Summary
Vi beskriver en roman
Abstract
Vi har med succes integreret tidligere fastlagte Intrakranielt vindue (ICW) teknologi 1-4 med intravital 2-foton konfokal mikroskopi til at udvikle en ny platform, der giver mulighed for direkte langsigtede visualisering af væv strukturændringer intrakranialt. Imaging på en enkelt celle opløsning i et real-time mode giver supplerende dynamiske oplysninger, der gives ved standard end-point histologisk analyse, der ser udelukkende på 'snap-shot' tværsnit af væv.
Etableringen af denne intravital imaging teknik i fluorescerende kimære mus, vi er i stand til at afbilde fire fluorescerende kanaler samtidigt. Ved at inkorporere fluorescensmærkede celler, såsom GFP + knoglemarv, er det muligt at spore skæbne af disse celler studerer deres langsigtede migration, integration og differentiering inden væv. Yderligere integration af en sekundær reporter celle, såsom en mCherry gliom tumorlinie, muliggør karakteterization af celle-celle-interaktioner. Strukturelle ændringer i vævet mikromiljø kan fremhæves ved tilsætning af intra-vitale farvestoffer og antistoffer, for eksempel CD31 mærkede antistoffer og dextranmolekyler.
Desuden beskriver vi kombinationen af vores ICW tegnemodel med en lille dyr mikro-strålerøret der giver stereotaktisk bestråling, skaber en platform, hvorigennem de dynamiske væv forandringer, der sker efter administration af ioniserende bestråling kan vurderes.
Nuværende begrænsninger i vores model omfatter penetrans af mikroskopet, der er begrænset til en dybde på op til 900 um fra sub kortikale overflade, begrænser billedbehandling til den dorsale akse af hjernen. Tilstedeværelsen af kraniet gør ICW en mere udfordrende teknisk procedure, sammenlignet med de mere etablerede og udnyttede kammer modeller der anvendes til at studere brystvæv og fedtpuder 5-7. Desuden ICW provIdes mange udfordringer, når optimerer imaging.
Introduction
En bedre forståelse af de strukturelle og biologiske ændringer, som opstår i hjernen som reaktion på forskellige patologier og terapeutiske indgreb er afgørende for at forbedre behandling strategier. Men en af de nuværende udfordringer i at studere disse strukturelle og biologiske forandringer, især med hensyn til de intrakranielle patologier, er den manglende adgang til vævet og den manglende evne til at studere den tidsmæssige udvikling og dynamisk progression af ændringer i en in vivo omgivelser. Den generation af "vinduet" teknologi har tidligere vist sig at være en succes i at undersøge blødt væv ændringer gennem tumor udvikling 5-7. Udvikling af ICW modeller viser sig at være mere teknisk udfordrende, fordi det er nødvendigt at fjerne kraniet uden at beskadige den anstiftelse infektion i den underliggende hjernevævet. Tidligere papirer har forsøgt at fortynde kraniet for at visualisere væv 8-10 dog til at producere høj opløsning klar imaldre fuld fjernelse af kraniet kræves 11. Gentag langsigtet imaging (30 dage +) er først for nylig blevet en realistisk mulighed gennem imaging 1,11, har tidligere kortere tidsrammer blevet undersøgt 5.
Gennem det seneste årti et vigtigt mål har været at belyse oprindelsen af neo-vaskulatur følgende patologiske stimuli, navnlig som reaktion på tumordannelse og progression, at tilvejebringe hidtil ukendte terapeutiske mål til behandling af tumorer. Megen polemik forbliver omkring kilden til ny vaskulatur i hjernen under tumorudvikling eller efter stråling. Traditionelt vaskularisering blevet anset for at forekomme gennem angiogenese, en proces, hvor nye fartøjer dannes fra spiring af allerede eksisterende fartøjer 12. Nyere undersøgelser tyder imidlertid på, at den tidligere antaget embryonale proces vaskulogenese kan spille en mere betydelig rolle i dannelsen af patologiske kar. Vasculogenesis involverer rekruttering af de voksne angioblast kolleger fra knoglemarven som igen er så direkte involveret i dannelsen af nye fartøj endotel 12-14. Akkumulere tyder på, at endotel præcursorceller mobiliseres fra knoglemarven til at indlede de novo fartøj dannelse som reaktion på onkogene mediatorer 15-17. Men disse undersøgelser giver modstridende evidens for det direkte bidrag af disse knoglemarv afledt celler (BMDCs) til fartøjets endotel med procentvise bidrag varierer med den type af patologiske stimulus og respons på behandlingen 18-21.
Derfor, om reproducerbare eksperimentelle metoder, der tillader høj opløsning intravital billeddannelse til gentagen langsigtet undersøgelse af processen BMDC integration i tumorvaskulatur og som reaktion på terapi er uvurderlig. Standard histologiske teknikker undlader at give den dynamiske oplysningerninger der kræves for at bestemme den langsigtede overlevelse, differentiering og integration af de celler, der giver anledning til neovaskulatur og kan derfor ikke påvise endeligt mekanismer celle interaktion.
Vi har vist ved hjælp af vores eksperimentelle tilgang, der er en varierende grad af BMDC rekruttering efter både intrakraniel ioniserende stråling og tumorvækst, en rekruttering der er dog patologi stedsspecifik og ikke en invasion af hele intrakranielle væv 11,22. Vi har vist, at ansættelsen følger en tidsfølsomme mønster fremgår af gentagne billeder af et enkelt dyr 11,22. Ligeledes kan in vivo imaging også give uvurderlig indsigt i tumorceller mimicry hvorved fluorescens mærkede tumorceller kan afbildes og spores med en intra-vital CD31 antistof til endothelceller til at fremhæve muligheden for tumorceller transdifferentiation til direkte at danne sit eget endotel.
For at demonstrere tilpasningsevne vores model, samt celle-celle interaktioner nævnt ovenfor, har vi været i stand til at studere medicin-celle interaktioner. Vi har kigget på narkotika-hæmmere som AMD3100 en SDF-1 hæmmer, og dens rolle i signalering netværk, der er involveret i BMDC rekruttering 11.. Ligeledes har vi gensplejsede ud U87 gliom xenotransplantater celler til at udtrykke VEGFTrap, en VEGF-inhibitor 25, sammenholdt gennem et IRES til en GFP molekyle. Ved at bruge RFP + BM vi er i stand til at undersøge, hvilken rolle VEGF har på rekruttering af BMDCs til kar. Senest har vi udnyttet den model for at studere medicin kinetik kigge på mechanism bag tumor-afgrænse lægemiddel Fluorescein 26, på et cellulært niveau. Gennem brug af en specialbygget i huset små dyr strålerøret har vi været i stand til at integrere stereotaktisk leveret stråling at vurdere respons både tumor og BMDCs til behandling.
Gennem brug af vores nye intravital billeddiagnostiske metode forskere vil få indsigt i de encellede realtid forandringer, der sker i forskellige patologier og systemer, medvirken belysning af mange funktionelle og biologiske funktioner i væv ændringer.
Protocol
Alle animalske arbejde er blevet udført i henhold til en dyrepleje OG ANVENDELSE UDVALG godkendte protokol og henrettet i overensstemmelse med alle relevante retningslinier, regler og reguleringsorganer.
For fejlfinding henvisning Tabel 2.
1.. Bone Marrow Rekonstituering (valgfri) Figur 1 (30 min prep, 5 min per mus)
Alle kirurgi bør udføres ved hjælp af streng aseptisk teknik med autoklaveret sterilt udstyr.
Én donor mus rekonstruere tre vært mus.
- Bedøve modtager NODscid mus og position, med bly at skærme hovedet, inde i midten af Gammacell 40 'exactor' stråleovnen.
- Bestråle NODscid mus med 2,5 Gy helkropsbestråling (TBI).
Kritiske trin: Optimering af TBI kan være nødvendig på grund af variation i dosis til tilstrækkelig værtsimmunrespons cell udtømning i forskellige musestammer.
Pause point: Host mus kan bestråles i forvejen, men bør anvendes inden for 24 timer for bestråling.
- Afliv donormus henhold til de institutionelle dyrepleje udvalgets retningslinjer. Rengør baglemmer og fjern skinneben og lårben fra begge, stripning al overskydende væv fra knoglerne (figur 1ai, 1aii).
KRITISK STEP: fibularis knogler er ikke rentabelt for brug på grund af meget snævre lumen.
- Fjern endeplader fra begge ender af fire udtrukne knogler og skylle dem ud ved hjælp af en 22 G kanyle og 1 ml sterilt PBS, indtil de er hvide i udseende (figur 1aiii). Henvisning Tabel 2..
- Bland den udpakkede knoglemarven (BM) suspension godt og trække 300 pi i tre 27 g tuberkulin nåle. Udvundet BM bør indeholde cirka 2 x 10 7 celler oger nok til 3 vært mus reconstitutions. Henvisning Tabel 2..
- Indsprøjtes suspensionen i den laterale halevene af tre tidligere bestrålede NODscid mus fra trin 1.1 (figur 1b). Henvisning Tabel 2..
ADVARSEL: For at kontrollere sterilitet BM injicerede anbefaler vi plating den resterende BM og kultur i 24 timer for at tjekke for infektion. Primære dødsårsag på dette punkt er infektion i de nyligt rekonstituerede mus.
2.. Intrakraniel Window Generation - Figur 2 (30 min pr mus)
Alle operationer skal udføres ved hjælp af streng aseptisk teknik med autoklaveret sterilt udstyr og under en varmelampe for at holde dyr varme (figur 2A).
- Bedøve modtager NODscid mus med IACUC godkendte bedøvelsesmiddel, Avertin IP injektion på 0,5 mg / g og position, med bly at beskytte hovedet inde i midten afGammacell 40 'exactor' strålerøret. Fjerne hår fra hovedbunden. Derudover gælder tåre gel for at forhindre hornhindens dehydrering.
- Clean hovedbund først med Betadine-opløsning og derefter med alkohol, og derefter foretage et snit fra midten af ørerne til lige over øjnene. Fjern hovedbund 3 mm på hver side af den første indsnit, udsætter kraniet og landemærker i kraniet overfladen (figur 2BI).
- Løft periosteum ved at indsprøjte 2% lidocain: adrenalin opløsning og dissekere væk fra kraniet overflade (Figur 2Bii).
- Brug 2,7 mm trephine boremaskine, svækker en 2,7 mm cirkel af kraniet over cortex af højre hjernehalvdel mellem lambda og bregma. IKKE trænge ind i knoglen med boret (Figur 2Biii). Henvisning Tabel 2..
KRITISK STEP: Hvis boret går gennem kraniet hjernen overfladen vil blive beskadiget indflydelse resultater med ekstra trauma. Derudover overdreven blødning vil forekomme forhindre en klar vindue bliver genereret.
- Tag den svækkede knogler flap hjælp dissektion pincet og dental krog og bevidst, men kontrolleret kraft (figur 2Biii).
- (Valgfrit) Hvis man ser på tumor patologi, injiceres valgt tumorcellelinier (med fluorescerende reportergen) i midten af vinduet genereres i trin 2.5.
- Load 10 pi 30 G Hamilton sprøjte med cellesuspensionen og belastning nål i en stereotaktisk ramme.
Kritiske trin: Cell nummer skal være optimeret til tumorceller i brug og tidslinje kræves vækst. For U87 kulturer vi bruge 2 x 10 5 celler i 10 pi per mus. - Load musen på digitale stereotaktisk ramme justere nålen til midtpunktet i det genererede vinduet.
- Lavere nål, indtil det netop rører kortikale overflade og nulstille digitale koordinater.
- Lowis nålen til 3,2 mm ind i cortexvæv og injicere 3 mm dyb.
- Træk kanylen langsomt derefter fjerne musen fra rammen.
KRITISK STEP: injicere opløsningen over varigheden af 1 min og lad nålen i position efter injektion for at sikre reduceret tilbage flow.
Afgørende skridt: Hvis mindre blødninger er stødt grundigt med sterilt saltvand for 1-5 min for at stoppe overfladisk blødning. Fortsæt med følgende trin.
- Load 10 pi 30 G Hamilton sprøjte med cellesuspensionen og belastning nål i en stereotaktisk ramme.
- Fugt hjerne overflade med en dråbe sterilt PBS til at holde hjernevæv vandede.
- Float en 3 mm dækglas på hjernen overflade at tætne fuldstændigt omkring 2,7 mm genererede vindue. Henvisning Tabel 2..
- Tør omgivende kranie derefter anvende vetbond for hele udsatte skalle reseal hovedbund væv til kraniet knogler og dækglasset på plads. IKKE anvende et overskud, da det vil trænge ind under glasset og mindske imaging potentiale.
- Mix frisk dental akryl pulver og opløsning, omtrent 30% (w / v), og anvende over toppen af vetbond. At sikre en tæt forsegling overlappe akryl lidt på dækglas kant (fig. 2Biv). Henvisning Tabel 2..
ADVARSEL: Dental akryl er ekstremt farligt, så vi anbefaler, brug af handsker og maske hele procedurer.
Kritiske trin: Dental acryl skal forblive bøjelig under støbning for at sikre en god tætning og reducere overskydende. Ophobning af akryl på vinduet vil sløre billeder.
- Tillad mus til at inddrive i en varm bur.
3.. Stereotaktisk Stråling (ekstraudstyr) - Figur 3 (25 min per mus)
Variationer vil eksistere i de forskellige irradiators brugt og som sådan optimering vil være påkrævet. Vi brugte en specialdesignet stråleovnen.
- Bedøve mushjælp Isofluran ved 4% til induktion efterfulgt af 1,5-2% hele proceduren med 0,5-1 liter O 2 a min, og et sted på brugerdefinerede hoved restrainer inde i stereotaktisk strålerøret (Figur 3Ai).
- Opnå en 360 ° kegle stråle CT-scanning med røntgenrøret kører på 40 kVp og 0,05 mA gennem en 2 mm aluminium filter. Brug billedet til at styre bevægelsen af scenen, lede strålingen isocentre til den højre hjernehalvdel sikre, at den er central i Dorsal Ventral retning.
- Indsæt halvkugle collimator, 8 mm x 11 mm blok.
KRITISK STEP: kollimatorer kan udformes til mange forskellige opsætninger, og så kan forbedres til at inkludere og ekskludere forskellige dele af hjernen. 8 mm x 11 mm definerer et halvkugleformet område af hjernen.
- Opnå single CT ortogonale billeder både fra toppen (AP) og bund (PA) gennem kollimatoren for yderligere at forbedre placeringen af hjernen, anatomical knoglestrukturer kan anvendes til reproducerbarhed.
- Exchange aluminium filter til en 0,93 mm kobber behandling filtrere og administrere halvdelen af den ønskede strålingsdosis med røntgenrøret kører på 225 kVp og 13 mA fra toppen i en AP retning.
- Returnere portalkran til den nederste position og administrere den anden halvdel af stråledosis igen med røntgenrøret kører på 225 kVp og 13 mA danner bunden i et PA retning.
Kritiske trin: Det er vigtigt at bestråle fra både top og bund for at reducere RT gradient gennem hjernevæv, men også hjælper med tilpasningen af isocentre til midten af hjernen.
4. In vivo Two Photon Laser Microscopy -. Figur 3 (1-3 timer per session)
Variationer vil findes i forskellige mikroskoper anvendte og som sådan optimering vil være påkrævet. Vi brugte et Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal Microscope.
- Bedøve mus med IACUC godkendt narkose, Avertin IP injektion ved 0,5 mg / g og ren vindue bruge alkohol spray.
- (Valgfrit) Injicer tagged vaskulær farvestof 5-10 minutter før billeddannelse, i halevenen før billeddannelse. Alexa647-dextran anvendes til 0,35 ug / g eller APC-CD31 anvendt ved 0,2 ug / g. Se tabel 2.
- (Valgfrit) Injicer Fluorescein via halevenen i en dosis på 7,7 mg / kg, 5 minutter før billeddannelse, at afgrænse tumor. Henvisning Tabel 2..
- Opsætning kanaler på konfokal mikroskop som bestemt ved fluorochrom anvendes i kimære genererede mus. Tabel 1 viser de kanaler der er beskrevet i denne model.
- Vend musen på bevægelige mikroskopbordet og stabilisere hovedet på plads med formbar modellervoks. (Figur 3Aii) Henvisning Tabel 2.
- Tænd første kanal laser og bruge til at positionere i midten af ICW.
- Brug 5x linse og tage et billede af hele vinduet for at bruge som et kort til yderligere billeder i højere opløsning.
- Billeddiagnostik bør udføres med 10X og 20X 'langtrækkende' linser til at få den bedste billedkvalitet.
KRITISK STEP: Kanaler og mål på 2PLM bør sættes op ved hjælp manipulerede celler in vitro forud for billeddannelse af murine modeller for at sikre, at de markere det korrekte fluorokrom.
| Fluorokrom | CFP | GFP / Fluorescein / FITC | mCherry / RFP / DsRed | APC / Alexa647 | SHG Autofluorescens |
| Excitation laser | 458 nm | 488 nm | 543 nm | 633 nm | Chameleon laser 820 nm |
| Indsamling Filter | 480-520 nm | 500-550 nm | 565-615 nm | 650-710 nm | 390-465 nm |
Tabel 1. Fluorokrom setup. Guides til brugeren at se excitation laser og emissionsspektre opkøber anvendes til hver af de tilgængelige kanaler i modellen.
Representative Results
Den valgfrie trin rekonstituering BM af NODscid mus bør resultere i en 80% optagelse af fluorescerende "donor" BM i 100% af NODscid 'vært' mus, vil dog optimering af TBI være nødvendig for at øge rekonstituering i andre ikke -immunocompromsed stammer. Hvis mus uden held rekonstitueres de vil blive syge og dø hurtigt efter den procedure, kan svækkede mus kræve yderligere mad og vand kilder.
ICW engang færdig skal se ud som vist i figur 2Biv. Det er ideelt at have en højderyg af akryl omgiver dækglas da dette giver styrke til sammen med kraniet. Perfekt vinduer er reproducerbare og giver mulighed for gentagne billeddannelse i op til 8 uger efter deres generation (figur 2C). Billeder produceret gennem disse optimale vinduer vil se ud som dem, der ses i figur 3BI. Mangler i vinduet generation vil producere billeder af dårligkvalitet for eksempel, vil luftboblerne under vinduet forhindre hele synsfelter, der afbildes, vil områder synes mørk luften forhindrer laserbilleddannelsessystem (Figur 3Bii). Med overskydende lim og akryl på dækglasset vil der være et højt niveau af baggrund fluorescens og områder af marken bliver udslettet som det ses i figur 3Biii, ligeledes hvis der er snavs på vinduet små prikker af baggrundsfluorescens vil være synlig i feltet (figur 3Biv).
Succes ICW billeddannelse er forudbestemt af integriteten af den kirurgiske teknik kan imidlertid selv optimale VB opstår problemer under imaging session. Som sådan eksisterer en række og klarhed i billeder, der genereres som ses i figur 3. Publikationen kvalitet billede portrætteret i figur 3C opstår, når alt er optimal. Selvom det ikke er muligt for alle mus, er det muligt at forvente 80% af billedets genereret til at ligne dette. En af de største fejl i den aktuelle mikroskopi opsætningen er brugen af inverterede lasere. Mus skal placeres på ryggen og dette resulterer i overdreven stress og ubehag, der kan føre til besværet vejrtrækning under billedbehandling. Dette frembringer en "foret" billede som vejrtrækning forstyrrer gennemsnit, der opstår under billedbehandling, hvorved hver pixel række afbildes fire gange, og gennemsnittet af de fire vises i det endelige billede. Enhver bevægelse under gennemsnit, som der forårsages af besværet vejrtrækning, vil skabe en artefakt, der vises som en linje på billedet, som ses i figur 3D. Mus, der ikke er tilstrækkeligt bedøvet under billedbehandling kan støde på dette problem også. Den "foret" effekt kan reduceres ved at begrænse billedet gennemsnit til den, men det vil til gengæld reducere billedkvaliteten og må ikke fjerne problemet. Alternativt mus kan omplaceres eller genbehandlet, når vejrtrækningen er normaliseret. Brugen of En opretstående 2PLM ville ophæve dette problem, da mus kan blive afbildet "i liggende stilling. Et yderligere problem med billeddannelse på en inverteret 2PLM omfatter den begrænsede adgang til positionering ICW når musen er på mikroskopet, og dette fører til 'segmenterede' billeder som dem, der ses i figur 3E. Her laseren og dækglasset er ikke placeret vinkelret på hinanden og som sådan billeddannelse sker ved en vinkel. Dette resulterer i genereringen af en 'segmenteret' billedet, hvor siderne af synsfelt ikke afbildes. Problemet er let løses med repositionering af musen for at sikre dækglasset er helt vandret gang på hovedmonteringsindretningen som det ses i fig 3Aii.
Modellen præsenteres her blev specielt brugt til at undersøge, hvilken rolle BMDCs i vaskularisering af tumorvæv og viser evne til at bruge tre forskellige kanaler samtidigt (Cherry, GFP, Far-rød - Alexa647 og APC) Making den fælles fiskeripolitik og SHG overflødige for denne særlige historie. Vi var i stand til at afbilde mus længderetningen i op til 8 uger studere rekruttering og integration af BM celler i vaskulaturen på en enkelt celle niveau med nogen skadelige virkninger forårsaget af vinduet. Denne model viser den lethed indsamle dynamiske oplysninger om kilden og dannelse af kar og samspillet mellem forskellige celletyper af interesse, der tidligere tabt ved slutpunktet histologisk analyse.
| Trin | Problem | Ræsonnement | Opløsning |
| 1.4 | Bone splintres | Blunt værktøjer | Saml knoglemarv danner en frisk mus ved hjælp af skærpede saks eller frisk skalpel, vil knoglerester inhibere TV injektion |
| 1.5 | Lav udtræk (lav viscosity) | Bone endeplader skåret for distalt, dårlig indsamlingsmetode | Bones skal skæres så proksimalt som muligt og opsamles med knoglen inde indsamlingen røret for at forhindre splash tilbage Tid bør bruges til at udtrække BM maksimalt og med omhu Hvis det er nødvendigt pulje mere end én mus i 1 ml |
| Høj Extraction (høj viskositet) | Lav samling buffer | Fortyndet gennemtænkt løsning med ekstra 0,1% BSA, split til tre recipientmus op til 500 pi per mus maks. | |
| 1.6 | Bad Intravenøs injektion | Dårlig vasodilation og skib synlighed | Forbedre dilatation med varmelampe. Sted mus i halevenen restrainer med indbygget lyskilde til støtte adgangen |
| 1 | Mus Sick | Infektion | Sacrifice mus ifølge institutionens regler. Sørg haler bliver rengjort inden injektion og kontrollere sterilitetaf ekstraheret BM i kultur |
| Mus dør | Poor BM optagelse | Tjek% af fluorescerende BM optagelse af døde mus. Optimer TBI til stamme af mus, der anvendes Øge mængden af BM injektion (eksempel bruge en donor musen til to modtagere) | |
| 2.4 | Minor blødning | Dura overtrådt under boringen | Tryk med gelpuder og og kontinuerlig sterilt saltvand vask |
| Major hemorrhaging | Brain beskadiget af boring | Sacrifice musen ifølge institutionens retningslinjer | |
| 2.8 | Luftbobler under dækglas | Dårlig kontakt med kortikale overflade forhindrer korrekt placering | Fjern dækglas og tilføje ekstra PBS at flyde dækglasset på vinduet for at fjerne bobler |
| 2.10 | Glidning dækglasset under limning | Acrylic masse er tung, lagt pres på dækglasset og bevæger dækglasset af vejen | Pincet bør bruges til at holde dækglasset ned, mens vetbond og akryl påføres |
| 4.2 | Bad Intravenøs injektion | Dårlig vasodilation og skib synlighed | Forbedre dilatation med varmelampe. Sted mus i halevenen restrainer med indbygget lyskilde til støtte adgangen |
| 4.4 Figur 3C | 'Foret' billeder | Besværet eller uregelmæssig vejrtrækning | Fjern musen fra rammen og lad at inddrive Øge niveauet af anæstesimidlet og justere stand til at sikre nakken ikke er overdrevent bøjet eller udvides for at undgå at trække vejret |
| Figur 3C | Segmented 'image | Brain er ikke parallel med mål | Justér dækglas for at sikre, det er fladt |
| Fartøjet ikke visualiseret | injektion ikke set intravaskulært | Redo injektion i alternative hale vene, varm hale for at sikre god vasodilation | |
| Høj baggrund | Dirty dækglas, Luftbobler Akryl | Tør dækglasset med fugt 70% ethanol klud, ikke lægges i blød, som kan trænge under akryl og beskadige hjernevævet |
Tabel 2. Fejlfinding. En retningslinje for korrigerende foranstaltninger, der er nødvendige for problematiske områder af procedurerne.
Skemaer 1.. Eksperimentel flowdiagram. Dette viser tidslinjen for begivenheder gennem eksperimentelle trin 1-4. Musemodeller er opsætningen over en uge, atsikre BM genopretter ordentligt, og ikke behandles med medicin indtil dag 7 af svulsten til at sikre tumor podninger. Klik her for at se større figur .
Figur 1. BM Rekonstituering. (A) BM ekstraktionsprocedure jeg. Dissektion af bagbenet knogler. Ii. Dissekeret lårben og skinneben fra bagbenene, rengjort og klar til ekstraktion. Iii. Bones med endeplade fjernet og skyllet igennem, viser den hvide udseende af de tomme knogler. (B) skemaer viser hvor laterale vener til injektion er anbragt i halen.
Figur 2. ICW generation. (A) Aseptisk anbefalede setup (B) i. Udsat kraniet overflade afslører vartegn kræves for operation, bør ICW være placeret på den højre hjernehalvdel lige langt fra bregma og lamda. Ii. Periostieum løftes med lidocain løsning klar til udsendelse . iii. Dental krog nødvendig til fjernelse af knoglen fragmentet genereret med boret. iv. Færdig ICW med dental akryl. (C) Tre eksempel vinduer demonstrere metodens reproducerbarhed.
Figur 3.. 2PLM forventede resultater. Alle billeder vise grønt BM, rød tumor, Blå (pseudo farvet langt rødt) kar. (A) i. Demonstrerer hovedet rammen, som bevarer isofluran flow inde i små dyr strålerøret. De 8 x 11 mm kollimator kan også ses bevæge sig rundt gennem gantry. Ii. Mouse i omvendt placeret i hovedet rammen kræves for billedbehandling sikrer formbar plastercine alle vinduer kan imødekommes. (B) Demonstrative billeder af resultaterne af problemerne med vinduet generation fra i. en optimal vindue, ii. et vindue med luftbobler fanget nedenunder, iii akryl spild over dækglasset og iv. snavs på selve vinduet. (C) fremhæver de problemer, der opstår med billedbehandling efter en vellykket generering af et ICW jeg. optimal imaging ii . vejrtrækning artefakterskabe en "foret 'image iii. dækglas ikke vinkelret på laseren generere en' segmenteret 'image. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Funktionelle anvendelser og tilpasninger af modellen. (A) CFP indlæg imaging behandling hvorved GFP billedet trækkes fra CFP billede for at afsløre den sande FFP billede, der kan overlejres de tre andre kanaler i hvidt. Green BM, Red tumor, White CSCs, blå (pseudo farvet langt rød) kar (B) demonstration af kollagen fibre, der kan afbildes med SHG. Green Dextran, rød BM, Cyan Kollagen (C) i. VEGFTrap celler i vitro demonstrere GFP signal produceret med VEGFtrap. ii. In vivo imaging demonstrerer VEGFtrap cellerne klart og derudover fremhæver let at skifte kanaler for at demonstrere systemet, du kigger på. Green VEGFTRap + Tumor, Red BM, Blå (pseudo farvede langt rød) vaskulatur. (D) demonstrerer indsamling af fluorescein i stroma af tumoren og ikke i celler direkte, vist ved manglen på grønne signal overlay med rødt tumor. Green Fluorescein, Red tumor. Klik her for at se større figur .
Discussion
De tre kanaler er beskrevet i alle de billeder hidtil er udskiftelige for tre markører af interesse i andre modeller og blade forskere med en uvurderlig sæt værktøjer til at se en lang række celletyper og interaktioner. Planlægning er nødvendig for at sikre, at alle markører og celletyper har med succes integreret en reporter fluorescens molekyle i en særskilt kanal.
Ud over de standard tre kanaler, der anvendes her kunne vi også integrere en fjerde FFP-kanal (figur 4A) og en SHG-baseret collagen kanal 7 (figur 4B). Dette udvider muligheden for at kigge på cellulære interaktioner i vivo og derudover giver brugeren til at foretage befolkning blanding til undersøgelse af specifikke celle-celle interaktioner og samtidig bevare to kanaler for andre markører. For eksempel har vi kigget på tumorceller (RFP) og kræft stamceller (CFP) i et forhold på 1:3 med en interesse i at sammenligne deres intratummundtlige interaktioner (figur 4A). Vi observerede, at 7 dage efter implantation af blandet population forholdet blev stadfæstet, og begge cellepopulationer kan stadig ses.
FFP kanal giver tekniske problemer på grund af overlapningen med GFP kanal i både excitations-og emissionsspektre og som sådan kræver efter billeddannelse behandling for at definere den sande FFP +-celler fra dem, der er faktisk GFP +. Indlæg imaging behandling kan udføres på 2-foton mikroskoper bygget i Zeiss LSM software direkte hvorved, bliver GFP billedet trækkes fra den fælles fiskeripolitik billedet resulterer i de sande FFP cellerne bliver efterladt (figur 4A). Forudsætningen for forholdet subtraktion er afhængig af lige lyse billeder og skyldes den fælles fiskeripolitik laser (458 nm) fluorescerende både fælles fiskeripolitik og GFP celler mens GFP laser (488 nm) er for høj til at fluorescere den fælles fiskeripolitiks celler. Ud over at den fælles fiskeripolitik har vi også været i stand til at bruge tidligere offentliggjorte opsætninger til at se på SHGniveauer og så skildrer collagenfibre, som udgør basalmembranen omkring vaskulatur (figur 4B).
En anden tilpasning af denne model har benyttet sig af en specialbygget lille dyr strålerøret, som har evnen til at anvende stereotaktisk vejledt strålebehandling at bestråle sektioner af væv så lille som 2 mm i diameter. Ved at målrette vinduet med bestråling er det muligt at se på effekten stråling har på det underliggende væv. Vi har for nylig offentliggjort en undersøgelse ser på effekten stråling har på normal hjernevæv med hensyn til rekruttering af BMDCs til vaskulaturen, specielt på deres rolle i post stråling vævsforandringer. Vi fandt, at ansættelsen af de BMDCs var både tid og dosisafhængig i normalt væv 11.
Det er muligt at undersøge mekanismerne for levering og integration af terapeutiske leverer lægemidlet er mærket med en fluorescerende markør. Undervores forskning, vi har været i stand til at spore produktionen af VEGFTrap en antiangiogent lægemiddel, som blokerer al VEGF signalering i det lokale område af produktionen 25.. Ved genetisk ændring vore tumorceller at udtrykke VEGFtrap genet kombineret med et IRES til EGFP (Figur 4CI) og bruge RFP "donor" BM var vi i stand til billede EGFP: VEGFtrap produktion, BMDC interaktion og karrene samtidigt (figur 4Cii). Dette viste alsidigheden i model og tilgængelige kanaler. Det er også muligt at se på kinetikken af lægemidlet på grund af løftet om enkelt-celle opløsning. Fluorescein (GFP +) bruges til at afgrænse tumorer under operationen for at sikre maksimal resektion opnås 26. Ved at indsprøjte intravenøst, mens imaging er det muligt at påvise, at afgrænsningen ikke sker gennem den aktive optagelse af Fluorescein ind tumorcellerne selv, men i stedet gennem indsamling af lægemidlet i det stromale område med time, ses ved manglen på co-lokalisering 10 min efter injektion af fluorescein (figur 4D).
Samlet vores strategi kombinerer nye og eksisterende teknikker til at opnå en unik eksperimentel platform, hvilket er fordelagtigt i studiet af dynamiske cellulære interaktioner. Denne strategi har vist sig at være en uvurderlig metode til at undersøge høj opløsning encellede dynamiske udvikling af BMDC, tumor og normal hjerne vascularity reaktion på behandlingen, intrakranialt. Intravital imaging kan give en bedre forståelse for de molekylære regulatorer af BMDC rekruttering, migration og differentiering i intrakraniel hjernesvulst kar samt mange andre dynamiske processer tilpasses til andre forskningsområder. Hæmmende formodede faktorer, der regulerer BMDC i kombination med andre terapeutiske strategier kan hjælpe identifikationen af den præcise timing af kombinatoriske behandlingsformer. Desuden kan denne strategi tilpasses mange fremtidige PRojects udnytte ikke blot in vivo intravital farvning farvestoffer, men også små molekylære inhibitorer og nanopartikler, der er fluorescens mærkede giver forskerne at spore distribution og trækmønstre mere målrettede lægemidler samt se på langs på deres kinetik.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Advanced Optical Microscopy Facility på prinsesse Margaret hospital, især James Jonkman for deres bistand i den indledende opsætning af kanaler på 2Photon mikroskop. Forfatterne vil gerne anerkende Spatio-Temporal Targeting og Forstærkning af Radiation Response (STTARR) program og dets tilknyttede finansieringsorganer. Vi takker Dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael og Dr.Andras Nagy for at levere de VEGFTrap plasmider og for deres manuskript rettelser og feedback. Den fortsatte støtte og diskussion fra personalet på BTRC har været uvurderlig, og vi vil gerne fejre Dr.Abhijit Guha for hans videnskabelige input. Arbejdet blev finansieret af CIHR og NIH tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI | |
References
- Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
- Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
- Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).
- Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
- Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
- Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366 (2012).
- Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
- Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
- Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641 (2010).
- Zhang, H. -r Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
- Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
- Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
- Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
- Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
- Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).
- Burrell, K., Zadeh, G. Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , InTech. (2012).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
- Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
- Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).
