Summary
Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati dalla Nef e trasfezione di proteine sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.
Abstract
Brevi peptidi specifici derivati da motivi trovati nelle proteine integrali, nel nostro caso di HIV-1 Nef, conservano non solo la loro funzione biologica, ma possono anche inibire competitivamente la funzione della proteina intera. Un insieme di 20 Nef peptidi di scansione, 20 aminoacidi di lunghezza con ogni sovrapposizione di 10 amminoacidi del suo vicino di casa, sono stati utilizzati per identificare i motivi in Nef responsabile per la sua induzione di apoptosi. Peptidi contenenti tali motivi apoptotico indotto apoptosi a livelli comparabili alla proteina Nef intera lunghezza. Un secondo peptide, derivato dal Modification Regione secrezione (SMR) della Nef, ha mantenuto la capacità di interagire con le proteine cellulari coinvolte nella secrezione di Nef in exosomes (exNef). Questo peptide SMRwt stata utilizzata come proteina "esca" in esperimenti di co-immunoprecipitazione per isolare proteine cellulari che si legano specificamente alla SMR motivo di Nef. Proteina trasfezione e anticorpo inibizione è stato utilizzato per interrompere fisicamente la scommessa interazioneween Nef e mortalin, una delle proteine SMR vincolanti isolate, e l'effetto è stato misurato con un test di secrezione exNef fluorescente-based. La capacità del peptide di SMRwt outcompete full-length Nef per le proteine cellulari che legano il motivo SMR, ne fanno il primo inibitore della secrezione exNef. Così, impiegando le tecniche descritte qui, che utilizzano le proprietà uniche di brevi peptidi specifici derivati da motivi trovati nelle proteine integrali, si può accelerare l'identificazione di motivi funzionali nelle proteine e lo sviluppo di inibitori basati sul peptide di funzioni patogeni.
Introduction
Con l'avvento della terapia antiretrovirale, l'epidemia di AIDS nel mondo occidentale è stato rallentato, ma non ridotto, e la diffusione di HIV continua ad essere un grave problema di salute in tutto il mondo. Con l'eccezione del marginalmente efficace prova RV144 Thai, vaccini contro l'HIV hanno finora dimostrato incapacità di proteggere dalle infezioni. Così, la ricerca di ulteriori potenziali bersagli terapeutici, è ancora giustificata.
Insieme con CD4 deplezione delle cellule T, persistente attivazione immunitaria generalizzata è un marchio di garanzia di infezione da HIV. L'attivazione immunitaria cronica (CIA) implica un miglioramento della turnover cellulare, sottopopolazioni linfocitarie attivate e differenziate, stanchezza e la senescenza cellulare, e l'uccisione delle cellule T e le cellule B mediante l'attivazione indotta Cell Death (AICD) 1,2,3, e esso è ben definito come uno dei più forti predittori di progressione della malattia 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Tuttavia, i meccanismi alla base della CIA e CD4Deplezione di infezione da HIV delle cellule T devono ancora essere completamente chiarito.
La prova dal nostro laboratorio e altri ci ha portato a un modello di progressione della malattia (Figura 1) in cui la proteina Nef di HIV (fattore di regolazione negativa) induce la secrezione di exosomes da HIV-1 le cellule infette 13,14. Questi exosomes Nef contenenti (exNef) inducono apoptosi in un certo numero di linee cellulari tra cui cellule CD4 non infetti le cellule T 15,16. In alternativa, nei monociti / macrofagi exNef altera i pattern di espressione genica, ad esempio, l'espressione di citochine, e sembra indurre uno stato di attivazione del sistema immunitario non in programma. Questo corpo di evidenza suggerisce un ruolo importante per exNef nella CIA e CD4 deplezione delle cellule T.
La comprensione dei meccanismi alla base della capacità di Nef di manipolare il percorso traffico exosomal sarà utile in nuovi inibitori di ingegneria di secrezione exNef. Inibizione della secrezione exNef dovrebbe diminuire il CD4 deplezione di cellule Te la CIA che guidano l'HIV / AIDS patogenesi.
Per raccogliere le prove che hanno portato il nostro modello di progressione della malattia da HIV / AIDS ei dati successivi che hanno costruito su questo modello, abbiamo sviluppato una serie di nuovi reagenti e delle metodologie che ci ha permesso di analizzare la genetica di secrezione exNef, e cominciamo a determinare la proteine cellulari coinvolte. Nel lavoro iniziale, abbiamo scoperto che la proteina Nef induce apoptosi nelle cellule bystander extracellulare e viene rilasciato dalle cellule transfettate Nef e HIV-infetti 15. Peptidi derivati da (cellula stromale Derived Factor-1, con l'alfa splicing alternativo) SDF-1α erano stati precedentemente dimostrato di mantenere gran parte della attività di legame e segnalazione della molecola intera lunghezza 17. Abbiamo ipotizzato che i peptidi di Nef potrebbero mantenere alcune delle attività apoptotica della proteina integrale, e che questi peptidi sarebbero necessariamente contenere il dominio apoptotico Nef (s). Per identificare questi peptidi, e di conseguenza la Nefdominio apoptotica (s), si ottiene un insieme di 20 HIV-1 Nef peptidi scansione dal AIDS Research NIH e Programma reagente di riferimento. Questi peptidi 20-AA, ogni sovrapposizione di 10 amminoacidi del suo vicino di casa, prendono il nome dal numero del loro ultimo aminoacido, cioè N20 campate Nef aminoacidi 1-20, N30 campate Nef aminoacidi 11-30, ecc 16. Abbiamo trovato che esponendo cellule T extracellulare di peptidi specifici sovrapposti due domini distinti 10-aa nella proteina Nef intera lunghezza apoptosi indotta in queste cellule. Successiva analisi di questi peptidi apoptotici Nef-derivati rivelato la loro capacità di interagire fisicamente con il recettore della chemochina CXCR4 sulla superficie delle cellule T, con cinetiche di legame che permettevano questi peptidi di inibire competitivamente vincolante tra CXCR4 e il suo ligando naturale SDF-1α. Infine, l'interazione dei peptidi derivati Nef-apoptotiche 'con CXCR4 è stato trovato per indurre una risposta allo stress in queste T-cellule portano all'apoptosi. Questa prova ci ha permesso di Quicdomini funzionali di kly mappa Nef, un processo che avrebbe richiesto molto più tempo utilizzando tecniche di mutagenesi del DNA standard, quali alanina scansione mutagenesi. Essa ha anche mostrato che questi peptidi corti Nef-derivati mantenuti la funzione biologica dei domini apoptotici nella proteina intera.
Dopo aver identificato un ruolo per Nef extracellulare, cioè l'apoptosi delle cellule T, abbiamo cercato una migliore comprensione di come Nef è stato secreto dalle cellule. Utilizzando una serie di costrutti Nef mutati, abbiamo mappato altamente conservate motivi proteine Nef nelle regioni N-terminali di entrambi HIV Nef, e il suo macaco Rhesus equivalente mac SIV (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, che sono fondamentali per exNef secrezione 13. Uno di questi motivi, la modifica Regione secrezione (SMR; 66VGFPV70), è stato particolarmente critico, come la sostituzione di alanina di uno dei suoi cinque aminoacidi sia notevolmente ridotto o abolito secrezione exNef. Quando consegnato alle cellule tramite del Soggetto attivo CHariot proteine reagenti di consegna, un peptide contenente la SMR attaccato ad una sequenza peptidica FLAG (SMRwt) è stato trovato per inibire la secrezione exNef sia da Nef transfettate e infezione da HIV cellule 18. Sulla base della nostra esperienza precedente con i peptidi, abbiamo deciso di utilizzare questo peptide per chiarire le molecole ei meccanismi alla base del ruolo della Nef SMR nella secrezione exNef.
Usando il peptide SMRwt come il nostro "proteina esca", abbiamo co-immunoprecipitata cellulari partner di legame degli SMR non infetti da lisati di cellule T 18. La sequenza del peptide FLAG disponibile una comoda maniglia per catturare il peptide SMRwt utilizzando anticorpi anti-FLAG resina di affinità. La nostra precedente scoperta che un singolo valina per alanina mutazione del peptide SMRwt era sufficiente per eliminare la sua inibizione della secrezione exNef identificato una comoda, peptide di controllo altamente specifico (SMRmut) che abbiamo usato per escludere le proteine co-immunoprecipitate non specifici per l'SMR. Utilizzando un peptide con la sdominio pecific di interesse piuttosto che la proteina full-length ci ha permesso di bypassare la proiezione di decine di fattori cellulari che si legano ad altri domini in Nef 19.
Una volta che abbiamo identificato i partner SMR vincolanti, un passo logico successivo è stato quello di dimostrare che i partner di legame cellulari individuati sono importanti per la funzione biologica 18. La procedura standard per farlo è a livelli proteici knockdown utilizzando miRNA proteina bersaglio-specifici o siRNA, e successivamente il dosaggio effetto sulla funzione biologica. Abbiamo effettuato miRNA smontabile, che inibisce traduzione del mRNA bersaglio, riducendo la produzione di tale obiettivo, in questo caso una proteina SMR-binding. Questa riduzione della proteina bersaglio è un effetto indiretto, e possibilmente ha un effetto ritardato sulla funzione biologica della proteina mirata svolge un ruolo pollici conseguenza, abbiamo anche impiegato la tecnica inibizione anticorpo meno comune per determinare se interrompere direttamente l'attività deila proteina bersaglio riduce o elimina la funzione biologica. In questa procedura, anticorpi contro la proteina mirati sono trasfettate nella cella usando Carro reagente, e interagire direttamente con la proteina bersaglio o sequestrare dal suo sito di funzione, o bloccando la sua rilevante dominio di legame. Inibizione della proteina bersaglio attraverso questa procedura interrompe direttamente la sua funzione, e può integrare procedure abbattibili RNA confermando ulteriormente l'importanza della proteina bersaglio per la funzione biologica.
Mentre Chariot reagente è efficace a fornire peptidi e proteine nelle cellule, questo processo richiede tempo e limita i tipi di esperimenti, ad esempio, esposizioni prolungate o ripetute e in studi su animali in vivo, che può essere eseguita. Di conseguenza, abbiamo aggiunto un peptide (CPP) sequenza di celle-penetrante al SMRwt peptide (SMRwt-CPP) 18 per generare un peptide che potrebbe essere assorbita dalle cellule passivamentedai mezzi di coltura. Questa versione è risultato efficace quanto il primo a secrezione exNef inibizione.
L'evidenza da questi esperimenti pubblicati dimostra la capacità di piccoli peptidi contenenti specifici motivi funzionali di antagonizzare la funzione della proteina intera per inibizione competitiva, e per isolare le proteine che legano questi motivi. Ci si aspetterebbe che queste tecniche dovrebbero essere utili in molti protocolli sperimentali. Essi dovrebbero anche essere efficace in ingegneria nuovi inibitori peptidici di molti processi cellulari, una funzione che può essere ulteriormente migliorato legame a sequenze CPP.
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Protocol
I. Utilizzo di brevi peptidi in analisi biologica
I.1. Mappatura Motivi Biologicamente Funzionali Peptidi
- Trattando le cellule con Nef peptidi di scansione
- Procurarsi un insieme di peptidi scansione della regione di interesse. Per i nostri esperimenti, peptidi 20mer, con 10 sovrapposizione aminoacidi, che coprono l'intera HIV-1 Nef proteina (205 aa), sono stati ottenuti dal Programma reagente AIDS. I peptidi sono saggiati singolarmente come segue:
- Aggiungere 10 ng / ml di peptide per mezzo di coltura cellulare.
- Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura per piastra per colture cellulari Jurkat.
- Incubare culture per 24 ore a 37 ° C.
- Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediata dUTP biotina Nick End Labeling (TUNEL) saggio di apoptosi
- Lavare le cellule con 1X PBS, e fissare per 30 min a temperatura ambiente con 4% paraformaldeide in 1X PBS, pH 7,4.
- Lavare con 1X PBS, e permeabilize con 0,1% Triton X-100 per 10min a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule due volte con PBS 1X.
- Contare le cellule colorate con epifluorescenza su un sistema di microscopia controllato dal computer.
I.2. Analisi inibizione competitiva utilizzando peptidi
- La co-trasfezione di peptidi utilizzando il Carro Protein consegna kit reagenti
- Per ogni miscela di reazione di trasfezione, diluire 1 pg di wtNef-GFP DNA plasmidico e 100 ng di tipo selvatico sia peptidi derivati dal dominio SMR, o peptidi contenenti alanina-sostituzioni di singoli aminoacidi nel motivo SMR, ad un volume finale di 100 microlitri con 1X PBS.
- Diluire 6 pl di una diluizione di Chariot Reagente 1/10 ad un volume finale di 100 microlitri di acqua sterile, e si combinano con la miscela diluita DNA-peptide.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la formazione del Carro / complesso DNA-peptide.
- Pellet 3 x 10 5 cellule Jurkat per centrifugazione a 600 xg per 5 min.
- Lavare le cellule due volte con PBS 1X e risospendere nel complesso Chariot / DNA-peptide.
- Aggiungere 400 microlitri di siero terreno RPMI 1640 alla sospensione e incubare le cellule in piastre di coltura a 37 ° C per 2 h.
- Aggiungere 1 ml di fresco RPMI 1640 contenente 10% FBS per ciascuna piastra, e incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C.
- Celle di raccolta e di determinare l'efficienza di trasfezione mediante microscopia a fluorescenza.
- Nef-GFP secrezione fluorescente piatto saggio lettore di inibizione peptide
- Raccogliere i media condizionata, privi di cellule dalle cellule raccolte, e trasferire 100 ul a singoli pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero.
- Misura fluorescenza GFP nei media su un Tecan GENEios fluorimetro con lunghezza d'onda di eccitazione 485 nm e 515 nm di lunghezza d'onda di emissione in unità fluorescenti relativi.
- Impostare il livello di fluorescenza GFP nel controllo (supporti da cellule co-trasfettate con Nef-GFP e un strapazzate peptide) A 100%.
- Confrontare questo al livello di fluorescenza GFP nei media dalle cellule co-trasfettate con vari peptidi SMR per determinare cambiamenti nella secrezione Nef-GFP.
I.3. Isolando Motif Partners associazione utilizzando peptidi come esca
- Co-immunoprecipitazione con peptidi SMR
- Coltivare le cellule Jurkat in RPMI 1640 contenente 10% FBS a 37 ° C in un pallone di coltura tissutale T-75, e le cellule pellet per centrifugazione a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. Determinare l'efficienza di trasfezione, collocando la lastra sotto un microscopio a fluorescenza, acquisire immagini, e successivamente contare le cellule totali etichettati e determinare le cellule marcate cento.
- Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS 1X, e trasferirlo in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Microcentrifuga a 1.000 xg per 1 min. Risospendere il pellet in 1 ml di α-FLAG tampone di lisi per pipettaggio delicato. Tampone di lisi: Mix 50 mM Tris • HCl pH 7.4, 150 mM sodio chloride [NaCl], 1 mM EDTA, e 1% Triton X-100, con 1 mM PMSF [PMSF], e 10 microlitri / ml di cocktail inibitore di proteasi per uso con cellule di mammifero ed estratti tissutali [PIC; Sigma]. Fai subito prima dell'uso.
- Differenzialmente microcentrifuga le sospensioni a 2.000 xg per 5 min, e a 13.000 xg per 10 min a pellet i detriti cellulari e il DNA, rispettivamente. Raccogliere il surnatante (qui di seguito denominata la "lisato").
- Aggiungere 1 mg di proteina lisato e 1 mg sia del SMRwt o SMRmut peptide di 20 l di anti-FLAG M2 Affinity Gel (qui di seguito denominata "resina", Sigma). Si noti che sia SMRwt e SMRmut usato qui hanno una sequenza di tag bandiera incorporata nei peptidi. Portare la miscela a un volume finale di 1 ml in tampone Co-IP (α-FLAG Lysis buffer meno PMSF e PIC). Incubare la miscela a 4 ° C per una notte con rotazione end-over-end. Come controllo negativo, incubare il lisato con la resina in assenza di entrambi peptide.
- Pellet resina mediante microcentrifugation a 5000 - 8000 xg per 30 sec. Lasciare resina riposare per 2 minuti prima di maneggiare il campione e poi aspirare il surnatante. Rimuovere il surnatante con una pipetta stretta-end, o una siringa Hamilton, facendo attenzione a non trasferire la resina. Puntali Narrow-end possono essere effettuate utilizzando pinze per pizzicare l'apertura di un puntale di plastica fino a quando non viene parzialmente chiusa. Lavare la resina quattro volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio (50 mM Tris HCl pH 7,4 •, e 150 mM NaCl). Eluire le proteine cellulari associate con 15 pg di peptide FLAG 3X (Sigma) in 50 ml di tampone di lavaggio e incubare a bilico / agitatore per 30 min a temperatura ambiente.
- Concentrare gli eluati per precipitazione acetone, seguito da bollire in tampone Laemmli (Bio-Rad). Separare le proteine mediante SDS-PAGE su un 4-20% Tris-HCl Criterion prefabbricati gel (Bio-Rad). Macchiare il gel con Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Nota: per gli esperimenti di identificazione di spettrometria di massa (
- Co-immunoprecipitazione con proteina Nef-GFP
- Mescolare 50 ml di proteina G Dynabeads sfere magnetiche (Invitrogen) con 2 pg di anticorpo monoclonale murino anti-GFP in 1 ml di 1X PBS con 0,02% di Tween 20 (PBS-T). Incubare la miscela con rotazione end-over-end in una provetta Eppendorf da 1,5 ml per 1 ora a 4 ° C.
- Separare le perline dal buffer ponendo la provetta in un 1,5 ml Magnasphere Tecnologia basamento separazione magnetica (Promega Corp., Madison, WI) permettendo pulldown magnetica seguita dalla rimozione del supernatante. Lavare le perline rivestite anti-GFP con 1 ml di PBS-T utilizzando pipettaggio delicato.
- Lyse Nef-GFP cellule Jurkat trasfettate con 1 ml di 1X RIPA + tampone pipettando dolce e incubazione per 15 min su ghiaccio. RIPA + buffer: 10X RIPA Lysis Buffer, pH 7.4 [Millipore, Bedford, MA] 1:10 diluita in acqua sterile, 0,02% di sodio azide [sigma], e il 0,1% di sodio dodecil solfato [SDS], con 1 mM PMSF e 10 microlitri / ml PIC aggiunto immediatamente prima dell'uso.
- Pellet i detriti cellulari da microcentrifugation a 2.000 xg per 10 min. Raccogliere il surnatante (qui di seguito denominata la "lisato").
- Aggiungere 1 mg di proteina lisato alle perline rivestite di anti-GFP, portare il volume finale di 1 ml con 1X tampone RIPA +, ed incubare la miscela con rotazione end-over-end per 1 ora a 4 ° C. Nota: Per gli studi di peptide concorrenza, 1 mg di proteina lisato può essere pre-incubate con 2 mg di SMRwt o SMRmut peptide in 1 ml di 1X RIPA + tampone, prima di essere aggiunti alle perle rivestite anti-GFP.
- Lavare le perline mediante risospensione in 1 ml di tampone di lavaggio (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl e 0,1% di Tween 20). Incubare con rotazione end-over-end per 5 minuti a 4 ° C. Separare le perline from il lavaggio con il supporto separazione magnetica. Lavare le perle di una seconda e terza volta con tamponi di lavaggio contenenti 250 mM e 300 mM di NaCl, rispettivamente.
- Risospendere le sfere in 200 microlitri di PBS, trasferire la miscela in una provetta pulita, e separare le perline dal lavaggio sul supporto magnetico. Lessate le perline in 50 ml di campione Laemmli buffer di 5 min a 95 ° C, lasciare raffreddare il composto per 10 minuti a temperatura ambiente, e poi mettere il composto sul supporto magnetico per la separazione, e raccogliere il surnatante ("eluati") .
- Separare le proteine del eluato da SDS-PAGE su un Tris-HCl Criterion gel prefabbricato 8-16%.
- Spettrometria di massa
- Accise le bande proteiche di interesse dal gel Coomassie macchiati.
- Ridurre i campioni in 10 mM 1,4-ditiotreitolo (DTT) per 45 min a 37 ° C.
- Alchilata i campioni a 55 mm iodoacetamide per 45 min a 25 ° C.
- Digerire i campioni durante la notte con il sequenziamento tentativo di gradoPSIN (Promega) a 37 ° C.
- Desalt i peptidi di esempio con C-18 ZipTip (Millipore). Mescolare i peptidi del campione con alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), e individuarli su una MTP bersaglio telaio III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
- Eseguire tandem laser desorbimento / ionizzazione volta assistita dalla matrice di volo (MALDI-TOF/TOF) spettrometria di massa utilizzando un Bruker Daltonics Ultraflex III TOF / TOF.
- Confrontare i dati MS / MS per i database non ridondanti e Swiss-Prot NCBI utilizzando l'algoritmo di Mascot ( www.matrixscience.com ).
- Immunoblot analisi
- Separare i campioni di proteine mediante SDS-PAGE il 4-20% o 8-16% Tris-HCl Criterion prefabbricati gel (Bio-Rad). Trasferire le bande elettroforesi su una membrana di nitrocellulosa.
- Lavare la membrana in soluzione salina tamponata Tris (TBS, Bio-Rad) per 5 min. Bloccare con il 5% di latte scremato in TTBS (TBS con il 0,1% di Tween 20) per 1 ora agitando a temperatura ambiente.
- Elaborare la membrana per immunoblotting usando uno specifico anticorpo primario in 5% di latte scremato in agitazione a 4 ° C durante la notte. Lavare in TTBS per 20 min seguito da un coniugato HRP IgG (H + L) anticorpo secondario in 5% di latte scremato per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare in TTBS per 30-60 min.
- Rileva le bande di proteine mediante Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Esporre il filtro a pellicola fotografica. Nota: In alcuni esperimenti, un reagente di strippaggio è stato utilizzato per striscia la membrana (Pierce, Rockford, IL) con successiva ibridazione con un anticorpo primario e secondario diverso.
- Eseguire la scansione delle pellicole radiografiche in Adobe Photoshop 5.0.2. Eseguire l'analisi densitometrica utilizzando il software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
II. L'uso di anticorpi Inibizione in Analisi Funzionale
II.1. La co-trasfezione di anticorpiIES utilizzando il Carro Protein consegna kit reagenti
- Per ogni miscela di reazione di trasfezione, diluire 1 pg di wtNef-GFP DNA plasmidico e 1 mg di anticorpo anti-sia mortalin o anti-α-tubulina anticorpo, per un volume finale di 100 microlitri di PBS 1X. Nota: Precedentemente scoperto che la co-trasfezione del anticorpo anti-α-tubulina ha alcun effetto rilevabile sulla secrezione exNef, e, quindi, serve come un efficace controllo negativo in questi esperimenti.
- Diluire 6 pl di reagente non diluito Chariot ad un volume finale di 100 microlitri di acqua sterile, e combinare con la miscela di DNA-anticorpo diluito.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la formazione del Carro / complesso DNA-anticorpo.
- Pellet 3 x 10 5 cellule Jurkat per centrifugazione a 600 xg per 5 min.
- Lavare le cellule due volte con PBS 1X e risospendere in Chariot / complesso DNA-anticorpo.
- Aggiungere 400 microlitri di siero terreno RPMI 1640 alla sospensione e incubare la cells in piastre di coltura a 37 ° C per 2 ore.
- Aggiungere 1 ml di fresco RPMI 1640 contenente 10% FBS per ciascuna piastra, e incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C.
II.2. Nef-GFP secrezione Fluorescente Piastra Reader Saggio di anticorpo Inibizione
- Raccogliere i media condizionata, privi di cellule dalle cellule raccolte, e trasferire 100 ul a singoli pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero.
- Misura fluorescenza GFP nei media su un Tecan GENEios fluorimetro con lunghezza d'onda di eccitazione 485 nm e 515 nm di lunghezza d'onda di emissione in unità fluorescenti relativi.
- Impostare il livello di fluorescenza GFP nel controllo (supporti da cellule co-trasfettate con Nef-GFP e anti-α-tubulina anticorpo) a 100%.
- Confrontare questo al livello di fluorescenza GFP nei media dalle cellule co-trasfettate con anticorpo anti-mortalin per determinare cambiamenti nella secrezione Nef-GFP.
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Representative Results
Mappatura Motivi biologicamente funzionale utilizzando peptidi. Due regioni sono state identificate sulle proteine Nef che inducono l'apoptosi. Apoptosi Peptide-driven è stato osservato (Figura 2) che inizia con peptide N50 (AA30-50), con un picco a N60 (AA40-60) e N70 (AA50-70), e la diminuzione di livelli di fondo di peptide N100 (aa80-100). Il principale Motif 1 (M1) di picco, centratura su AA50-60, induce> 80% dei livelli apoptotici della proteina Nef intera lunghezza. Un secondo, più piccolo picco apoptotica è osservato che attraversa peptidi N180 (aa160-180) e N190 (aa170-190). Questa minore Motivo 2 (M2) di picco, centrata su aa170-180, induce ~ 30% dei livelli apoptotici della intera lunghezza proteina Nef 16.
Analisi inibizione competitiva utilizzando peptidi. Nella Figura 3, peptidi contenenti un SMR intatto inibito significativamente la secrezione exNef. Ciò era vero se il motivo era situato all'estremità N-terminale (Wildtype-1) o medio (Wildtype-2) del peptide, o è stato duplicato nel peptide (Wildtype-3). Alternativamente, alanina-sostituzione di qualsiasi amminoacido del motivo, indipendentemente dalla posizione del motivo o numero nel peptide, abrogata la funzione del peptide 18. Un 11-ammino-acido scrambled versione di apoptotica Motif 1 di Nef (SM1), descritto in precedenza 14, ottenuti dalla Sigma Genosys, è stato utilizzato come controllo negativo e non ha avuto effetto sulla secrezione exNef. Vedere la Tabella 1 per un elenco delle sequenze peptidiche.
Isolando Motif Partners associazione utilizzando peptidi come esca. Figura 4A illustra la co-immunoprecipitazione di quattro proteine mediante il peptide SMRwt (60, 65, 75, e 250 kDa). Il controllo negativo SMRmut peptide non cattura queste proteine, e queste proteine non interagiscono in modo non specifico con la resina di affinità in assenza del peptide, suggerendo che le proteine co-immunoprecipitate interagivanospecificamente con i motivi SMR del peptide SMRwt. Queste proteine sono state successivamente identificate mediante MALDI-TOF spettrometria di massa tandem (vedi Figura 4B per un campione rappresentativo), e verificati da immunoblot analisi 18.
L'uso di anticorpi Inibizione in Analisi Funzionale. Inibizione con anticorpi anti-mortalin secrezione exNef completamente abolito (Figura 5). Ciò ha confermato che una interazione Nef / mortalin intatto è necessaria per la secrezione exNef. Inoltre, suggerisce fortemente che il meccanismo con cui il peptide SMRwt inibisce la secrezione exNef è attraverso rottura di questa interazione dalla competizione diretta per mortalin 18.
Tabella 1. Pannello di peptidi SMR sviluppati e testati per il loro effetto sulla secrezione exNef Nef-indotta. Questa schedaLe è stato originariamente pubblicato nel Shelton et al., JVI, 2012 18. In studi precedenti, alanina-sostituzione dei singoli amminoacidi del motivo SMR significativamente ridotta o abolita, secrezione indotta Nef 18. Virus isolato da un nonprogressor lungo termine esprime una variante di Nef con una isoleucina al posto del V66,. Una delle poche variazioni riportate nel altamente conservata SMR motif 20 Clicca qui per vedere tabella più grande .
Figura 1. Effetti della exosomes Nef sui principali tipi di cellule immunitarie. Questa modella mostra exNef rilasciata dalle cellule infette, ed i suoi effetti sulle cellule monociti e cellule linfocitarie che avrebbero portato al predetto AIDSpatogenesi. AICD, l'attivazione della morte cellulare indotta. I. infetti da virus cellula stampa, exosomes normali, e exNef. exNef attiva non attivati, monociti infetti (B). L'attivazione dei monociti (C) si traduce in cambiamenti nell'espressione genica che portano a un aumento dello stato infiammatorio e di conseguenza l'attivazione e l'esaurimento dei CD4 + e CD8 + T-cellule. II. Virus infetta cellule stampa, exosomes normali, e exNef. exNef attiva non attivati, i linfociti non infettati (D). I linfociti attivati (E) subiscono cambiamenti di espressione genica che si traducono in AICD determinando un cellulare per apoptosi (F). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Peptidescansione e l'analisi della proteina HIV-1 Nef per motivi apoptotico (s). Un insieme di peptidi 20mer, ognuna con 10 sovrapposizione aminoacidi, che attraversano i 205 amminoacidi della proteina Nef KNFS, è stato ottenuto dal Programma reagente AIDS e usato a mappare i domini apoptotici Nef. Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Huang et al., JVI, 2004 13. L'asse Y mostra la percentuale di cellule che sono TUNEL etichettati, e l'asse X indica la condizione di trattamento. Proteina completa Nef [Nef], cellule non trattate [UT], oppure i peptidi che iniziano con AA1-20 [N20], e termina con AA190-205 [N205]. Barre di errore indicano l'errore standard di misura, ed i risultati sono una combinazione di almeno tre esperimenti indipendenti. I picchi di apoptosi sono indicati con Motif 1 e Motif 2.
Figura 3. SMRwt peptide inibisce exNef. Peptidi contenentiuna o più sequenze di tipo selvatico Nef SMR motivi inibito la secrezione di exNef, mentre alanina-sostituzione di qualsiasi acido animo di questa regione fortemente ridotta efficacia del peptide. Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Shelton et al., JVI, 2012 15. I mezzi di coltura di cellule T Jurkat, co-trasfettate con un clone Nef-GFP e diversi peptidi SMR, sono stati analizzati per la secrezione exNef. La quantità di GFP fluorescenza misurata è equivalente alla quantità di exNef-GFP nei media extracellulari. Significatività statistica è stata determinata utilizzando un t-test non appaiati. L'effetto sulla secrezione di exNef vari peptidi è stata confrontata con quella di un peptide di controllo casuale criptato (SM1; * p-value <0.05; ** p-value <0.01; *** p-value <0.001).
Figura 4. Il peptide SMRwt interagisce specificamente con proteine della cellula ospite, tra cui mor Talin. (A) Proteine da cellule T Jurkat sono stati co-immunoprecipitati sia con il SMRwt o peptidi SMRmut utilizzando anti-FLAG M2 anticorpo ad accoppiamento di resina di affinità. Si noti che sia SMRwt e SMRmut usato qui hanno una sequenza di tag bandiera incorporata nei peptidi. Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Shelton et al., JVI, 201215. Questa procedura è stata ripetuta in assenza del peptide sia come controllo per le interazioni non specifiche con la resina di affinità. Il Coomassie blu macchiato gel nella foto mostra le proteine con pesi molecolari di 60, 65, 75, e 250 kDa (punte di freccia), trainati dalla SMRwt che non sono stati tirati giù dal peptide SMRmut o senza peptide. (B) La banda di 75 kDa è stata escissa dal gel, tripsina-digerito, e analizzati mediante MALDI-TOF spettrometria di massa tandem. La MS / MS Ion Ricerca ha identificato i 75-kDa come mortalin. Frecce indicano le sequenze dei peptidi corrispondenti.large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura
Figura 5. Mortalin anticorpi inibizione blocchi secrezione exosome. Terreni di coltura extracellulare da cellule Jurkat, co-trasfettate con un clone Nef-GFP e gli anticorpi contro l'uno o mortalin o α-tubulina, sono stati analizzati per la secrezione exNef. Quando confrontato l'effetto di un anticorpo contro una proteina coinvolta nella secrezione non exNef (α-tubulina), interruzione dell'attività di mortalin dal suo anticorpo provocato completa soppressione della secrezione exNef. Significatività statistica è stata determinata mediante il t-test non appaiati confrontando secrezione exNef in presenza dell'anticorpo mortalin contro l'anticorpo α-tubulina (*** p-value <0.001). Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Shelton et al., JVI, 2012 18.
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Discussion
La comprensione dei meccanismi alla base della capacità di Nef di manipolare il percorso traffico exosomal sarà utile in nuovi inibitori di ingegneria di secrezione exNef. L'inibizione della secrezione exNef dovrebbe diminuire la deplezione delle cellule T CD4 e della CIA che guidano l'HIV / AIDS patogenesi. Verso questo obiettivo, abbiamo sviluppato una serie di nuovi reagenti e delle metodologie che ci ha permesso di analizzare la genetica di secrezione exNef, e cominciamo a determinare le proteine cellulari coinvolte. Questo approccio ha portato allo sviluppo del primo inibitore di indirizzare direttamente la secrezione exNef, il peptide SMRwt.
Una conclusione fondamentale del nostro lavoro è che brevi peptidi specifici derivati da motivi trovati nelle proteine integrali, nel nostro caso HIV-1 Nef, conservano non solo la loro funzione biologica, ma può anche inibire competitivamente la funzione della proteina intera. Poiché questi peptidi mantengono la loro funzione biologica, possono essere utilizzati per identificare domini funzionalinella proteina intera. Due cose sono necessarie: la generazione di peptidi che scandiscono la proteina di interesse, sia la sua intera lunghezza o di una regione della proteina pensato per contenere il dominio funzionale, e un saggio per testare la funzione biologica in questione. Dal momento che ci mancavano le informazioni che ci permetterebbe restringere la nostra ricerca di motivi che inducono l'apoptosi a specifiche regioni del Nef, abbiamo utilizzato una serie di peptidi di scansione tutta la sua lunghezza. Mentre questo processo è stato reso più semplice dalla dimensione relativamente piccola di Nef, abbiamo anche applicato questo approccio per grandi (> 75 kDa) proteine. Un saggio ben consolidata per misurare l'apoptosi (TUNEL) è stato impiegato per identificare peptidi mantenendo la funzione biologica di interesse, in questo caso, Nef apoptosi indotta di cellule T CD4. Interessante, la successiva analisi nel documento originale ha dimostrato che i peptidi identificati apoptotiche trattenuti> 80% dell'attività biologica della proteina Nef intera lunghezza, e inibito competitivamente CXCR4 vincolantedel suo ligando naturale SDF-1α.
Allo stesso modo, un corto peptide contenente il motivo SMR di Nef ha mantenuto la sua capacità biologica di interagire con le proteine cellulari coinvolte nella secrezione exNef. Tuttavia, in questo esempio la ritenzione di attività non ha portato a mimetismo di una funzione di Nef, come è avvenuto con l'induzione di apoptosi, ma ha portato invece alla inibizione. Poiché il peptide SMRwt efficacemente vincolato i siti di legame SMR di queste proteine cellulari, perturbato loro interazioni con Nef, e di conseguenza, impediva la secrezione di Nef in exosomes. Come il motivo Nef di interesse era noto da precedenti studi di mappatura genetica, siamo stati in grado di limitare lo sviluppo del peptide alle variazioni del SMR. Invece di identificare nuovi motivi funzionali, abbiamo usato questi peptidi, e un saggio basato sulla fluorescenza precedentemente sviluppato per misurare la secrezione exNef, per dimostrare che il ruolo della SMR nella secrezione exNef era legato direttamente alla sua specifica sequenza primaria.
HIV-1, Human Protein Interaction Database elenca più di 60 proteine cellulari che interagiscono direttamente con Nef e forse addirittura 200 che interagiscono direttamente o indirettamente 19. Limitando la sequenza della nostra proteina esca per il motivo di interesse, abbiamo evitato di dover ordinare attraverso le decine di proteine che sarebbe stato co-immunoprecipitata dalla proteina Nef full-length. La maggior parte di queste proteine, mentre specifica per Nef, non sarebbe partner di legame per SMR di Nef, e costituirebbe così sfondo / rumore. Un calcolo conservativo è che abbiamo ridotto il rumore da 15x (60/4). In sostanza, il nostro approccio effettivamente aumentato il rapporto segnale-rumore di fondo, riducendo al minimo a causa di off-site, o nel nostro caso vincolante off-motiv, che ci permette di identify proteine che si legano specificamente la SMR. Tuttavia, è possibile che, utilizzando questo metodo, non siamo riusciti a catturare tutti proteine cellulari SMR leganti, in particolare quelli che richiedono l'interazione sia con la SMR ed un secondo motivo di impegnare Nef, o il cui legame è dipendente secondaria o struttura terziaria.
Mortalin, una proteina cellulare co-immunoprecipitati dal peptide SMRwt, ha dimostrato di essere necessario per la secrezione exNef da miRNA knockdown e l'inibizione degli anticorpi. Il primo è una tecnica ben consolidata che riduce o elimina l'espressione della proteina mirata. Viceversa, l'inibizione anticorpo non pregiudica i livelli di espressione della proteina, ma invece inibisce fisicamente l'interazione della proteina bersaglio con altre proteine. Abbiamo utilizzato questo secondo metodo per dimostrare l'importanza dell'interazione Nef-mortalin per la secrezione exNef. Inibizione anticorpo è una procedura straight-forward che richiede un metodo per introdurre l'anticorponella cella e un saggio per testare il suo effetto sulla funzione biologica in questione. Abbiamo usato il Carro proteine reagenti consegna agli anticorpi anti-mortalin navetta nella cellula, e il già citato saggio basato sulla fluorescenza per misurare i cambiamenti nella secrezione exNef. Come la maggior parte delle procedure basate su anticorpi, l'efficacia di inibizione anticorpo è limitata dalla affinità e specificità dell'anticorpo per la proteina mirata.
Un importante obiettivo di ricerca di HIV è lo sviluppo di nuove terapie e l'identificazione di potenziali bersagli per la terapia. Le procedure descritte qui di leva corti peptidi specifici, che mantengono la loro funzione biologica e può inibire competitivamente la funzione delle proteine integrali, per accelerare questo processo. Mentre gli esperimenti descritti erano diretti a comprendere una funzione chiave HIV, le tecniche impiegate dovrebbero essere applicabili allo studio di interazioni proteina-proteina e lo sviluppo di peptide-basedinibitori in vari campi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finanziamenti GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA concessione F31AI091484, Emory CFAR concessione P30 A1050409. Questa indagine è stata condotta in una struttura costruita con il supporto di strutture di ricerca di miglioramento di Grant # C06 RR18386 dal NIH / NCRR. Le cellule Jurkat, l'insieme di 20 HIV-1 Nef peptidi, così come il coniglio anti-HIV-1 Nef antisiero sono stati ottenuti dal NIH AIDS Research & Programma reagente di riferimento, (Rockville, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
References
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