant bacteria from combat personnel evacuated from Iraq and Afghanistan at a single military treatment facility. Mil. Med. 174, 598-604 (2009).
  21. Durr, M., Peschel, A. Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense. Infect Immun. 70, 6515-6517 (2002).
  22. Hancock, R. E. Peptide antibiotics. Lancet. 349, 418-422 (1997).
  23. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27, 158-167 (2009).
  24. Kalen, A., Wahlstrom, O., Linder, C. H., Magnusson, P. The content of bone morphogenetic proteins in platelets varies greatly between different platelet donors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375, 261-264 (2008).
  25. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J. Craniomaxillofac. Surg. 30, 97-102 (2002).
  26. Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 97, 110-118 (2009).
  27. Lei, H., Gui, L., Xiao, R. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin. Biochem. 42, 1452-1460 (2009).
  28. Redler, L. H., Thompson, S. A., Hsu, S. H., Ahmad, C. S., Levine, W. N. Platelet-rich plasma therapy: a systematic literature review and evidence for clinical use. Phys. Sportsmed. 39, 42-51 (2011).
  29. Whitman, D. H., Berry, R. L., Green, D. M. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. J. Oral Maxillofac. Surg. 55, 1294-1299 (1997).
  30. Anitua, E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int. J. Oral Maxillofac. Implants. 14, 529-535 (1999).
  31. Whitman, D. H., Berry, R. L. A technique for improving the handling of particulate cancellous bone and marrow grafts using platelet gel. J. Oral. Maxillofac. Surg. 56, 1217-1218 (1998).
  32. Currie, L. J., Sharpe, J. R., Martin, R. The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review. Plast. Reconstr. Surg. 108, 1713-1726 (2001).
  33. Nikulin, A. A. Effect of calcium, thrombin and nucleotides (ADP, cAMP, cGMP) on blood platelet glycolysis and energy metabolism. Farmakol. Toksikol. 43, 585-590 (1980).
  34. Hantgan, R. R., Taylor, R. G., Lewis, J. C. Platelets interact with fibrin only after activation. Blood. 65, 1299-1311 (1985).
  35. Hantgan, R., Fowler, W., Erickson, H., Hermans, J. Fibrin assembly: a comparison of electron microscopic and light scattering results. Thromb. Haemost. 44, 119-124 (1980).
  36. Li, B., Jiang, B., Boyce, B. M., Lindsey, B. A. Multilayer polypeptide nanoscale coatings incorporating IL-12 for the prevention of biomedical device-associated infections. Biomaterials. 30, 2552-2558 (2009).
  37. Li, B., Jiang, B., Dietz, M. J., Smith, E. S., Clovis, N. B., Rao, K. M. K. Evaluation of local MCP-1 and IL-12 nanocoatings for infection prevention in open fractures. J. Orthop. Res. 28, 48-54 (2010).
  38. Boyce, B. M., Lindsey, B. A., Clovis, N. B., Smith, E. S., Hobbs, G. R., Hubbard, D. F., Emery, S. E., Barnett, J. B., Li, B. Additive effects of exogenous IL-12 supplementation and antibiotic treatment in infection prophylaxis. J. Orthop. Res. 30, (2), 196-202 (2012).
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Li, H., Li, B. PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP. J. Vis. Exp. (74), e50351, doi:10.3791/50351 (2013).More

Li, H., Li, B. PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP. J. Vis. Exp. (74), e50351, doi:10.3791/50351 (2013).

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