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Immunology and Infection

Identification de Motifs Fonctionnelles et leurs PARTENAIRES DE LIAISON Peptide-basée sur

Published: June 30, 2013 doi: 10.3791/50362
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

Summary

Techniques pour disséquer les mécanismes qui sous-tendent la sécrétion de HIV-1 Nef dans exosomes sont décrits. Peptides courts spécifiques provenant de Nef et la transfection de protéines ont été exploités pour déterminer la structure, la fonction et les partenaires de liaison de la sécrétion Modification de la région de Nef. Ces procédures présentent un intérêt général dans de nombreuses études mécanistes.

Abstract

Peptides courts spécifiques sont dérivés à partir de motifs trouvés dans les protéines full-longueur, dans notre cas le VIH-1 Nef, non seulement conservent leur fonction biologique, mais peuvent également inhiber de manière compétitive le fonction de la protéine full-length. Un ensemble de 20 Nef peptides de numérisation, 20 acides aminés dans longueur les uns avec les qui se chevauchent 10 acides aminés de son voisin, ont été utilisés pour identifier des motifs dans Nef responsable pour son induction de l'apoptose. Peptides contenant des ces motifs apoptotiques induites l'apoptose à des niveaux comparables à la protéine de Nef full-length. A second peptide, dérivé à partir de la région de la Modification de Sécrétion (SMR) de Nef, a conservé le capacité à interagir avec des protéines cellulaires impliqués dans la sécrétion de Nef dans exosomes (exNef). Ce peptide SMRwt a été utilisé comme la protéine "d'appât" dans des expériences de co-immunoprécipitation pour isoler les protéines cellulaires qui se lient spécifiquement au motif de la SMR de Nef. Protein transfection et de l'anticorps inhibition a été utilisé pour perturber physiquement le pari de interactionween Nef et mortaline, l'un des les protéines SMR-de liaison isolés, et l'effet a été mesurée avec un dosage de sécrétion exNef fluorescent-basée sur. La capacité de la SMRwt peptide à outcompete Nef full-length pour des protéines cellulaires qui se lient le motif de SMR, assurez-il le premier inhibiteur de la sécrétion exNef. Ainsi, par employant les techniques décrites ici, qui utilisent la les propriétés uniques de peptides courts spécifiques dérivés à partir de motifs trouvés dans les protéines full-longueur, on peut accélérer l'identification de motifs fonctionnels dans les protéines et le développement d'inhibiteurs de fonctions de pathogènes peptide-basés sur.

Introduction

Avec l'avènement de thérapie anti-rétrovirale, l'épidémie de SIDA dans le monde occidental a été ralentie, mais pas écourtée, et la propagation du VIH continue d'être un majeur fardeau de santé tout au long de le monde. Avec l'exception de le procès marginalement efficaces l'essai RV144 Thai, vaccins contre le VIH ont jusqu'ici montré échec pour protéger à partir de infection. Ainsi, la recherche en cibles thérapeutiques supplémentaires, potentiels est encore justifié.

Le long de avec CD4 l'épuisement T-cellule, l'activation immunitaire généralisée persistante est un marque de fabrique de infection à VIH. Cette Activation Immune Chronic (CIA) mène à augmente dans chiffre d'affaires de la cellule, sous-populations lymphocytaires activés et différenciées, l'épuisement cellulaire et de la sénescence, et le meurtre de cellules T et les cellules B Via Activation-Induced Mort Cellulaire (AICD) 1,2,3, et il est bien établi comme l'un des les prédicteurs les les plus forts de progression de la maladie 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Cependant, les mécanismes qui sous-tend CIA et CD4L'épuisement dans l'infection le VIH T-cellule restent à être pleinement élucidé.

Evidence à partir de notre laboratoire et d'autres nous a conduit à un modèle pour progression de la maladie (Figure 1) dans laquelle la Nef de protéine du VIH (Regulatory Factor Negative) induit sa sécrétion dans exosomes à partir de cellules infectés-1 lutte contre le VIH 13,14. Ces exosomes Nef-contenant du (exNef) induisent des l'apoptose dans les un certain nombre de lignages cellulaires y compris les CD4 non infectées T-des cellules 15,16. Alternativement, dans les monocytes / macrophages exNef altère les les modèles d'expression de gènes, les p. ex expression de cytokine, ET LE CODE APPARAÎT à induire un état ​​de l'activation immunitaire Non programmé. Ce corps de preuves suggère un rôle important pour exNef dans CIA et CD4 l'épuisement T-cellule.

Comprendre les mécanismes qui sous-tendent la capacité de Nef pour manipuler la voie de la traite des êtres exosomal sera utile dans nouveaux inhibiteurs d'ingénierie de la sécrétion exNef. Inhibition de la sécrétion exNef devrait diminuer l'épuisement T-cellule CD4et de la CIA que pathogenèse dur le VIH / sida.

Pour recueillir des les éléments de preuve qui a conduit à notre modèle pour progression de la maladie VIH / sida et les les données ultérieures qui ont construit sur ce modèle, nous avons développé un certain nombre de nouveaux réactifs et des méthodologies qui nous ont permis à analysons les la génétique de la sécrétion exNef, et commençons à déterminer la protéines cellulaires impliqués. Dans le travail initial, nous avons trouvé que la protéine Nef induit l'apoptose dans les cellules de bystander et est libéré extracellulairement à partir de cellules Nef-transfectées et le VIH-infectée 15. Des peptides dérivés à partir de (cellule Stromal Derived Factor-1, avec l'épissage alternatif de alpha) SDF-1α avaient été précédemment montré pour conserver une grande partie de l'activité de liaison et la signalisation de la molécule full-length 17. Nous avons spéculé que les peptides de Nef pourraient de retenir certains des le activité apoptotique de la protéine de pleine, et que ces peptides seraient contenir nécessairement le domaine apoptotique Nef (s). Pour identifier ces peptides, et par conséquent la Nefdomaine apoptotique (s), nous avons obtenu un ensemble de 20 du VIH-1 Nef peptides Numérisation à partir d'le recherche sur le sida NIH et Reagent Program de Référence. Ces peptides 20-aa, chaque qui se chevauchent 10 acides aminés de son voisin a, sont nommées par le nombre de leur dernier acide aminé, c.-à-N20 travées Nef acides aminés 1-20, N30 travées Nef acides aminés 11-30, etc 16. Nous avons constaté que d'exposer T-cellules extracellulairement à des peptides spécifiques qui se chevauchent deux domaines 10-aa distinctes dans la protéine de Nef full-length l'apoptose induite dans ces cellules. Une analyse subséquente de ces peptides apoptotiques Nef-dérivées a révélé leur capacité à interagir physiquement avec le récepteur de chimiokine CXCR4 sur la surface de T-cellules, avec cinétique de liaison qui ont permis à ces peptides à inhibent de façon compétitive contraignant entre CXCR4 et son ligand naturel SDF-1α. Enfin, la interaction les peptides apoptotiques Nef-dérivées de avec CXCR4 a été trouvé à induire une réponse de stress dans ces T-cellules conduisant à l'apoptose. Cet élément de preuve nous a permis de quicdomaines fonctionnels de kly carte Nef; un processus qui aurait pris des beaucoup plus longtemps en utilisant des techniques mutagènes d'ADN standard tels que mutagenèse par balayage d'alanine. Il a également a montré que ces peptides Nef-dérivées de courtes conservés la fonction biologique de les domaines apoptotiques dans la protéine full-length.

Ayant identifié un rôle pour Nef extracellulaire, c.-à-l'apoptose des T-cellules, nous avons cherché une meilleure compréhension de la façon dont Nef a été sécrété à partir de cellules. En utilisant une série de constructions d'Nef mutées, nous avons cartographié motifs protéiques de Nef hautement conservées dans les régions N-terminaux de à la fois Nef le VIH, et de son Rhesus macaque équivalent SIV mac (Simian Virus de l'Immunodéficience) Nef, qui sont critique pour exNef sécrétion 13. One de ces motifs, la région de la Modification de Sécrétion (SMR; 66VGFPV70), était particulièrement critique, en tant que remplacement alanine de une quelconque de ses cinq acides aminés soit grandement réduit ou aboli la sécrétion d'exNef. Lorsque livré à cellules par l'intermédiaire la C de Active MotifHariot Protein Reagent de livraison, un peptide contenant la SMR attaché à un séquence d'peptide FLAG (SMRwt) a été trouvée il pour inhiber la la sécrétion d'exNef à partir de à la fois Nef-transfectée et le VIH-infectée cellules 18. Basé sur notre expérience précédente avec peptides, nous avons décidé de utiliser cette peptide pour élucider les molécules et des mécanismes qui sous-tendent le rôle de l'Nef SMR dans sécrétion exNef.

Utilisation de la peptide SMRwt en tant que notre "protéine appât", nous avons co-immunoprécipitée à partenaires de liaison cellulaires de la SMR à partir de lysats T-cellules non infectées 18. La séquence d'peptide FLAG a fourni une poignée commode pour capturant le peptide SMRwt en utilisant résine d'affinité anti-FLAG. Notre constatation antérieure selon laquelle un seul valine à l'alanine mutation dans le peptide SMRwt était suffisante pour que abolir son inhibition de la sécrétion exNef identifié, un peptide de commande hautement spécifique commode (SMRmut) que nous avons utilisé de se prononcer out protéines co-immunoprécipitées pas spécifiques pour le SMR. Utilisation de un peptide avec des la sdomaine pécifique d'intérêt plutôt que de la protéine full-length nous a permis Pour bypasser le dépistage de des dizaines de facteurs cellulaires qui se lient à d'autres domaines dans Nef 19.

Une fois que nous avons identifié les partenaires SMR-contraignants, une prochaine étape logique était de montrer que les partenaires de liaison cellulaires identifiés sont important pour la fonction biologique 18. La procédure standard d'accomplir ceci est à des niveaux de protéines de knockdown à l'aide de miRNA de cible spécifique à la protéine ou siRNA, et par la suite dosage l'effet sur le fonction biologique. Nous avons effectué knockdown de miRNA, qui inhibe la traduction de l'ARNm cible, en réduisant production de que cible, dans ce cas un de protéine SMR-contraignant. Cette réduction de la protéine de cible est un effet indirect, et, éventuellement, a un effet retardé sur la fonction biologique la protéine ciblé joue un rôle po Par conséquent, nous avons également employions le technique moins commun d'inhibition de la anticorps afin de déterminer si perturbant directement l'activité dela protéine cible réduit ou élimine la fonction biologique. Dans cette procédure, les anticorps ont soulevé contre la protéine ciblé sont transfectés dans la cellule en utilisant Chariot Reagent, et interagissent directement avec la protéine cible soit séquestrant il à partir de son site de la fonction, ou le blocage son domaine de liaison pertinente. Inhibition de la protéine de cible à travers cette procédure perturbe directement sa fonction, et peut servir de complément procédures de knockdown d'ARN par confirmant en outre l'importance de la protéine de cible à la fonction biologique.

Alors que Chariot Reagent est efficace à des délivrant peptides et des protéines dans les cellules; ce processus est temps-consommant et limite les types d'expériences, les expositions p. ex prolongée ou répétée et dans les études animales in vivo qui peut être effectuée. Par conséquent, nous avons ajouté un peptide séquence cellule-pénétrante (RPC) à la peptide SMRwt (SMRwt-CPP) 18 pour générer un peptide qui pourraient être prises up par les cellules passivementà partir de les milieux de culture. Cette version était aussi efficace que l'ancien à inhiber la sécrétion d'exNef.

Les éléments de preuve à partir de ces expériences publiées démontre la capacité des petites peptides contenant des motifs fonctionnelles spécifiques à antagoniser l'fonction de la protéine full-length à travers inhibition compétitive, et pour isoler les protéines qui se lient ces motifs. One s'attendrait à ce que ces techniques devraient être utiles dans de nombreux protocoles expérimentaux. Ils devraient également être efficace dans nouveaux inhibiteurs de peptidiques d'ingénierie de de nombreux processus cellulaires; une fonction qui peut être encore renforcée par une tringlerie à des séquences du RPC.

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Protocol

I. Utilisez du film de court Peptides dans Analyse Biological

I.1. Mappage des Motifs biologiquement fonctionnel en utilisant des peptides

  1. Le traitement des cellules avec peptides de numérisation Nef
    1. Appel fait un ensemble de peptides de balayage la région d'intérêt. Pour nos expériences, des peptides 20mer, avec 10 chevauchement d'acides aminés, enjambant l'ensemble du-1 le VIH protéine Nef (205 aa), ont été obtenus à partir de le Reagent Program SIDA. Les peptides sont été dosés individuellement en tant que suit:
    2. Les Ajouter 10 ng / ml de peptide à le milieu de culture de cellule.
    3. Ajouter 10 ml de milieu de culture per plaque à Jurkat des cultures de cellules.
    4. Incuber cultures pour 24 hr à 37 ° C.
  2. Terminal désoxynucléotidyltransférase-médiée par dUTP la biotine Nick End Labeling (TUNEL) dosage de la l'apoptose
    1. Laver les cellules avec 1X PBS, et fixer pour 30 min à la température ambiante avec 4% de paraformaldéhyde dans du PBS 1X, pH 7.4.
    2. Lavez-avec 1X PBS, et perméabiliser avec 0,1% de Triton X-100 pour 10min à température de chambre.
    3. Rincez les les cellules deux fois avec 1X PBS.
    4. Compter les cellules tachés par à épifluorescence sur un système de microscopie ordinateur-contrôlée.

I.2. Analyse de Inhibition Competitive en utilisant Peptides

  1. Co-transfection de Peptides l'aide de l'Protein livraison Kit de Reagent Chariot
    1. Per mélange de réaction de transfection, diluer 1 ug de l'ADN de plasmide wtNef-GFP et 100 ng de soit des peptides type sauvage dérivées à partir de le nom de domaine SMR, ou des peptides contenant des l'alanine-remplacement d'acides aminés individuelles dans le à motifs SMR, à un volume finale du ou des 100 ul avec de 1X PBS.
    2. Diluer 6 ul d'une 1/10 dilution de Chariot Reagent à un volume final de 100 ul avec de l'eau stérile, et de combiner avec le mix ADN-peptide diluée.
    3. Incuber à la température ambiante pendant 30 min pour permettre la formation de la Chariot / complexe ADN-peptide.
    4. PelletsLes 3 x 10 5 cellules de Jurkat par centrifugation à 600 xg pour 5 min.
    5. Laver les cellules deux fois avec 1X PBS, et resuspendre dans le complexe Chariot / DNA-peptide.
    6. Ajouter 400 ul de sérum-milieu RPMI 1640 sans à la suspension et incuber les cellules dans des plaques de culture à 37 ° C pour 2 hr.
    7. Ajouter 1 ml de milieu frais RPMI 1640 contenant 10% de FBS à chaque plaque, et incuber les cellules pour 48 hr à 37 ° C.
    8. Récolte des cellules et de déterminer efficacité de la transfection par microscopie fluorescent.
  2. Dosage de la inhibition peptide Nef-GFP sécrétion fluorescent plaque lecteur
    1. Recueillir les milieux conditionnés cellule-gratuits à partir les cellules récoltées, et de les transférer 100 ul à des puits individuels d'une plaque de microtitrage à 96-well noir.
    2. Measure fluorescence de la GFP dans les médias sur un GENEios fluorimètre Tecan avec excitation longueur d'onde 485 nm et des longueur d'onde d'émission 515 des nm dans les unités fluorescentes relatifs.
    3. Réglez le niveau de la GFP fluorescence dans le contrôle (médias à partir de cellules co-transfectées avec Nef-GFP et d'un peptide brouillés) À 100%.
    4. De détails Comparer ce à le niveau de fluorescence de la GFP dans les médias à partir de cellules a co-transfectées avec divers peptides de SMR afin de déterminer des changements dans sécrétion Nef-la GFP.

I.3. Isolating Motif Partners Reliure en utilisant des peptides en tant que Bait

  1. Co-immunoprécipitation avec peptides de SMR
    1. Cultiver les cellules de Jurkat dans du milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS à 37 ° C dans un-T 75 ballon de culture de tissu, et cellules à granulés de par: centrifugation à 1,000 xg pour les 20 min à 4 ° C. Des Déterminez la efficacité de la transfection, en plaçant la plaque en vertu de un microscope à fluorescence, de le capturer d'images Images, et postérieurement au compter les cellules total des et étiquetés et de déterminer les pourcent cellules marquées.
    2. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml 1X PBS, et de les transférer il à un tube Eppendorf de 1,5-ml. Microcentrifugeuse à 1.000 xg pour 1 min. Remettre en suspension le culot dans 1 ml tampon de Lysis α-FLAG par pipetage douce. tampon de Lysis: Mix Tris 50 mM • HCl pH 7.4, 150 mM sodium chloride [NaCl], 1 mM EDTA, et 1% de Triton X-100, avec 1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyle [PMSF], et 10 ul / ml Protease Inhibitor Cocktail pour une utilisation avec cellule mammalienne et les extraits de tissus [PIC; Sigma]. Assurez-immédiatement avant d'utiliser.
    3. Différentiellement microcentrifugeuse les suspensions à 2.000 xg pour 5 min, et à 13.000 xg pour 10 min pour obtenir un culot le de les débris de cellules et de l'ADN, respectivement. Recueillir le surnageant (ci-après dénommé à en tant que le "lysat").
    4. Ajouter 1 mg de protéine lysat et 1 ug d'soit le SMRwt ou SMRmut peptide à 20 ul de anti-FLAG M2 Affinity Gel (ci-après appelé "résine"; Sigma). Notez que à la fois SMRwt et SMRmut utilisée ici ont une séquence de tag de FLAG embarqué dans les peptides. Amener le mélange à un volume final de 1 ml dans un tampon Co-IP (Lysis tampon α-de FLAG minus PMSF et PIC). Incuber le mélange a à 4 ° C pendant une nuit avec la rotation extrémité-over-extrémité. En tant que un le contrôle Négatif de, incuber le lysat avec la résine en l'absence de ou l'autre peptide.
    5. Pellet la résine par microcentrifugation à 5,000 - 8,000 xg pour 30 sec. Permettre à résine à banc à dossier pour 2 min avant de manipuler le échantillon et puis Aspirer le surnageant. Eliminer le surnageant avec un embout de pipette narrow-fin de compte, ou une seringue Hamilton, en faisant attention de de ne pas transférer n'importe quelle résine. Pointes de pipette Narrow-finaux peuvent être faites en utilisant forceps pour pincer l'ouverture d'une pointe de pipette en plastique jusqu'à ce qu'il est partiellement fermé. Laver la résine à quatre fois avec 500 ul de tampon lavage (Tris 50 mM • HCl pH 7.4, et NaCl 150 mM). Eluer les protéines cellulaires assortis avec 15 ug de peptide de FLAG 3X (Sigma) dans 50 ul de tampon de lavage et incuber sur de la rocker / shaker pendant 30 min à la température ambiante.
    6. Concentrez-vous les éluats par précipitation à l'acétone, suivie en faisant bouillir dans un tampon d'échantillon de Laemmli (Bio-Rad). Séparer les protéines par SDS-PAGE sur un 4-20% Tris-HCl Criterion préfabriqué gel (Bio-Rad). Colorer le gel avec Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Note: pour des expériences d'identification de spectrométrie de masse (
  2. Co-immunoprécipitation avec des protéine Nef-GFP
    1. Mélanger 50 ul d'Protéines billes magnétiques Dynabeads G (Invitrogen) avec 2 ug d'murine monoclonal anti-GFP dans 1 ml de 1X PBS avec 0,02% de Tween 20 (PBS-T). Incuber le mélange a avec la rotation extrémité-over-end dans une tube Eppendorf de 1,5-ml pour les 1 hr à 4 ° C.
    2. Séparez les perles à partir de la mémoire tampon en plaçant le tube sur un 1,5-ml Magnasphere Technology Magnetic Stand Separation (Promega Corp, Madison, WI) permettant pulldown magnétique suivie par l'élimination de le surnageant. Laver les billes revêtues de anti-GFP avec 1 ml de PBS-T en utilisant pipetage douce.
    3. Lyse cellules de Jurkat transfectées Nef-GFP avec 1 ml de 1X RIPA + tampon par pipetage doux et incubation pour 15 mdans sur la glace. + Tampon RIPA: 10X plus RIPA Lysis Buffer, pH 7.4 [Millipore, Bedford, MA] dilué à 1:10 dans l'eau stérile, 0,02% sodium azide [Sigma], et 0,1% sodium sulfate dodécyl [SDS], avec 1 mM PMSF et 10 ul / ml PIC ajouté immédiatement avant d'utiliser.
    4. Pellet le de débris cellulaires par microcentrifugation à 2,000 xg pour 10 min. Recueillir le surnageant (ci-après dénommé à en tant que le "lysat").
    5. Ajouter 1 mg de protéine lysat pour les billes revêtues de anti-GFP, apportez le volume final à 1 ml avec 1X RIPA + tampon, et incuber la mélange avec rotation fin-over-fin pour 1 hr à 4 ° C. Note: Pour les études de la concurrence peptidiques, 1 mg de protéine Lysate peut être pré-mis à incuber avec 2 ug d'SMRwt ou d'un peptide SMRmut dans 1 ml de + tampon de RIPA 1X, avant d'être ajouté à les billes revêtues de anti-GFP.
    6. Laver les billes à travers resuspension dans 1 ml de tampon de lavage (50 Tris mM • HCl pH 7.4, NaCl 150 mM, et 0,1% de Tween 20). Incuber avec rotation fin-over-fin pour 5 min à 4 ° C. Séparez le perles from le lavage l'aide de la Stand Séparation Magnetic. Laver les billes un second et de la troisième temps de parole avec tampons de lavage contenant des 250 mM de et du NaCl 300 mM de, respectivement.
    7. Resuspendre les perles dans 200 ul de PBS, transférer le mélange à un tube propre, et séparer les perles à partir de le lavage sur le stand magnétique. Faire bouillir les perles dans 50 ul de Laemmli échantillon tampon de 5 min à 95 ° C, laisser le mélange à refroidir pendant 10 min à la température ambiante, et puis placez le mélange sur le stand magnétique pour la séparation, et de recueillir les surnageants ("éluats") .
    8. Séparez les protéines de la éluat par Nouvelles SDS Ladder-PAGE, sur un 8-16% du Tris-HCl Critère gel d'préfabriqué en.
  3. La spectrométrie de masse
    1. Sur l'accise les bandes de protéiques d'intérêt à partir de gels Coomassie-tachés.
    2. Réduire les échantillons dans 10 mM de 1,4-dithiothréitol (DTT) pour 45 min à 37 ° C.
    3. Alkyler les échantillons dans 55 mM iodoacétamide pour 45 min à 25 ° C.
    4. Digérer les échantillons durant la nuit avec séquençage try de gradePSIN (Promega) à 37 ° C.
    5. Dessaler les peptides de l'échantillon avec C-18 ZipTip (Millipore). Mélanger les peptides de l'échantillon avec de l'alpha-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), et les repérer sur une cible MTP cadre III (Bruker Inc., Billerica, MA).
    6. Effectuer tandem désorption / ionisation temps de laser assistée par matrice de vol analyse par spectrométrie de masse (MALDI-TOF/TOF) en utilisant un Bruker ultraflex III TOF / TOF.
    7. Comparer les données MS / MS aux bases de données non redondantes et Swiss-Prot NCBI en utilisant l'algorithme de mascotte ( www.matrixscience.com ).
  4. Analyse Immunoempreinte
    1. Séparez les échantillons de protéines par SDS-PAGE à 4-20% 8-16% ou Tris-HCl Critère préfabriqué gels (Bio-Rad). Transférer les bandes par électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose.
    2. Laver la membrane dans du Tris Buffered Saline (TBS; Bio-Rad) pendant 5 min. Bloquer avec 5% de lait écrémé en TTBS (TBS avec 0,1% de Tween 20) pendant 1 heure en agitant à la température ambiante.
    3. Procédé pour la membrane immunoblot en utilisant un anticorps primaire spécifique à 5% de lait écrémé sous agitation à 4 ° C pendant une nuit. Laver à l'TTBS pendant 20 minutes suivie d'une IgG conjugué (H + L) anticorps secondaire HRP dans 5% de lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante. Laver à l'TTBS pendant 30-60 min.
    4. Détecter les bandes de protéines par Western Blot réactif luminol (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Exposer le filtre à film photographique. Note: Dans certaines expériences, un réactif de décapage a été utilisé pour enlever la membrane (Pierce, Rockford, IL) avec l'hybridation ultérieure avec un anticorps primaire et secondaire différent.
    5. Numérisation des films radiographiques dans Adobe Photoshop 5.0.2. Effectuer une analyse de densitométrie en utilisant le logiciel ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. L'utilisation de l'inhibition des anticorps dans l'analyse fonctionnelle

II.1. La co-transfection de antibods en utilisant la protéine livraison kit de réactifs Chariot

  1. Par mélange de réaction de transfection, diluer 1 ug d'ADN plasmidique wtNef-GFP et 1 pg de chaque anticorps anti-mortaline ou d'anticorps anti-α-tubuline, à un volume final de 100 pl avec du PBS 1X. Note: Il a été constaté précédemment que la co-transfection de l'anticorps anti-α-tubuline n'a pas d'effet détectable sur la sécrétion exNef, et donc, il sert de témoin négatif efficace dans ces expériences.
  2. Diluer 6 pi de réactif non dilué Chariot à un volume final de 100 pi avec de l'eau stérile, et de combiner avec le mélange d'ADN anticorps dilué.
  3. Incuber à température ambiante pendant 30 min pour permettre la formation du char / complexe ADN-anticorps.
  4. PelletsLes 3 x 10 5 cellules de Jurkat par centrifugation à 600 xg pour 5 min.
  5. Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X, et remettre en suspension dans l'Chariot / complexe ADN-anticorps.
  6. Ajouter 400 ul de milieu sans sérum RPMI 1640 à la suspension et incuber la caunes de plaques de culture à 37 ° C pendant 2 heures.
  7. Ajouter 1 ml de milieu frais RPMI 1640 contenant 10% de FBS à chaque plaque, et incuber les cellules pour 48 hr à 37 ° C.

II.2. Nef-GFP sécrétion Fluorescent Assay Plate Reader d'inhibition des anticorps

  1. Recueillir les milieux conditionnés cellule-gratuits à partir les cellules récoltées, et de les transférer 100 ul à des puits individuels d'une plaque de microtitrage à 96-well noir.
  2. Measure fluorescence de la GFP dans les médias sur un GENEios fluorimètre Tecan avec excitation longueur d'onde 485 nm et des longueur d'onde d'émission 515 des nm dans les unités fluorescentes relatifs.
  3. Réglez le niveau de fluorescence de la GFP dans le contrôle (médias de cellules co-transfectées avec Nef-GFP et de l'anticorps anti-α-tubuline) à 100%.
  4. Comparer ce au niveau de fluorescence de la GFP dans les médias de cellules co-transfectées avec un anticorps anti-mortaline pour déterminer les changements dans la sécrétion Nef-GFP.

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Representative Results

Cartographie Motifs biologiquement fonctionnels en utilisant des peptides. Deux régions ont été identifiées sur les protéines Nef qui induisent l'apoptose. Apoptose peptide-driven a été observée (Figure 2) en commençant par peptide N50 (aa30-50), avec un pic à N60 (AA40-60) et N70 (AA50-70), et en diminuant les niveaux de fond au peptide N100 (AA80-100). La majeure Motif 1 (M1) de pointe, centrée sur AA50-60, induit> 80% des niveaux apoptotiques de la protéine Nef pleine longueur. Un deuxième petit pic, apoptotique a été observée couvrant peptides N180 (aa160-180) et N190 (AA170-190). Ce motif mineure 2 (M2) de pic, centré sur AA170-180, induit ~ 30% des niveaux apoptotiques de pleine longueur protéine Nef 16.

Analyse d'inhibition compétitive en utilisant des peptides. Dans la figure 3, les peptides contenant un SMR intact inhibé significativement la sécrétion de exNef. Cela est vrai si le motif était situé à l'extrémité N-terminale (WildtyPE-1) ou au milieu (type sauvage-2) du peptide, ou a été dupliquée dans le peptide (type sauvage-3). En variante, l'alanine-substitution d'un acide aminé du motif, indépendamment de la position ou du numéro du motif dans le peptide, abrogée la fonction du peptide 18. Un 11-amino-acide version de Motif apoptotique de la Nef 1 (SM1) brouillés, décrit précédemment 14 et obtenu de Sigma Genosys, a été utilisé comme contrôle négatif et n'a eu aucun effet sur ​​la sécrétion exNef. Voir le tableau 1 pour la liste des séquences peptidiques.

Isoler Motif partenaires de liaison utilisant des peptides comme appât. La figure 4A montre la co-immunoprécipitation de quatre protéines par le peptide SMRwt (60, 65, 75, et 250 kDa). Le contrôle négatif SMRmut peptide n'a pas capturé ces protéines, et les protéines n'ont pas d'interaction non-spécifique avec la résine d'affinité en l'absence de peptide, ce qui suggère que les protéines immunoprécipitées ont été co-interagissentspécifiquement avec les motifs de SMR du peptide SMRwt. Ces protéines ont ensuite été identifiés par spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF (voir la figure 4B pour un échantillon représentatif), et vérifiées par analyse immuno-18.

L'utilisation de l'inhibition des anticorps dans l'analyse fonctionnelle. Inhibition avec l'anticorps anti-mortaline complètement la sécrétion de exNef aboli (figure 5). Cela confirme que l'interaction intact Nef / mortaline est nécessaire pour la sécrétion exNef. En outre, il suggère fortement que le mécanisme par lequel le peptide inhibe la sécrétion SMRwt exNef à travers la perturbation de cette interaction en concurrence directe pour mortaline 18.

Tableau 1
Tableau 1. Panneau de peptides SMR développé et testé pour leur effet sur ​​la sécrétion exNef Nef-induite. Cet ongletle a été publié dans Shelton et al., IMV, 2012 18. Dans des études antérieures, l'alanine-remplacement d'acides aminés simples du motif de SMR significativement réduite ou supprimée, la sécrétion induite par Nef 18. Le virus isolé dans une nonprogressor à long terme exprimé une variante de Nef avec une isoleucine au lieu de V66;. L'un des rares variations signalées dans le motif SMR hautement conservé 20 Cliquez ici pour agrandir le tableau .

Figure 1
Figure 1. Effets des exosomes Nef sur les principaux types de cellules immunitaires. Ce modèle affiche exNef libéré par les cellules infectées, et ses effets sur les cellules monocytes et les cellules lymphocytaires qui conduiraient à prévoir sidapathogenèse. AICD, la mort cellulaire induite par activation. I. infectées par le virus de la cellule de presse, exosomes normales, et exNef. exNef active non activés, monocytes non infectées (B). L'activation des monocytes (C) entraîne des changements dans l'expression des gènes conduisant à l'augmentation de l'état inflammatoire et suite à l'activation et l'épuisement des lymphocytes CD4 + et des lymphocytes T CD8 +. II. Infectées par le virus de la cellule de presse, exosomes normales, et exNef. exNef active, les lymphocytes non infectés non activées (D). Les lymphocytes activés (E) subissent des changements d'expression des gènes qui conduisent à l'AICD résultant dans une cellule apoptotique (F). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Peptide l'analyse de la protéine HIV-1 Nef pour motif apoptotique (s) de numérisation. Une série de peptides 20mer, chacune avec 10 chevauchement d'acides aminés, couvrant les 205 acides aminés de la protéine Nef KNFS, a été obtenue à partir du programme de réactif sida et utilisé dans la cartographie des domaines apoptotiques Nef. Ce chiffre a été publié à l'origine dans Huang et al., IMV, 2004 13. L'axe des ordonnées indique le pourcentage de cellules qui sont TUNEL marqué, et l'axe des X représente la condition de traitement. Protéine entière Nef [Nef], les cellules non traitées [UT], ou les peptides commençant par AA1-20 [N20], et se terminant par AA190-205 [N205]. Les barres d'erreur représentent l'erreur-type de mesure, et les résultats sont une compilation d'au moins 3 expériences indépendantes. Les sommets de l'apoptose sont désignés par 1 et Motif Motif 2.

Figure 3
Figure 3. SMRwt peptide inhibe exNef. Peptides contenantun ou plusieurs Nef SMR motifs de séquence de type sauvage ont inhibé la sécrétion de exNef, tandis que l'alanine-remplacement d'un acide animo de cette région fortement réduit l'efficacité du peptide. Ce chiffre a été publié à l'origine dans Shelton et al., IMV, 2012 15. Les milieux de culture de cellules T Jurkat, co-transfectées avec un clone Nef-GFP et différents peptides SMR, ont été analysés pour la sécrétion exNef. La quantité de fluorescence de la GFP mesurée est équivalente à la quantité de exNef-GFP dans les milieux extracellulaires. La signification statistique a été déterminée en utilisant un test t apparié. L'effet sur la sécrétion de exNef différents peptides a été comparée à celle d'un peptide aléatoire brouillés commande (SM1, * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001).

Figure 4
Figure 4. Le peptide SMRwt interagit spécifiquement avec les protéines de la cellule hôte, notamment mor Talin. (A) Les protéines de cellules T Jurkat ont été co-immunoprécipités avec soit le SMRwt ou peptides SMRmut utilisant de la résine d'affinité couplées à des anticorps anti-FLAG M2. Notez que à la fois SMRwt et SMRmut utilisée ici ont une séquence de tag de FLAG embarqué dans les peptides. Ce chiffre a été publié à l'origine dans Shelton et al., IMV, 201215. Cette procédure a été répétée en l'absence de peptide soit comme un contrôle des interactions non spécifiques avec la résine d'affinité. Le bleu de Coomassie gel coloré photo affiche protéines ayant des masses moléculaires de 60, 65, 75 et 250 kDa (pointes de flèches) tiré vers le bas par SMRwt qui n'ont pas été tiré vers le bas par le peptide SMRmut ou sans peptide. (B) La bande de 75 kDa a été excisé du gel, de la trypsine, digéré et analysé par spectrométrie MALDI-TOF de masse en tandem. La MS / MS Ion Recherche identifié les 75-kDa comme mortaline. Les flèches indiquent les séquences des peptides correspondants.large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure

Figure 5
Figure 5. Mortaline anticorps blocs d'inhibition de la sécrétion d'exosomes. Milieux de culture extracellulaires de cellules Jurkat, co-transfectées avec un clone Nef-GFP et des anticorps contre soit mortaline ou α-tubuline, ont été analysés pour la sécrétion exNef. Par rapport à l'effet d'un anticorps contre une protéine non impliquée dans la sécrétion exNef (α-tubuline), la perturbation de l'activité de mortaline par son anticorps conduit à l'abolition complète de la sécrétion exNef. La signification statistique a été déterminée par test t non apparié comparant la sécrétion de exNef en présence de l'anticorps mortaline contre l'anticorps α-tubuline (*** valeur de p <0,001). Ce chiffre a été publié à l'origine dans Shelton et al., IMV, 2012 18.

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Discussion

Comprendre les mécanismes qui sous-tendent la capacité de Nef pour manipuler la voie de la traite des êtres exosomal sera utile dans nouveaux inhibiteurs d'ingénierie de la sécrétion exNef. L'inhibition de la sécrétion exNef devrait diminuer l'épuisement des cellules T CD4 et de la CIA qui pathogenèse dur VIH / SIDA. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé un certain nombre de nouveaux réactifs et de méthodes qui nous ont permis d'analyser la génétique de la sécrétion exNef, et commencer à déterminer les protéines cellulaires impliquées. Cette approche a également conduit à l'élaboration du premier inhibiteur de cibler directement exNef sécrétion du peptide SMRwt.

Une des principales conclusions de notre travail est que les peptides courts spécifiques dérivés de motifs présents dans les protéines pleine longueur, dans notre cas HIV-1 Nef, non seulement conservent leur fonction biologique, mais peut aussi inhiber de manière compétitive la fonction de la protéine pleine longueur. Parce que ces peptides conservent leur fonction biologique, ils peuvent être utilisés pour identifier les domaines fonctionnelsdans la protéine de pleine longueur. Deux choses sont nécessaires: la production de peptides qui scannent la protéine d'intérêt, que ce soit toute sa longueur ou une région de la protéine pensé pour contenir le domaine fonctionnel, et un essai pour tester la fonction biologique en question. Comme nous n'avions pas d'informations qui nous permettrait limiter notre recherche pour motifs induisant l'apoptose dans des régions spécifiques de Nef, nous avons utilisé un ensemble de peptides de numérisation toute sa longueur. Bien que ce processus a été rendu plus simple par la taille relativement petite de Nef, nous avons également appliqué cette approche à grands (> 75 kDa) protéines. Un dosage bien établie pour mesurer l'apoptose (TUNEL) a été utilisée pour identifier des peptides conservant la fonction biologique d'intérêt, dans ce cas, l'apoptose induite par Nef des lymphocytes T CD4. Fait intéressant, l'analyse subséquente dans le document original a montré que les peptides apoptotiques identifiés conservées> 80% de l'activité biologique de la protéine Nef pleine longueur, et inhibée de façon compétitive CXCR4 contraignantde son ligand SDF-1α naturel.

De même, un court peptide contenant le motif de SMR de Nef a conservé sa capacité biologique à interagir avec des protéines cellulaires impliquées dans la sécrétion exNef. Cependant, dans cette rétention de l'instance d'activité ne conduit pas à la parodie d'une fonction Nef, comme ce fut le cas avec l'induction de l'apoptose, mais conduit plutôt à l'inhibition. Parce que le peptide lié SMRwt efficacement des sites SMR-liaison de ces protéines cellulaires, il a perturbé leurs interactions avec Nef et, par conséquent, empêche la sécrétion de Nef dans exosomes. Comme le motif de la Nef d'intérêt était connu de précédentes études de cartographie génétique, nous avons réussi à limiter le développement peptide aux variations de la SMR. Au lieu d'identifier de nouveaux motifs fonctionnels, nous avons utilisé ces peptides, et une analyse basée sur la fluorescence précédemment développé pour mesurer la sécrétion de exNef, afin de démontrer que le rôle de la SMR dans la sécrétion exNef était directement liée à sa séquence primaire spécifique.

VIH-1, base de données d'interaction des protéines humaines répertorie plus de 60 protéines cellulaires qui interagissent directement avec Nef et peut-être autant que 200 qui interagissent directement ou indirectement 19. En limitant la séquence de notre protéine appât au motif d'intérêt, nous avons évité d'avoir à trier les dizaines de protéines qui auraient été co-immunoprécipitée par la protéine Nef pleine longueur. La majorité de ces protéines, tandis spécifique pour Nef, ne serait pas partenaires de liaison pour l'unité SMR de Nef, et constituerait donc background / bruit. Un calcul prudent, c'est que nous avons réduit le bruit en 15x (60/4). Obligatoire dans l'essence, notre approche a effectivement augmenté le rapport signal-sur-bruit en minimisant fond dû à l'extérieur du site, ou dans notre cas hors motif, nous permettant identifier protéines qui se lient spécifiquement le SMR. Cependant, il est possible que, en utilisant cette méthode, nous avons échoué à capturer toutes les protéines cellulaires SMR contraignantes, en particulier celles qui nécessitent une interaction à la fois avec le SMR et un second motif de lier Nef, ou ceux dont la liaison est dépendante secondaire ou structure tertiaire.

Mortaline, une protéine cellulaire co-immunoprécipitation par le peptide SMRwt, a été montré pour être requis pour la sécrétion exNef par knockdown de miARN et l'inhibition des anticorps. La première est une technique bien établie qui réduit ou élimine l'expression de la protéine ciblée. Inversement, l'inhibition d'anticorps n'affecte pas les niveaux d'expression de protéines, mais inhibe physiquement l'interaction de la protéine ciblée avec d'autres protéines. Nous avons utilisé cette deuxième méthode pour démontrer l'importance de l'interaction Nef-mortaline pour la sécrétion exNef. l'inhibition de l'anticorps est une procédure tout droit vers l'avant qui nécessite un procédé pour introduire l'anticorpsdans la cellule et un test pour tester l'effet sur la fonction biologique en question. Nous avons utilisé le char Protein réactif de livraison à des anticorps anti-mortaline navette dans la cellule, et le test basé sur la fluorescence ci-dessus pour mesurer les changements dans la sécrétion exNef. Comme la plupart des procédures basées sur les anticorps, l'efficacité de l'inhibition de l'anticorps est limitée par l'affinité et la spécificité de l'anticorps pour la protéine ciblée.

Un objectif majeur de recherche sur le VIH est le développement de nouveaux traitements et l'identification de cibles thérapeutiques potentielles. Les procédures décrites ici levier courts peptides spécifiques, qui conservent leur fonction biologique et peut inhiber de manière compétitive la fonction des protéines pleine longueur, afin d'accélérer ce processus. Bien que les expériences décrites ont été adressées à la compréhension d'une fonction clé au VIH, les techniques employées doivent être applicables à l'étude des interactions protéine-protéine et le développement de base de peptidesinhibiteurs dans plusieurs domaines.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le NIH / NIGMS / MILITAIRES (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance subvention GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA subvention F31AI091484, Emory CFAR subvention P30 A1050409. Cette enquête a été menée dans une installation construite avec le soutien de la recherche Installations amélioration Grant # C06 RR18386 du NIH / NCRR. Les cellules Jurkat, l'ensemble des 20 HIV-1 Nef peptides, ainsi que le lapin anti-HIV-1 Nef sérum ont été obtenus du NIH sida Programme de recherche et de réactifs de référence, (Rockville, MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20mer peptide set with 10 amino acid overlap NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 4641
TUNEL Assay Roche 11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent Active Motif 30100
Tecan GENEios fluorimeter (Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate Corning 3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads Invitrogen 100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) Promega Corp., Madison, WI Z5332
C-18 ZipTip Millipore ZTC18S096 C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

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References

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