Summary
Implante infecção associada é uma complicação clínica significativa. Este estudo descreve uma abordagem utilizando plasma rico em plaquetas (PRP) para evitar as infecções associadas implante, apresenta o protocolo para a preparação de PRP com a concentração de plaquetas constante, e relata as propriedades antimicrobianas recentemente identificados de PRP e protocolos relacionados para examinar tais propriedades antimicrobianas
Abstract
Implante infecção associada está a tornar-se cada vez mais difícil para a indústria de cuidados de saúde em todo o mundo, devido ao aumento de resistência a antibióticos, a transmissão de bactérias resistentes aos antibióticos entre animais e seres humanos, e os elevados custos de tratamento de infecções.
No presente estudo, nós divulgamos uma nova estratégia que pode ser eficaz na prevenção de infecções associadas implante com base nas propriedades antimicrobianas potenciais de plasma rico em plaquetas (PRP). Devido às suas propriedades bem estudadas para promover a cura, PRP (um produto biológico) tem sido cada vez mais utilizado para aplicações clínicas, incluindo cirurgias ortopédicas, cirurgias periodontais e oral, cirurgias maxilo-faciais, cirurgias plásticas, medicina esportiva, etc
PRP poderia ser uma alternativa avançada para tratamentos com antibióticos convencionais na prevenção de infecções associadas implante. A utilização de PRP pode ser vantajosa em comparação com os tratamentos convencionais antibiótico since PRP é menos provável que induza a resistência aos antibióticos e antimicrobianos de PRP e curando-propriedades promotoras podem ter um efeito sinérgico na prevenção de infecções. É bem conhecido que organismos patogénicos e células humanos estão correndo para superfícies de implantes, e as propriedades de cura de PRP de promoção pode melhorar a ligação de células humanas, reduzindo assim as probabilidades de infecção. Além disso, o PRP é inerentemente biocompatível e seguro e livre do risco de doenças transmissíveis.
Para o nosso estudo, nós selecionamos várias clínicas estirpes de bactérias que são comumente encontrados em infecções ortopédicas e analisou se o PRP tem propriedades in vitro antimicrobianos contra estas bactérias. Nós preparamos PRP utilizando uma abordagem de centrifugação duas vezes o que permite que a mesma concentração de plaquetas a ser obtidos para todas as amostras. Nós conseguimos consistentes resultados antimicrobianos e descobriram que o PRP tem fortes propriedades in vitro antimicrobianos contra bactérias como methicillin sensíveis e resistentes à meticilina Staphylococcus aureus, Streptococcus do grupo A, e Neisseria gonorrhoeae. Portanto, a utilização de PRP pode ter o potencial para prevenir a infecção e para reduzir a necessidade de um tratamento pós-operatório de implante dispendioso infecções associadas.
Introduction
Implante infecção associada é uma complicação clínica significativa. Staphylococcus aureus (S. aureus) é um dos microorganismos mais comuns isoladas de implante de infecções associadas. Ele é capaz de produzir um biofilme que cobre as superfícies dos implantes, podendo levar a resistente a antibióticos 1,2 a infecção. Tratamento de implante infecção associada freqüentemente requer hospitalização a longo prazo para desbridamentos repetidos e terapia parenteral prolongada de antibióticos. Em casos resistentes aos antibióticos, a remoção do implante pode ser necessária. A resistência crescente das bactérias aos antibióticos também foi referido pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) como "um dos problemas de saúde do mundo mais prementes." Com o tempo, sem o desenvolvimento de novos e eficazes tratamentos antimicrobianos, é possível que vários fármacos patógenos resistentes será tratável com antibióticos convencionais. Prevenção de implante associadainfecção, é importante e novos agentes profiláticos ou abordagens são necessários para a prevenção de tais infecções.
Plasma rico em plaquetas (PRP) é uma concentração de sangue autólogo que contém mais de 30 fatores de crescimento que podem ajudar com osso e enxerto ósseo cura 3-5. A aplicação de PRP para aumentar a regeneração óssea e maturação dos tecidos moles tem sido cada vez relatada em clínicas devido à sua elevada concentração de vários factores de crescimento libertados pelas plaquetas.
Várias características do PRP indicam que o PRP pode também ter propriedades antimicrobianas 6-9. PRP contém um grande número de plaquetas, uma elevada concentração de leucócitos (os quais podem possuir hospedeiro-defesa acções contra bactérias e fungos), e vários peptídeos antimicrobianos 7,8,10. Em um estudo recente de um grande grupo de pacientes cirúrgicos cardíacos, foi revelado que o uso intra-operatório de gel de PRP durante encerramento de feridas signifvamente diminuiu a incidência de infecção do esterno superficial e profunda 11. Por estas razões e observações, a hipótese de que o PRP, além de suas bem estudadas cura propriedades promotoras, tem propriedades antimicrobianas. As vantagens potenciais da utilização de PRP para prevenir a infecção pode incluir: (i) O PRP é menos provável que induza a resistência em comparação com os convencionais tratamentos com antibióticos. (Ii) PRP também tem propriedades que promovem a cura e que podem ter um efeito sinérgico na prevenção de infecção; curando-promovendo PRP de propriedades podem proporcionar uma vedação para impedir a fixação bacteriana, reduzindo assim as probabilidades de infecção por agentes patogénicos e células humanos estão correndo para superfícies de implante 12 , 13. (Iii) o PRP é inerentemente biocompatível e seguro e livre do risco de doenças transmissíveis.
Nosso objetivo de longo prazo é usar o PRP como uma nova abordagem para evitar implante associada infections. O objectivo deste estudo foi o de preparar PRP utilizando uma abordagem de centrifugação, duas vezes, para examinar PRP de propriedades in vitro anti-microbianos, e para descrever os protocolos para a avaliação de tais propriedades antimicrobianas.
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Protocol
1. Preparação e ativação do PRP
1,1 coleta de sangue
- Anestesiar coelho por inalação de isoflurano (2% em O 2 para a indução e 1% para manutenção).
- Desenhar 2 ml 0,129 M citrato de tri-sódio (uma solução anticoagulent) para uma seringa de 20 ml. A solução de citrato de tri-sódio é preparada por dissolução de 1,897 g de citrato de tri-sódio em 50 ml de H2O destilada e de filtragem com um filtro de 0,22 ^ M estéril.
- Esterilizar a orelha de coelho utilizando etanol a 70%.
- A obtenção de sangue (por exemplo, 5 ml) a partir da veia da orelha de coelho através de uma agulha de borboleta (25 G) ligada à seringa.
- Misturar o sangue com a solução de citrato de tri-sódio, por agitação suave. A proporção de volume de sangue e de tri-sódio de solução de citrato é de 9:1.
1,2 preparação PRP (Figura 1)
- Transferir o sangue anticoagulado a um tubo de centrífuga de 50 ml em plástico. Tomar uma aliquota de 10 ulde sangue para determinar a contagem de plaquetas de base usando hemocytometry.
- Centrifuga-se o sangue a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente (TA) numa centrífuga com rotor swing-out. Definir a velocidade de aceleração e de travagem para baixo (Figura 1).
- Após a centrifugação, o sangue é separado em três camadas. A camada inferior é de glóbulos vermelhos, principalmente, a camada média (geralmente referido como o "buffy coat") é composta por concentrado de plaquetas e leucócitos, e a camada superior é, principalmente, o plasma, o qual é o componente líquido do sangue e plaquetas ( Figura 1). Cuidadosamente transportar o tubo de centrífuga de um capuz de cultura de células, não perturbar as camadas. Transferir todo o plasma, buffy coat, e 2-3 mm de espessura da camada de células vermelhas do sangue para um tubo de plástico de 15 ml usando uma pipeta de plástico de 1 ml.
- Centrifugar a amostra transferida uma segunda vez a 3000 xg durante 15 min à TA. A camada superior (sobrenadante) é considerado plasma pobre em plaquetas (PPP) ad é transferida para um novo tubo.
- Obter PRP, ajustando a concentração de plaquetas na amostra de sangue restante utilizando PPP para se obter 2,0 x 10 6 plaquetas / ul (determinado por hemocytometry).
1,3 ativação PRP
- Preparar PRP solução de activação através da dissolução de 5,000 UI de trombina bovina, com 5 ml de cloreto de cálcio a 10% para a concentração de trabalho de 1000 IU / ml.
- Adicionar a solução de activação para PRP e PPP, e misturar a solução por pipetagens repetidas para formar PRP e PPP-gels. A proporção em volume da solução de activação de PRP ou de PPP é 1:4.
2. In vitro Teste Antimicrobiano de PRP Usando Kills Ensaio de curva (Figura 2)
- Usando um loop de inoculação estéril, adicionar várias colónias de S. aureus a partir de uma cultura da placa durante a noite em 5 ml de caldo Mueller Hinton (MHB) num tubo de plástico. Vortex brevemente e então incubar a amostra durante 2 horas a 37 ° C. Próximo, A densidade óptica dos meios de bactérias foi determinada utilizando um espectrofotómetro e ajustadas para uma densidade óptica igual a ~ 1 x 10 8 UFC / ml com base na curva padrão pré-determinado.
- Prepare uma diluição de 100 vezes usando PBS para se obter 1 x 10 6 CFU / ml e colocar os inóculos em gelo.
- Configurar e rotular estéreis descartáveis de 5 ml, os tubos de fundo redondo de poliestireno, e preparar os seguintes grupos de amostras como indicado na Tabela 1, para um volume final de 2 ml em cada tubo.
- Adicionar PRP, PPP, ou PBS em primeiro lugar aos tubos de poliestireno, seguida da solução de trombina para a activação (formação do gel). Em seguida, adicione MHB e, em seguida, o S. inóculos aureus (1 x 10 6 CFU / ml) para se obter a concentração final de 1 x 10 5 CFU / ml.
- Incubar os tubos a 37 ° C com agitação orbital a 150 rpm.
- Em pontos de tempo pré-determinados (por exemplo, 0, 1 e 2 h), misturar as soluções de cada um dos tubos através de pipetagem de repetição (istopasso é importante uma vez que as bactérias podem ser presos no interior do gel PRP). Tomar 10 ul de amostra, dilua serialmente com solução salina estéril a 0,9%, e pipetar uma alíquota de 100 ul de cada diluição sobre um meio de ágar de soja tríptico (TSA, com sangue de ovelha a 5%) para a contagem de CFU placa.
- Cultura das placas de agar durante a noite a 37 ° C, em seguida, contar e registar as colónias da placa. Os dados do gráfico em escala logarítmica, com o tempo (hr) no eixo x e CFU / ml no eixo y.
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Representative Results
PRP é reprodutivelmente preparados usando uma abordagem de centrifugação duas vezes (Figura 1). PRP é encontrado para apresentar forte (até 100 vezes a redução em UFCs) propriedades in vitro antimicrobianas contra resistente à meticilina S. aureus (MRSA) (Figura 3), que é vulgarmente encontrado em hospitais em todo o mundo 14. Da mesma forma, o PRP tem fortes propriedades antimicrobianas contra meticilina sensível S. aureus (MSSA), Streptococcus Grupo A, e Neisseria gonorrhoeae.
A abordagem centrifugação duas vezes permite a aquisição de PRP com a mesma concentração de plaquetas (por exemplo, 2,0 x 10 6 plaquetas / jil), mas concentrado (~ 10 vezes acima da linha de base no sangue e a figura 4) e permite a obtenção de resultados consistentes antimicrobianos; não houve diferenças significativas em descobertas UFC entre PPR de diferentes animais (ou seja,coelhos) têm sido observados.
| Grupos | PRP / PPP / PBS | MHB | MRSA inóculo |
| Controlar | Nenhum | 1.800 ul | 200 ul |
| Controlar | Nenhum | 2.000 ul | Nenhum |
| Controlar | PBS + trombina (200 ul) | 1.600 ul | 200 ul |
| PPP | PPP + trombina (200 ul) | 1.600 ul | 200 ul |
| PRP | PRP + trombina (200 ul) | 1.600 ul | 200 ul |
Tabela 1. Amostras experimentais para avaliação antimicrobiana do PRP.
Figura 1. Preparação PRP utilizando um procedimento de centrifugação duas vezes. (A) Em primeiro lugar a centrifugação. Após a centrifugação em primeiro lugar, as três camadas são constituídas, e as duas camadas superiores (isto é, plasma e as camadas de creme leucocitário) e 2-3 mm de a camada inferior (isto é, camada de células vermelhas do sangue) são transferidos para um tubo de centrífuga estéril de segundo. (B) Segunda centrifugação. Após a segunda centrifugação, a camada superior é transferida para um novo tubo estéril e designada como PPP. O remanescente é ajustado com PPP até uma concentração de plaquetas de 2,0 x 10 6 plaquetas / jil e designada como PRP.
Figura 2. Conjunto experimental para avaliar a propertie antimicrobianas de PRP utilizando o ensaio de curva de morte. Primeiro, o PRP ou de PPP é adicionada aos tubos de ensaio e, imediatamente activado com uma solução de trombina. Em seguida, é adicionado MHB seguido de inóculos bacterianos. Alíquotas de amostras são tomadas em diferentes pontos temporais e plaqueadas para contagem de UFC.
Figura 3. PRP, PPP, ou PBS são colocadas num tubo de poliestireno estéril, juntamente com 5 ml de trombina, o caldo de MHB e inóculo MRSA e, em seguida, incubadas a 37 ° C com agitação orbital a 150 rpm. Nos pontos de tempo pré-determinados (isto é, 1 e 2 hr), alíquotas de amostras foram colhidas e plaqueadas para contagem de UFC. (A) os dados de UFC e (B) imagens representativas placa de diluição 10 -2. Redução significativa (~ 100 vezes em 2 horas) do crescimento de MRSA é obtido using PRP relação aos controles de PPP e PBS. Isto é verdadeiro para as bactérias como MSSA, Streptococcus Grupo A, e Neisseria gonorrhoeae, bem.
Figura 4. Esfregaços sanguíneos de sangue total (esquerda) e PRP (direita). PRP preparadas a partir de duas vezes por centrifugação a abordagem tem ~ 10 vezes o número de plaquetas em comparação com o sangue total.
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Discussion
Plasma rico em plaquetas tem sido cada vez mais utilizado para aplicações clínicas, devido às suas propriedades promotoras de cura 15-17. No presente estudo, o PRP foi apresentado como uma nova abordagem para a prevenção de infecção. PRP foi encontrado com fortes propriedades antimicrobianas contra MRSA, MSSA, Grupo A Streptococcus e Neisseria gonorrhoeae. As principais vantagens do PRP, em comparação com os convencionais tratamentos com antibióticos, para a prevenção de infecção incluem: (1) atuais terapias antibióticas estão enfrentando desafios, incluindo cada vez mais reportado resistência aos antibióticos 14,18-20. PRP pode ser uma alternativa avançado porque plaquetas (i) de PRP de proteínas microbicidas podem ter propriedades quimiotáticas para células do sistema imune, tais como neutrófilos, monócitos e células T, que desempenham papéis importantes na defesa contra a invasão do patógeno 21, e (ii) em comparação com os antibióticos convencionais, de plaquetas proteínas microbicidas são menos propensas a inducing resistência bacteriana devido à dificuldade em mudar as estruturas de membrana bacterianas 22. (2) O PRP não só reduz as infecções, mas também promove a cicatrização de feridas, e ambas são dispendiosos em termos de trauma, tempo e dinheiro.
PRP foi recentemente atraído um interesse crescente. No entanto, existem numerosas variações complexas entre os protocolos de preparação de PRP, incluindo o número de plaquetas de partida, a utilização de anticoagulantes, a inclusão de leucócitos, bem como a utilização de activadores de 23-27. A variação na preparação PRP contribui em parte para os resultados controversos, tanto em estudos com animais e clínicos 28. Como resultado, um grande problema para PRP estudos é o de controlar a variação. No presente estudo, uma abordagem de centrifugação foi realizada duas vezes, e a concentração de plaquetas de PRP foi fixada em 2 x 10 6 plaquetas / jil (~ 10 vezes acima da linha de base no sangue), para padronizar o protocolo de preparação PRP e para limitar a variabilidadena preparação de PRP. A abordagem apresentada centrifugação duas vezes é simples, pode ser facilmente aplicado para o isolamento de PRP a partir de sangue de outros animais e de seres humanos, e tem levado a consistente propriedades in vitro antimicrobianas de coelho PRP no presente estudo. No entanto, as diferenças podem ainda existir uma vez que os factores de crescimento e outros produtos químicos dentro ou libertado a partir de plaquetas pode variar entre células individuais e animais, algumas populações de células (por exemplo leucócitos) não foram controlados. Note-se que leucócito-rico PRP foi preparado e utilizado no presente estudo, uma vez que os leucócitos estão envolvidos na morte bacteriana directa e antigénio específico da resposta imune. Os protocolos podem ser posteriormente modificados para obter leucócito-PRP pobre através da realização de uma segunda centrifugação de apenas a camada superior (isto é, plasma e plaquetas parte), após a primeira centrifugação (Figura 1).
Neste estudo, 50 ml de sangue total foi utilizado para se obter cerca de 5 ml de PRP. Se o volume de sangue é uma preocupação, o sangue reunido de vários animais podem ser utilizados para preparar PRP. Se a formação de coágulos se formam durante retirada de sangue e / ou centrifugação, provavelmente algumas plaquetas são activadas o que irá resultar na produção de plaquetas. Portanto, anticoagulantes suficientes e suaves, mas uma boa mistura, são passos importantes para o isolamento do PRP sucesso.
PRP foi activada utilizando trombina no presente estudo. Outras abordagens incluem o cloreto de cálcio, a trombina exógena ou autólogo, com ou sem cloreto de cálcio, o stress mecânico (velocidade de centrifugação adicional de altura), e batroxobina também pode ser aplicado para PRP de activação 29-32. Note-se que as plaquetas activadas por trombina pode provavelmente libertar os seus conteúdos de grânulos muito mais rápido do que as plaquetas activadas por outros produtos químicos. O motivo é que, além da sua capacidade para converter o factor XI a Xla, VIII VIII, V em Va, e do fibrinogénio em fibrina, a trombina pode promover a activação e agregação das plaquetas através de umctivation de protease-ativados receptores nas membranas celulares das plaquetas 33-35.
O ensaio de curva de morte foi apresentado para avaliar a actividade antimicrobiana in vitro de PRP. Ao contrário do ensaio de difusão em agar em disco, o ensaio de curva de morte permitem uma avaliação quantitativa da taxa de actividade bactericida com o tempo. Um passo crítico para dispersar adequadamente as bactérias quando a contagem das UFC é misturar cuidadosamente toda a cultura por pipetagem vigorosa antes que a amostra é extraída e submetida a vórtice por diluições em série, tal como gel de PRP pode confundir a habilidade para dispersar adequadamente as bactérias.
No geral, o plasma rico em plaquetas tem fortes propriedades antimicrobianas contra as bactérias, tais como S. Grupo aureus, Streptococcus A, e Neisseria gonorrhoeae. Além de suas bem estudadas cura propriedades promotoras, PRP pode servir como uma nova abordagem para evitar implante de infecções associadas. O mecanismo das propriedades antimicrobianas de PRP é saté investigações desconhecidos e ainda mais nesta área são necessários.
As limitações deste estudo incluem que o PRP não eliminar totalmente as bactérias sob condições experimentais (1 x 10 5 UFC / ml). Isto pode ser devido à alta virulência dos nossos clínicos estirpes bacterianas que foram utilizadas, 1 x 10 2 UFC (0,1 ml) de S. aureus induzida infecções graves in vivo 36-38. Alternativamente, a quantidade de PRP pode ser aumentada para alcançar uma melhor eliminação de bactérias, ou PRP pode ser utilizado em conjunto com a administração sistémica ou local de antibióticos convencionais para a prevenção de infecção, os efeitos duplos (isto é, antimicrobiana e cura-propriedades promotoras) de PRP pode ser vantajoso na promoção da cura enquanto previne a infecção. Outra limitação é que a PRP não deve ser usado em doentes que já tenham sido infectadas sistemicamente (por exemplo, doentes com sépsia). Isto é porque as bactérias no sangue pode ser passared em de PRP para o local de aplicação, a menos que as técnicas de esterilização apropriadas são aplicadas. Recomendamos exame cuidadoso de possíveis contaminações bacterianas do PRP antes de seu uso.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Os autores agradecem Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis, e Suzanne Smith para assistência experimental e Suzanne Smith para revisão. Os autores também agradecer a John Thomas, PhD pela prestação dos isolados bacterianos clínicos e John B. Barnett, PhD por seu apoio e do uso do laboratório de segurança biológica no Departamento de Microbiologia, Imunologia e Biologia Celular da Universidade de West Virginia. Os autores reconhecem o apoio financeiro da osteossíntese e Trauma Care Foundation e National Science Foundation (# 1003907). Experimentos de microscopia e análise de imagem também foram realizadas na Universidade de West Virginia Facilidade Imaging, que é apoiado em parte pela Babb Mary Randolph Cancer Center e concessão de NIH P20 RR016440.
O uso de animais de sangue desenha foram aprovados pela Universidade de West Virginia Animal Care Institucional e Comitê de uso. Todos os experimentos foram executados em conformidade com todas as Guidelin relevantees, regulamentos e agências reguladoras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine thrombin | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | Thrombin (bovine origin) |
| Calcium chloride | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | 10% calcium chloride |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Mueller Hinton broth | Becton, Dickinson and Company | 275710 | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | R01202 | |
| Centrifuge | Kendro Laboratory Products | 750043077 | |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RS |
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