Summary
エキソソームにおけるHIV-1 Nefの分泌のメカニズムを分析するための技術が記載されている。ネフとタンパク質トランスフェクション由来特有の短いペプチドは、構造、機能、ネフの分泌の変更地域の結合パートナーを決定するために悪用された。これらの手順は、多くの機械論的研究で一般的な関連性を持っている。
Abstract
我々の場合、HIV-1 Nefので、全長タンパク質で見つかったモチーフ由来特有の短いペプチドは、その生物学的機能を保持するだけでなく、競争力のある、全長タンパク質の機能を阻害することができるだけでなく。 20のNef走査ペプチドは、各々がその隣の10アミノ酸が重複する長さが20アミノ酸のセットは、アポトーシスの誘導のための責任のNefでモチーフを同定した。これらのアポトーシスモチーフを含むペプチドは、完全長のNef蛋白質に匹敵するレベルでアポトーシスを誘導した。ネフの分泌の変更地域（SMR）から派生した第二のペプチドは、エキソソームにネフの分泌（exNef）に関与する細胞のタンパク質と相互作用する能力を保持した。このSMRwtペプチドはNefのSMRのモチーフに特異的に結合する細胞タンパク質を単離するために、共免疫沈降実験で "餌"タンパク質として使用した。タンパク質のトランスフェクションおよび抗体阻害は、物理的に相互作用ベットを破壊するために使用された予期するとNefのモータリン、単離されたSMR結合タンパク質の一つであり、効果は、蛍光ベースのexNef分泌アッセイを用いて測定した。 SMRモチーフをバインド細胞タンパク質の完全長のネフをoutcompeteするSMRwtペプチドの能力、それexNef分泌の最初阻害する。このように、完全長のタンパク質に見出さモチーフ由来特定の短いペプチドのユニークな特性を利用してここに記載された技術を採用することにより、一つのタンパク質における機能モチーフの同定と病原性機能のペプチド系阻害剤の開発を加速させる可能性があります。
Introduction
抗レトロウイルス療法の出現により、西部の世界のエイズ流行は鈍化したが、縮小しない、そしてHIVの蔓延は、世界中の主要な健康上の負担であり続けてきた。わずかに効果的なRV144タイ裁判を除いて、HIVワクチンは、これまで感染から守るための失敗を示している。したがって、追加の、潜在的な治療標的の研究はまだ保証されています。
CD4 T細胞枯渇とともに、永続的な一般的な免疫活性化は、HIV感染症の特徴です。この慢性的な免疫活性化（CIA）は、細胞の代謝回転、活性化され、差別化リンパ球亜集団、細胞の枯渇や老化、及び活性化誘導細胞死（AICD）1,2,3を経由してT細胞とB細胞の殺害の増加につながり、それはよく病気の進行4,5,6,7,8,9,10,11,12最強の予測因子の一つとして確立されています。しかし、メカニズムはCIAとCD4の基礎となるHIV感染T細胞枯渇は完全に解明されていない。
私たちの研究室や他の人からの証拠は、HIVタンパク質ネフは（負の調節因子）HIV-1感染細胞13,14からエキソソームでその分泌を誘導する前記疾患の進行のためのモデル（ 図1）に私たちを導いた。これらネフ含有エキソソーム（exNef）が感染していないCD4 T細胞15,16を含む細胞系統数のアポトーシスを誘導する。あるいは、単球/マクロファージexNefを変化させる遺伝子の発現パターン、 例えば、サイトカイン発現、およびスケジュールされていない免疫活性化状態を誘導すると思われる。証拠のこのボディは、CIAとCD4 T細胞枯渇exNefための重要な役割を示唆している。
エキソソーム売買経路がexNef分泌のエンジニアリング小説の阻害に有用であろう操作するネフの能力のメカニズムを理解する。 exNef分泌の阻害は、CD4 T細胞の枯渇を減少させるべきであるそしてCIAそのドライブHIV / AIDS発病。
HIV / AIDS疾患の進行と、このモデルの上に構築され、その後のデータのための我々のモデルにつながった証拠を集めるために、私たちは私たちがexNef分泌の遺伝学を分析するために許可された斬新な試薬および方法論の数を開発し、決定するために開始細胞タンパク質が関与。初期の研究では、Nefのタンパク質が、バイスタンダー細胞のアポトーシスを誘導し、Nefのトランスフェクトし、HIV感染細胞から細胞外に15を解放していることがわかった。 SDF-1α由来のペプチドは、（選択的スプライシングアルファ因子-1由来間質細胞、）以前に、完全長分子17の結合およびシグナル伝達活性の多くを保持することが示されていた。我々はNefとのペプチドは、完全なタンパク質のアポトーシス活性の一部、及びこれらのペプチドは、必ずしもNefのアポトーシスのドメインを含むであろうことを保持するかもしれないと推測した。これらのペプチドを同定し、その結果のNefするにはアポトーシスドメイン（s）は、私たちは、NIH AIDS研究およびリファレンス試薬プログラムからの20 HIV-1 Nefのスキャニングペプチドのセットを取得しました。これらの20-AAペプチド、その隣人の各重複10アミノ酸は、彼らの最後のアミノ酸、 すなわち N20スパンネフアミノ酸1-20、N30スパンネフアミノ酸11-30、など16の数で名前が付けられています。我々は、これらの細胞のアポトーシスを誘導したフルレングスのNefタンパク質に二つの異なる10-AAドメインを重複特定のペプチドに細胞外にT細胞を露出することがわかった。これらネフ由来アポトーシスペプチドのその後の分析は、物理的にこれらのペプチドが競争CXCR4とその天然のリガンドがSDF-1αの間の結合を阻害するために許可された結合動態とT細胞の表面上のケモカイン受容体CXCR4と相互作用する能力を明らかにした。最後に、CXCR4とNefのアポトーシス誘導ペプチド '相互作用は、アポトーシスをもたらすこれらのT-細胞におけるストレス応答を誘導することが見出された。この証拠はQUICに私たちを許さKLYマップネフの機能ドメイン、例えばアラニンスキャニング変異誘発のような標準的なDNA変異誘発技術を使用して、はるかに長い時間かかったでしょうプロセス。また、これらの短いNefの由来ペプチドは、全長タンパク質におけるアポトーシスドメインの生物学的機能を保持することを示した。
外ネフ、T細胞、すなわちアポトーシスの役割を同定したので、私たちは、ネフは細胞から分泌されたかの理解を求めた。変異ネフコンストラクトのシリーズを使用して、我々は、HIV Nefの両方のN末端 領域で高度に保存されたのNefタンパク質モチーフにマッピングされ、exNef分泌13のために重要であるそのアカゲザル同等SIV マック （サル免疫不全ウイルス）ネフ、。これらのモチーフの一つで、分泌の変更地域（SMR、66VGFPV70）は、どちらか大幅に削減または廃止exNef分泌その5つのアミノ酸のうちのいずれかのアラニン置換として、特に重要でした。アクティブなモチーフのCを介して細胞に送達する場合hariotタンパク質デリバリー試薬、FLAGペプチド配列（SMRwt）に取り付けられたSMRを含むペプチドは、両方のNefのトランスフェクトし、HIV感染細胞18からexNef分泌を阻害することが見出された。ペプチドと私たちのこれまでの経験に基づいて、我々は、分子やexNef分泌のネフSMRの役割のメカニズムを解明するために、このペプチドを使用することを決めた。
私達の"baitタンパク質"としてSMRwtペプチドを使用して、我々は非感染T細胞溶解物18からSMRの細胞結合パートナーを共同免疫沈降。 FLAGペプチド配列は、抗FLAGアフィニティー樹脂を用いSMRwtペプチドを捕捉するための便利なハンドルを提供した。 SMRwtペプチドの変異をアラニンに単一のバリンがexNef分泌の阻害を廃止するために十分であることが我々の以前の発見は、私たちがSMRに特異的ではないの共免疫沈降したタンパク質を排除するために使用する便利な、非常に特異的なコントロールペプチド（SMRmut）を同定した。 sのペプチドを用いpecific興味のあるドメインではなく、全長タンパク質は、私たちは、ネフ19内の他のドメインに結合する細胞因子の数十のスクリーニングをバイパスすることができました。
かつて我々はSMR-結合パートナーを同定し、論理的な次のステップは、同定された細胞の結合パートナーは、生物学的機能18のために重要であることを示すことだった。これを実現するための標準的な手順は、標的タンパク質に特異的なmiRNA又はsiRNA、および生物学的機能に続いてアッセイを用いてノックダウン効果のタンパク質レベルである。我々は、この場合には、SMR結合タンパク質をそのターゲットの産生を減少させる、標的mRNAの翻訳を阻害する、miRNAのノックダウンを行う。標的タンパク質のこの減少は、間接的な効果であり、おそらく標的タンパク質が入っ従って、我々はまた、活性を直接破壊することかどうかを判断するために、あまり一般的抗体阻害技術を用い役割を果たしている生物学的機能で遅延効果を有する標的タンパク質は、生物学的機能を低減または排除する。この手順では、標的タンパク質に対して惹起された抗体は、戦車試薬を用いて細胞にトランスフェクトされ、その関数のサイトから標的タンパク質と直接相互作用のいずれか封鎖、またはその関連結合ドメインを遮断する。この手順を介して標的タンパク質の阻害は、直接その機能を破壊し、さらに生物学的機能に標的タンパク質の重要性を確認することにより、RNAのノックダウン手順を補完することができる。
戦車試薬は、細胞にペプチドおよびタンパク質を送達するのに有効であるが、このプロセスは時間がかかると、実験の種類を制限するなどの長時間または繰り返し暴露およびインビボ動物試験で行うことができる。したがって、我々は、受動的に細胞に取り込まれる可能性ペプチドを生成するためにSMRwtペプチド（CPP-SMRwt）18細胞透過性ペプチド（CPP）シーケンスを添加培地から。このバージョンでは、阻害exNef分泌の元と同じくらい効果的であった。
これらの公表の実験から得られた証拠は、競争力の阻害を介して、全長タンパク質の機能に拮抗し、これらのモチーフを結合するタンパク質を分離するために、特定の機能的なモチーフを含む小さなペプチドの能力を示しています。一つは、これらの技術は、多くの実験プロトコルに有用であることを期待する。また、多くの細胞プロセスの工学新規なペプチド阻害するのに有効であるべきである。CPPの配列への結合によってさらに向上させることができる機能。
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Protocol
I.は、生物学的解析でショートペプチドの使用
I.1。ペプチドを用いて生物学的に機能モチーフのマッピング
- Nefの走査ペプチドで細胞を処理する
- 関心領域を走査するペプチドのセットを調達。全体のHIV-1のNefタンパク質（205 AA）をまたがる10のアミノ酸重なると私たちの実験では、20merのペプチドについては、エイズ試薬プログラムから得られた。ペプチドは、次のように個別に分析しています：
- 細胞培養培地にペプチド10ngの/ mlを加える。
- 細胞培養をジャーカットするプレートあたり培地10mlのを追加します。
- 37℃で24時間培養する℃に
- ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPをビオチンニック末端標識（TUNEL）アポトーシスのアッセイ
- 1X PBSで細胞を洗浄し、1×PBS、pH7.4の中の4％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定する。
- 10 1X PBSで洗浄し、0.1％と透過性トリトンX-100室温で分。
- 1X PBSで2回細胞を洗浄します。
- コンピュータ制御顕微鏡システム上落射蛍光で染色された細胞をカウントします。
I.2。ペプチドを用いた競合阻害分析
- チャリオットタンパク質デリバリー試薬キットを用いたペプチドの同時トランスフェクション
- トランスフェクション反応混合物につき、と100μlの最終容量を、wtNef-GFPプラスミドDNA1μgのとSMRモチーフ内の個々のアミノ酸のアラニン置換を含む野生型SMRドメイン由来のペプチド、またはペプチドどちら100ngのを希釈1X PBS。
- 滅菌水で100μlの最終容量にチャリオット試薬の1/10に希釈6μLを希釈し、希釈したDNA-ペプチドミックスと組み合わせる。
- 戦車/ DNA-ペプチド複合体の形成を可能にするために30分間室温でインキュベートする。
- 5分間600×gで遠心分離によってペレット3×10 5 Jurkat細胞。
- 1X PBSで2回細胞を洗浄し、チャリオット/ DNA-ペプチド複合体で再懸濁します。
- 懸濁液に無血清RPMI1640培地400μlのを追加し、2時間37℃で培養プレートで細胞を培養する。
- 各プレートに10％FBSを含む新鮮なRPMI 1640培地1mlを加え、37℃で48時間、細胞をインキュベート℃に
- 収穫細胞や蛍光顕微鏡法によるトランスフェクション効率を決定する。
- ペプチド阻害のNEF-GFP分泌蛍光プレートリーダーアッセイ
- 収穫された細胞からの無細胞馴化培地を収集し、96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのを転送します。
- 励起波長485 nmおよび発光波長の相対蛍光単位で515 NmのテカンGENEiosの蛍光のメディアでGFPの蛍光を測定します。
- コントロールでGFP蛍光のレベルを設定する（セルからメディアがネフ-GFPとスクランブルペプチドと共トランスフェ）100％時。
- ネフ-GFPの分泌の変化を判断するために、様々なSMRペプチドを共トランスフェクトした細胞からメディアにおけるGFP蛍光のレベルにこれを比較してください。
I.3。餌としてペプチドを用いMotifの結合パートナーを分離
- SMRのペプチドと免疫共沈降
- 37℃、10％FBSを含有するRPMI 1640培地中Jurkat細胞を成長さT-75組織培養フラスコ内℃、4℃で20分間、1,000×gで遠心分離によって細胞をペレット化℃でトランスフェクション効率を決定し、蛍光顕微鏡下でプレートを配置することにより、画像をキャプチャし、その後、合計と標識された細胞をカウントし、パーセント標識された細胞を決定します。
- 1ミリリットル1X PBSで細胞ペレットを再懸濁し、そして1.5 mlのエッペンドルフチューブに移す。 1分間、1,000×gで遠心。穏やかなピペッティングにより1ミリリットルα-FLAGの溶解バッファーでペレットを再懸濁します。溶解バッファー：ミックス50mMトリス•HClでpHは7.4、150mMのナトリウムCHLoride [塩化ナトリウム]、1mMのEDTA、1％トリトンX-100、1mMのフェニルメチルスルホニルフッ化[PMSF]、および哺乳動物細胞や組織抽出物で使用するために10ミリリットル/μlのプロテアーゼインヒビターカクテル[PIC;シグマ]。使用する前に、すぐに確認します。
- 差動で5分間2,000 xgで遠心懸濁液を、ペレットに10分、細胞破片やDNA、それぞれ13,000 xgで。上清（以下、 "溶解物"ともいう）を収集。
- ライセートタンパク質1mgのとSMRwtまたはSMRmutペプチド抗FLAG M2アフィニティーゲル（;シグマ以下 "樹脂"と呼ばれる）20μlのいずれかに1μgのを追加します。ここで使用SMRwtとSMRmut両方がペプチドに埋め込まFLAGタグ配列を持っていることに注意してください。共同IP緩衝液中で1ミリリットル（α-FLAG溶解バッファーマイナスPMSFとPIC）の最終体積に混合物を持参してください。転倒回転に4℃で一晩混合物をインキュベートする。陰性対照として、いずれかのペプチドの非存在下での樹脂との溶解液をインキュベート。
- ペレT 5,000で微量遠心により樹脂 - 30秒8,000×gで。樹脂サンプルを取り扱う前に2分のために解決することを許可した後、上清を吸引。任意の樹脂を転送しないように注意しながら、先端の細いピペットチップ、またはハミルトンシリンジで上清を取り除きます。先端の細いピペットチップは、それが部分的に閉じられるまでプラスチックピペットチップの開口部を挟持する鉗子を用いて作製することができる。洗浄バッファーを500μl（50mMトリス•塩酸pH7.4の、および150mMのNaCl）で樹脂を4回洗浄します。室温で30分間ロッカー/シェーカー上洗浄バッファーとインキュベート50μlの3X FLAGペプチド15μgの（シグマ）と結合した細胞タンパク質を溶出。
- レムリ試料緩衝液（Bio-Rad社）で沸騰、続いてアセトン沈殿により溶出液を濃縮する。 4〜20％のTris-HCl基準プレキャストゲル（Bio-Rad社）のSDS-PAGEでタンパク質を分離します。クーマシーブリリアントブルーR-250（Bio-Rad社）を用いてゲルを染色。注：質量分析同定実験のために（
- ネフ-GFPタンパク質と共免疫沈降
- 0.02％のTween 20（PBS-T）で1X PBS 1mlに抗GFPマウスモノクローナル2μgのとのDynabeadsプロテインG磁気ビーズ（Invitrogen社）を50μlを混ぜる。 4で1時間1.5 mlのエッペンドルフチューブに転倒回転との混合物をインキュベート℃に
- 上清を除去し、磁気プルダウンを許可する1.5 mlのMagnaSphereテクノロジー磁気分離スタンド（プロメガ社、マディソン、WI）にチューブを配置することによって、バッファからビーズを分離する。穏やかにピペッティングを用いたPBS-T 1mlの抗GFP被覆ビーズを洗浄してください。
- 1X RIPA 1mLでネフ-GFPトランスフェJurkat細胞+ 15メートルのために穏やかにピペッティングし、インキュベーションによってバッファを溶解氷の上である。 RIPA +バッファ：10X RIPA溶解緩衝液、pH7.4 [ミリポア、ベッドフォード、MA]滅菌水で1:10に希釈、0.02％アジ化ナトリウム[シグマ]、および0.1％ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、1mMのPMSF及び10μlのと/ mlのPICは、使用する前に、すぐに追加された。
- ペレットを10分間、2,000×gで微量遠心により細胞破片。上清（以下、 "溶解物"ともいう）を収集。
- 抗GFP被覆ビーズに溶菌タンパク質1mgのを追加し、1X RIPA +バッファーが付いている1 mlに最終的なボリュームをもたらす、と4℃で1時間転倒回転との混合をインキュベート注：ペプチド競合研究のために、溶解物タンパク質1mgのは1X RIPAを1ml +バッファー、前抗GFP被覆ビーズに追加されるにSMRwtまたはSMRmutペプチド2μgのと共にプレインキュベートすることもできる。
- 洗浄緩衝液1ml（50mMトリス•HClでpHを7.4、150mMのNaCl、および0.1％のTween 20）で再懸濁を通してビーズを洗浄。 4℃で5分のために転倒回転と共にインキュベートビーズfを分離ロム磁気分離スタンドを使用して洗浄します。それぞれ250ミリと300のNaClを含む洗浄バッファーでビーズ第二と第三の時間を洗ってください。
- 200μlのPBSにビーズを再懸濁し、きれいなチューブに混合物を転送し、磁気スタンドに洗浄からビーズを分離する。 95℃のLaemmliサンプル緩衝液で5分間°C、混合物を室温で10分間冷却し、次いで分離用マグネットスタンド上に混合物を配置し、上清を回収することができ（ "溶出"）50μlのビーズを沸騰。
- 8から16パーセントのトリス-HCl基準プレキャストゲルでSDS-PAGEによって溶出液のタンパク質を分離します。
- 質量分析
- 物品税クマシー染色ゲルから目的のタンパク質バンド。
- 37で45分間℃で10mMの1,4 - ジチオスレイトール（DTT）のサンプルを減らす
- 25℃で45分間、55 mMのヨードアセトアミド、℃でサンプルをアルキル化
- 試しグレードシングで一晩サンプルを消化37℃PSIN（Promega社）°C.
- C-18 ZipTip（ミリポア社）で試料ペプチドを脱塩。 α-CHCマトリックス（Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ）でサンプルペプチドを混合し、MTPターゲットフレームIII（ブルカーダルト社、ビレリカ、MA）にそれらを見つける。
- タンデムマトリックス支援レーザー脱離/イオン化ブルカーダルトULTRAFLEX III TOF / TOFを使用して（MALDI-TOF/TOF）質量分析·飛行時間行う。
- マスコットアルゴリズム（使用してNCBI非冗長とスイス- ProtのデータベースへのMS / MSデータ比較www.matrixscience.comを ）。
- イムノブロット解析
- 4〜20％または8から16パーセントのトリス-HCl基準プレキャストゲル（Bio-Rad社）のSDS-PAGEによってタンパク質サンプルを分離する。ニトロセルロース膜に電気泳動バンドを転送します。
- 5分間;トリスでメンブレンを洗浄する（Bio-Rad社TBS）緩衝生理食塩水。 TTBSの5％脱脂乳を持つブロック（TBS 0.1％トゥイーン20）を、室温で振盪することによって1時間。
- 4℃で一晩振とうしながら、5％脱脂乳に特異的な一次抗体を用いたイムノブロッティング用膜を処理します。室温で1時間5％脱脂乳で二次HRPコンジュゲートのIgG（H + L）抗体、続いて20分間TTBSで洗ってください。 30-60分間TTBSで洗ってください。
- ウェスタンブロッティングルミノール試薬（サンタクルズ社、サンタクルーズ、カリフォルニア州）によってタンパク質バンドを検出します。写真フィルムにフィルタを公開します。注：いくつかの実験において、ストリッピング試薬は、異なる一次および二次抗体とのその後のハイブリダイゼーションメンブレン（ピアース、ロックフォード、IL）を除去するために使用された。
- Adobe Photoshopの5.0.2にX線フィルムをスキャンします。 ImageJのソフトウェア（国立衛生研究所、ベセスダ、MD）を使用して、デンシトメトリー分析を行う。
II。機能解析で抗体阻害の利用
II.1。不格好なやつのコトランスフェクションチャリオットタンパク質デリバリー試薬キットを使用するIES
- トランスフェクション反応混合物につき、1X PBSで100μlの最終容量に、wtNef-GFPプラスミドDNA1μgのと抗モータリン抗体または抗α-チューブリン抗体のどちらか1μgのを希釈。注：これは、以前は、抗α-チューブリン抗体の同時トランスフェクションは、exNef分泌に検出可能な影響を与えず、従って、それはこれらの実験において有効陰性対照として役立つことが分かった。
- 滅菌水で100μlの最終容量に原液チャリオット試薬の6μlの希釈し、希釈したDNA-抗体ミックスと組み合わせる。
- 戦車/ DNA-抗体複合体の形成を可能にするために30分間室温でインキュベートする。
- 5分間600×gで遠心分離によってペレット3×10 5 Jurkat細胞。
- 1X PBSで2回細胞を洗浄し、チャリオット/ DNA-抗体複合体に再懸濁します。
- 懸濁液に無血清RPMI1640培地400μlのを追加し、Cをインキュベート37℃で培養プレートでエルボで2時間C。
- 各プレートに10％FBSを含む新鮮なRPMI 1640培地1mlを加え、37℃で48時間、細胞をインキュベート℃に
II.2。抗体阻害のNEF-GFP分泌蛍光プレートリーダーアッセイ
- 収穫された細胞からの無細胞馴化培地を収集し、96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのを転送します。
- 励起波長485 nmおよび発光波長の相対蛍光単位で515 NmのテカンGENEiosの蛍光のメディアでGFPの蛍光を測定します。
- コントロールにおけるGFP蛍光のレベル（セルからメディアがネフ-GFPと抗α-チューブリン抗体で同時トランスフェクト）の100％に設定してください。
- ネフ-GFPの分泌の変化を判断するために抗モータリン抗体を共トランスフェクトした細胞からメディアにおけるGFP蛍光のレベルにこれを比較してください。
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Representative Results
ペプチドを用いた生物学的に機能モチーフのマッピング。二つの領域は、アポトーシスを誘導するのNefタンパク質で同定された。ペプチド主導アポトーシスはN60（AA40-60）とN70（aa50-70）でピークに達し、そしてペプチドN100（AA80-100）でのバックグラウンドレベルに減少、ペプチドN50（aa30-50）を用いて（ 図2）先頭を観察された。 aa50-60を中心とした主要なモチーフ1（M1）のピークは、フルレングスのNefタンパク質のアポトーシスレベルの> 80％に誘導する。第二、小さいアポトーシスピークはペプチドN180（aa160-180）とN190を（aa170-190）スパニング観察された。 aa170-180を中心としたこのマイナーモチーフ2（M2）のピークは、フルレングスのNef蛋白質16のアポトーシスレベルの約30％を誘導する。
ペプチドを用いた競合阻害分析。図3では、無傷のSMRを含むペプチドが大幅exNef分泌を阻害した。モチーフは、N末端（Wildtyに位置していたかどうかこれは本当だったPE-1）又は中間（野生型A-2）のペプチド、またはペプチド（野生型-3）に複製された。また、モチーフの任意のアミノ酸のアラニン置換は関係なく、ペプチド中のモチーフの位置や数、ペプチドの機能18を廃止。 11個のアミノ酸はNefのアポトーシスのモチーフ1（SM1）のバージョンをスクランブル、以前14を説明し、シグマジェノシス社から入手した、ネガティブコントロールとして使用し、exNef分泌に影響を及ぼさなかった。ペプチド配列のリストについては、表1を参照してください。
餌としてペプチドを用いMotifの結合パートナーを分離。図4Aは SMRwtペプチド（60、65、75、および250 kDaの）して、4つのタンパク質の共免疫沈降を示しています。ネガティブコントロールSMRmutペプチドは、これらのタンパク質を捕捉しませんでした、そしてこれらのタンパク質は、非特異的ペプチドの非存在下での親和性樹脂と相互作用しなかった、共同免疫沈降タンパク質が相互作用していたことを示唆している特にSMRwtペプチドのSMRをモチーフにした。これらのタンパク質は、続いて、MALDI-TOFタンデム質量分析（代表的なサンプルのために、図4Bを参照）によって識別され、免疫ブロット分析により確認した18。
機能解析で抗体阻害の使用。抗モータリン抗体全廃exNef分泌（ 図5）阻害。これはそのままネフ/モータリン相互作用がexNef分泌に必要であることを確認した。さらに、強くSMRwtペプチドがexNefの分泌を阻害するメカニズムがモータリン18の直接競争することによって、この相互作用の崩壊によるものであること。示唆
表1。ネフ誘起exNef分泌への影響のために開発され、テストSMRペプチドのパネル。このタブルはもともとシェルトンら 、JVI、2012年18年に出版された。以前の研究では、SMRモチーフの単一のアミノ酸のアラニン置換大幅に削減、または廃止、ネフ誘発性分泌18。 1長期nonprogressorから分離されたウイルスは、V66の代わりにイソロイシンとネフの変形表現;高度に保存されたSMRモチーフ20のいくつかの報告されたバリエーションの1つの大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。
図1。主要な免疫細胞タイプのNefのエキソソームの効果。このモデルは、感染した細胞から放出さexNefが表示され、それがAIDSにつながる単球細胞及びリンパ球細胞への影響を予測している病因。 AICD、活性化誘導細胞死。I.感染細胞リリースウイルス、通常のエキソソーム、およびexNef。 exNefは活性化されていない、感染していない単球（B）をアクティブにします。 （C）遺伝子発現の変化で結果はCD4 +およびCD8 + T細胞の活性化と疲労で炎症状態と結果の増加につながる単球の活性化II。感染細胞リリースウイルス、通常のエキソソーム、およびexNef。 exNefは活性化されていない、感染していないリンパ球（D）をアクティブにします。活性化リンパ球は、（E）AICDにおける結果はアポトーシス細胞（F）になることを遺伝子発現変化を受ける。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 Peptid電子アポトーシスモチーフ（秒）のHIV-1 Nefのタンパク質の分析を走査する。KNFSのNefタンパク質の205アミノ酸をまたがる20merのペプチドを、10個のアミノ酸が重複すると、それぞれのセットがAIDS試薬プログラムから得られ、使用されたネフアポトーシスドメインをマッピングした。この図はもともとHuang らに発表された。、JVI 2004年13。 Y軸は、TUNELは、標識された細胞の割合を示し、X軸は処理条件を示している。フルネフタンパク質[ネフ]、未処理細胞[UT]、またはAA1-20 [N20]から始まり、aa190-205で終わるペプチド[N205]。エラーバーは、測定の標準誤差を表し、その結果は、少なくとも3つの独立した実験のコンパイルである。アポトーシスのピークがモチーフ1とMotif 2で示されている。
図3。 SMRwtペプチドはexNef阻害する。含有ペプチドをこの領域の任意アニモ酸のアラニン置換が大きくペプチドの有効性を減少させながら、一つ以上の野生型のNef SMR配列モチーフは、exNefの分泌を阻害した。この図はもともとシェルトンら 、JVI、2012年15年に出版された。ジャーカットT細胞からの培養培地は、Nefの-GFPクローンや各種SMRペプチドと共トランスフェクトし、exNef分泌についてアッセイした。測定されたGFP蛍光量は、細胞外のメディアでexNef-GFPの量に相当します。統計的有意性をt-検定対を用いて測定した。種々のペプチドのexNef分泌に対する効果はと比較したランダムペプチド制御スクランブル（SM1、* p値<0.05、** p値<0.01、*** p値<0.001）。
図4。 SMRwtペプチドは、MORを含む、宿主細胞タンパク質と特異的に相互作用するタリン。（A）ジャーカットT細胞からのタンパク質を抗FLAG M2抗体結合親和性樹脂を用いSMRwt SMRmutまたはペプチドのいずれかと共免疫沈降させた。ここで使用SMRwtとSMRmut両方がペプチドに埋め込まFLAGタグ配列を持っていることに注意してください。この図はもともとシェルトンら 、JVI、201215に掲載されました。この手順は、アフィニティー樹脂との非特異的相互作用のためのコントロールとしてのいずれかのペプチドの非存在下で繰り返した。描かクマシーブルー染色ゲルは、60の分子量を有するタンパク質、65、75、およびSMRmutペプチドによって、あるいはまったくペプチドでプルダウンされていなかったSMRwtでプルダウン250キロダルトン（矢印）が表示されます（B）75-kDaのバンドゲルから切り出し、トリプシン消化し、MALDI-TOFタンデム質量分析により分析した。 MS / MSイオンサーチモータリンと75-kDaのを同定した。矢印は、一致するペプチドの配列を示している。large.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するにはここをクリック
図5。モータリン抗体阻害ブロックエキソソーム分泌。Jurkat細胞から細胞外培地を、モータリン又はα-チューブリンのいずれかに対するNefの-GFPクローンと抗体で共トランスフェクトし、exNef分泌についてアッセイした。 exNef分泌（α-チューブリン）、その抗体によるモータリンの活動の中断がexNef分泌の完全な廃止をもたらしに関与していないタンパク質に対する抗体の効果と比較すると。統計的有意性は、α-チューブリン抗体（*** p値<0.001）に対してモータリン抗体の存在下でexNef分泌を比較する不対t検定によって決定した。この図はもともとシェルトンら 、JVI、2012年18年に出版された。
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Discussion
エキソソーム売買経路がexNef分泌のエンジニアリング小説の阻害に有用であろう操作するネフの能力のメカニズムを理解する。 exNef分泌の阻害は、CD4 T細胞の枯渇とCIAそのドライブHIV / AIDSの病因を減少させる必要があります。この目標に向かって、私たちは、私たちがexNef分泌の遺伝学を分析し、関与する細胞タンパク質を決定するために開始するために許可された斬新な試薬および方法論の数を開発しました。このアプローチはまた、直接exNefの分泌、SMRwtペプチドを対象とする第一の阻害剤の開発につながった。
我々の仕事の重要な発見は、我々の場合は全長タンパク質で見つかったモチーフに由来する特定の短いペプチド、HIV-1 Nefの、その生物学的機能を保持していないだけでなく、競争力のある、全長タンパク質の機能を阻害することができる。これらのペプチドは、その生物学的機能を維持するので、それらは、機能ドメインを識別するために使用することができる全長タンパク質である。二つのことが必要とされています：目的のタンパク質は、その全体の長さのどちらかまたはタンパク質の領域を走査するペプチドの生成は、機能ドメインが含まれていると考え、そして、問題の生物学的機能をテストするためのアッセイ。我々は、私たちはネフの特定の領域へのアポトーシス誘導モチーフのため、Googleの検索を絞り込むことを可能にする情報を欠いていたので、その長さ全体をスキャンするペプチドのセットを使用していました。このプロセスは、ネフの比較的小さいサイズでシンプルに作られたが、我々はまた、大規模な（> 75 kDaの）タンパク質にこの手法を適用している。アポトーシスを測定するための十分に確立されたアッセイ（TUNEL）は、CD4 T細胞の関心、この場合には、Nefの誘導性アポトーシスの生物学的機能を保持するペプチドを同定するために使用された。興味深いことに、オリジナルの論文のその後の分析は、特定されたアポトーシスペプチドは、完全長のNef蛋白質の生物学的活性の> 80％を保持していることを示し、競争的に結合CXCR4を阻害その天然のリガンドのSDF-1α。
同様に、ネフのSMRのモチーフを含む短いペプチドはexNefの分泌に関与する細胞のタンパク質と相互作用するために、その生物学的機能を保持した。しかし、活動のこのインスタンスの保持のようアポトーシス誘導の場合と同様であったが、禁止ではなくつながった、ネフ機能の擬態にはつながらなかった。 SMRwtペプチドが効果的にこれらの細胞タンパク質のSMR結合部位を結合したので、Nefのとの相互作用を破壊し、その結果、エキソソームでのNefの分泌を防止する。関心のネフモチーフが前遺伝子マッピングの研究から知られていたとして、我々はSMRの変化にペプチドの開発を制限することができました。代わりに小説機能モチーフを識別するのではexNef分泌のSMRの役割は、その特定の一次配列に直接リンクされたことを実証するために、exNef分泌を測定するため、これらのペプチド、および以前に開発された蛍光ベースのアッセイを使用していました。
HIV-1、人間のタンパク質相互作用データベースがネフと直接対話し、おそらく直接または間接的に19の対話など、多くの200としてその60以上の細胞タンパク質を示しています。興味のあるモチーフに、当社baitタンパク質のシーケンスを制限することにより、我々は、完全長のNefタンパク質が共同免疫沈降されたであろうタンパク質の数十をソートすることを避ける。これらのタンパク質の大部分は、ネフのための具体的な一方、ネフのSMRのための結合パートナーではないので、バックグラウンド/ノイズを構成するであろう。保守的な計算では、我々は15倍（61/4）にすることにより、ノイズを減少させることである。本質的には、我々のアプローチは効果的にオフサイトに起因するバックグラウンドを最小限に抑えることにより、信号対雑音比を増加させたり、我々の場合のオフモチーフ結合、私たちがするようにIDEが可能特にSMRを結合するタンパク質をntify。しかし、この方法を使用することによって、我々は、特にすべてのSMR-結合細胞タンパク質、SMR及びNEFをバインドする第二モチーフ両方との相互作用を必要とするもの、またはその結合二次に依存しているものをキャプチャするために失敗した、ということが可能ですか三次構造。
モータリン、SMRwtペプチドによる細胞タンパク質の共免疫沈降は、miRNAのノックダウンおよび抗体阻害によりexNef分泌に必要であることが示された。前者は、標的タンパク質の発現を低減又は排除する十分に確立された技術である。逆に、抗体阻害は、タンパク質の発現レベルに影響を及ぼさないが、その代わりに物理的に他の蛋白質と標的タンパク質の相互作用を阻害する。我々はexNef分泌のためのネフ-モータリンの相互作用の重要性を実証するために、この第二の方法を使用していました。抗体阻害は、抗体を導入する方法を必要と直接的な手順である細胞および問題の生物学的機能に及ぼす影響を試験するためのアッセイに変換する。我々は、細胞、およびexNef分泌の変化を測定するため、前述の蛍光ベースのアッセイにシャトル抗モータリン抗体にチャリオットタンパク質デリバリー試薬を使用していました。ほとんどの抗体ベースの手順と同様に、抗体阻害の効果は、標的タンパク質に対する抗体の親和性および特異性によって制限される。
HIV研究の主要な目標は、新規治療薬の開発や治療のための潜在的なターゲットの同定である。手順は、ここで、その生物学的機能を維持し、競合全長タンパク質の機能を阻害することができ、このプロセスを加速するために活用する特定の短いペプチドを記載。記載される実験は、キーHIV機能を理解することに向けられていたが、使用される技術は、タンパク質 - タンパク質相互作用の研究及びペプチド系の開発に適用可能であるいくつかの分野における阻害剤。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、NIH / NIGMS / MBRを（グラント58268）、NIH / NCRR / RCMI（グラントG12-RR03034）、ジョージアリサーチアライアンス資金助成GRA.VAC08.W、NIH / NIAID / NRSA助成F31AI091484、エモリーCFAR助成P30によってサポートされていましたA1050409。この調査はNIH / NCRRから研究設備整備グラント＃C06 RR18386からのサポートで構成施設で実施された。 Jurkat細胞を、20組のHIV-1 Nefのペプチド、ならびにウサギ抗HIV-1 Nefの抗血清は、NIH AIDSリサーチ＆文献試薬プログラム（ロックビル、MD）から入手した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
References
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