हम एक उपन्यास का वर्णन<em> Vivo में</em> इमेजिंग तकनीक है कि इंट्राक्रेनियल खिड़कियों और उच्च संकल्प 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़े फ्लोरोसेंट काइमेरिक चूहों. यह इमेजिंग मंच एड्स रोग अपमान के बाद एक एकल कोशिका के स्तर पर मस्तिष्क के ऊतकों और microvasculature में गतिशील परिवर्तन, की पढ़ाई और intracranial दवा वितरण और वितरण का आकलन करने के लिए अनुकूल है.
हम सफलतापूर्वक एकीकृत पहले intracranially ऊतक संरचना में परिवर्तन का सीधा लंबी अवधि के दृश्य के लिए अनुमति देता है कि एक उपन्यास प्लेटफार्म विकसित करने intravital साथ 2 फोटॉन confocal माइक्रोस्कोपी Intracranial खिड़की (ICW) प्रौद्योगिकी 1-4 की स्थापना की है. एक वास्तविक समय फैशन में एक एकल कोशिका प्रस्ताव पर इमेजिंग ऊतक की 'तस्वीर शॉट' पार वर्गों में पूरी तरह लग रहा है जो मानक अंत बिंदु ऊतकीय विश्लेषण द्वारा प्रदान परे है कि अनुपूरक गतिशील जानकारी प्रदान करता है.
फ्लोरोसेंट काइमेरिक चूहों में इस intravital इमेजिंग तकनीक की स्थापना, हम एक साथ छवि चार फ्लोरोसेंट चैनलों करने में सक्षम हैं. ऐसी GFP के रूप + अस्थि मज्जा शामिल fluorescently लेबल कोशिकाओं, के द्वारा, यह ऊतक के भीतर अपने लंबी अवधि के प्रवास, एकीकरण और भेदभाव का अध्ययन कर इन कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए संभव है. इस तरह के एक mCherry तंत्रिकाबंधार्बुद ट्यूमर पंक्ति के रूप में एक माध्यमिक संवाददाता सेल, के आगे एकीकरण के चरित्र के लिए अनुमति देता हैसेल बातचीत: सेल की terization. ऊतक microenvironment में संरचनात्मक परिवर्तन उदाहरण CD31 टैग एंटीबॉडी और Dextran अणुओं के लिए, अंतर महत्वपूर्ण रंगों और एंटीबॉडी के अलावा के माध्यम से प्रकाश डाला जा सकता है.
इसके अलावा, हम आयनीकरण विकिरण के प्रशासन के बाद होती है कि गतिशील ऊतक परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है, जिसके माध्यम से एक मंच बनाने, stereotactic विकिरण प्रदान करता है कि एक छोटे पशु सूक्ष्म irradiator साथ हमारे ICW इमेजिंग मॉडल के संयोजन का वर्णन है.
हमारे मॉडल की वर्तमान सीमाओं मस्तिष्क के पृष्ठीय अक्ष के लिए इमेजिंग सीमित, उप cortical सतह से 900 मीटर तक की गहराई तक सीमित है जो माइक्रोस्कोप, के अंतर्वेधन शामिल हैं. खोपड़ी की हड्डी की उपस्थिति वर्तमान में स्तन ऊतक और वसा पैड 5-7 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया और अधिक स्थापित और उपयोग चैम्बर मॉडल की तुलना में, ICW एक अधिक चुनौतीपूर्ण तकनीकी प्रक्रिया बनाता है. इसके अलावा, ICW provइडस कई चुनौतियों इमेजिंग जब अनुकूलन.
विभिन्न विकृतियों के जवाब में मस्तिष्क में उठता है कि संरचनात्मक और जैविक परिवर्तन, और उपचारात्मक उपायों की एक बेहतर समझ उपचार रणनीतियों में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, विशेष रूप से इंट्राक्रेनियल विकृतियों के बारे में, इन संरचनात्मक और जैविक परिवर्तनों का अध्ययन करने में वर्तमान चुनौतियों में से एक, ऊतक की पहुंच और अस्थायी विकास और इन विवो सेटिंग में एक में परिवर्तन की गतिशील प्रगति का अध्ययन करने की अक्षमता है. "खिड़की" प्रौद्योगिकी की पीढ़ी पहले 5-7 ट्यूमर के विकास के माध्यम से नरम ऊतक परिवर्तन की जांच करने में सफल साबित हुआ है. ICW मॉडल का विकास और अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों में संक्रमण भड़का को नुकसान पहुँचाए बिना खोपड़ी की हड्डी को दूर करने की आवश्यकता के कारण साबित होता है. पिछला कागजात उच्च संकल्प स्पष्ट IM के निर्माण करने के लिए, लेकिन ऊतक 8-10 कल्पना करने के लिए खोपड़ी पतली करने का प्रयास किया हैखोपड़ी की हड्डी की उम्र पूर्ण हटाने 11 की आवश्यकता है. लंबे समय तक इमेजिंग (30 दिन) हाल ही में इमेजिंग 1,11 के माध्यम से एक व्यवहार्य विकल्प बन गया है दोहराएँ, पहले से कम समय फ्रेम 5 अध्ययन किया गया है.
पिछले एक दशक में एक प्रमुख लक्ष्य ट्यूमर के इलाज के लिए उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्य प्रदान करने, ट्यूमर गठन और प्रगति के जवाब में विशेष रूप से, नव वाहिका निम्नलिखित रोग उत्तेजनाओं के मूल स्पष्ट करने के लिए किया गया है. काफी विवाद ट्यूमर के विकास या निम्न विकिरण के दौरान मस्तिष्क में नई वाहिका संरचना के स्रोत के आसपास बनी हुई है. परंपरागत रूप से vascularization angiogenesis, नए बर्तन पहले से मौजूद जहाजों 12 के अंकुरण से जो फार्म से एक प्रक्रिया के माध्यम से होती माना गया है. हाल के अध्ययनों तथापि, vasculogenesis के पहले ग्रहण भ्रूण प्रक्रिया रोग वाहिका संरचना के गठन में एक अधिक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा हो सकता है. Vasculogenesis बदले में फिर सीधे नए पोत अन्तःचूचुक 12-14 के गठन में शामिल हैं जो अस्थि मज्जा से वयस्क रक्तकोरक समकक्षों की भर्ती शामिल है. सबूत जमते endothelial कोशिकाओं अग्रदूत oncogenic मध्यस्थों 15-17 के जवाब में नए सिरे से वाहिनियों के गठन आरंभ करने के लिए अस्थि मज्जा से जुटाए जाते हैं जो इंगित करता है. हालांकि, इन अध्ययनों रोग प्रोत्साहन और उपचार 18-21 के जवाब के प्रकार के साथ बदलती प्रतिशत योगदान के साथ पोत अन्तःचूचुक को इन अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रत्यक्ष योगदान (BMDCs) के लिए विरोधाभासी सबूत प्रदान करते हैं.
इसलिए, ट्यूमर vasculature में और उपचार के लिए प्रतिक्रिया में BMDC एकीकरण की प्रक्रिया के दोहराया लंबे समय तक अध्ययन के लिए उच्च संकल्प intravital इमेजिंग की अनुमति है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक विधियों की स्थापना अमूल्य है. स्टैंडर्ड ऊतकीय तकनीक गतिशील सूचनाओं उपलब्ध कराने में विफलसूचना neovasculature को जन्म दे सकता है और इसलिए निश्चित सेल बातचीत के तंत्र को प्रदर्शित नहीं कर सकते हैं कि कोशिकाओं के लंबे समय तक जीवित रहने, भेदभाव और एकीकरण निर्धारित करने की आवश्यकता है.
हम इंट्राक्रेनियल विकिरण और ट्यूमर के विकास को दोनों का पालन BMDC भर्ती का एक अलग डिग्री है, लेकिन है कि एक भर्ती, विकृति विशिष्ट साइट और नहीं पूरे इंट्राक्रेनियल ऊतक 11,22 के एक आक्रमण है कि वहाँ हमारे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर दिखाया है. हम भर्ती एक भी पशु 11,22 के दोहराया इमेजिंग द्वारा प्रदर्शन एक संवेदनशील समय स्वरूप इस प्रकार है कि पता चला है. Fluorescently टैग ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे अपनी ही अन्तःचूचुक लिए फार्म का ट्यूमर सेल transdifferentiation की संभावना को उजागर करने के लिए endothelial कोशिकाओं के लिए एक अंतर महत्वपूर्ण CD31 एंटीबॉडी के साथ imaged और लगाया जा सकता है जिससे इसी तरह, vivo इमेजिंग में भी ट्यूमर सेल अनुकरण में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
<pवर्ग = "jove_content"> मॉडल की चंचलता सेलुलर और जैविक प्रक्रिया में परिवर्तन के अध्ययन के लिए संयोजनों की एक विस्तृत संख्या में उपलब्ध कराने, छवि 4 फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए क्षमता से बढ़ी है. हम एक साथ समय के साथ बार बार एक ही क्षेत्र में, intravitally छवि साउदी (नीला), GFP (हरा), चेरी / आरएफपी (लाल), और Alexa647/APC (दूर लाल) करने में सक्षम हैं. शोधकर्ताओं ने आनुवांशिक रूप से विशेष ब्याज की संरचनात्मक परिवर्तनों को उजागर करने के लिए चैनल के साथ ही खरीद रंगों और एंटीबॉडी के प्रत्येक के लिए fluorochromes व्यक्त करने के लिए कोशिकाओं को संशोधित कर सकते हैं. सामान्यतः अध्ययन में इस्तेमाल रंगों और एंटीबॉडी तिथि करने के लिए CD31 और dextran शामिल हैं जो दोनों को उजागर हम इस उद्देश्य के लिए दूर की लाल चैनल का उपयोग किया है, हालांकि दोनों अन्य में उपयोग के लिए उपलब्ध हैं microvasculature और ऊतक 1,11,23,24 में अपने परिवर्तन, चैनलों उल्लेख किया है. इसी तरह, Sytox apoptosis के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला जाएगा जो ऑरेंज,, और इस तरह कंपनी VisEn से उन के रूप में मार्कर सहित अन्य रंजक, विशेष कर दिया गया हैcifically की विवो में इस्तेमाल के लिए बनाया गया है. उल्लेख चार आमतौर पर इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए इसके अलावा, एक दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) चैनल जोड़ा जा सकता है और vasculature आसपास के तहखाने झिल्ली visualizing, छवि मॉडल 7 की अंतर्जात कोलेजन फाइबर के लिए अनुकूलित.हमारे मॉडल की अनुकूलन क्षमता है, साथ ही ऊपर उल्लेख सेल सेल बातचीत को प्रदर्शित करने के लिए, हम दवा सेल बातचीत का अध्ययन करने में सक्षम है. हम AMD3100, एक एसडीएफ -1 अवरोध करनेवाला, और BMDC भर्ती 11 में शामिल नेटवर्क संकेतन में अपनी भूमिका की तरह दवा अवरोधकों पर ध्यान दिया है. इसी तरह हम आनुवंशिक रूप से एक GFP अणु को एक IRES के माध्यम से संयोजन के रूप में VEGFTrap, एक VEGF अवरोध 25, व्यक्त करने के लिए U87 तंत्रिकाबंधार्बुद xenografts कोशिकाओं को बाहर इंजीनियर है. आरएफपी + बी.एम. का उपयोग करके हम VEGF के vasculature को BMDCs की भर्ती पर है भूमिका का अध्ययन करने में सक्षम हैं. सबसे हाल ही में हम mec को देख दवा कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए मॉडल का उपयोग किया हैएक सेलुलर स्तर पर ट्यूमर वर्णन दवा Fluorescein 26, पीछे hanism. के उपयोग के माध्यम से एक कस्टम का निर्माण हम उपचार के लिए ट्यूमर और BMDCs दोनों की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए स्टीरियोटैक्टिक वितरित विकिरण को एकीकृत करने में सक्षम है घर छोटे जानवर irradiator में.
हमारे उपन्यास intravital इमेजिंग विधि शोधकर्ताओं के उपयोग के माध्यम से ऊतक परिवर्तन के कई कार्यात्मक और जैविक विशेषताओं की व्याख्या सहायता, विभिन्न विकृतियों और प्रणालियों में पाए जाते हैं कि एकल कक्ष वास्तविक समय परिवर्तन में जानकारी हासिल करेंगे.
सभी छवियों में वर्णित तीन चैनलों को अब तक एक कई प्रकार की कोशिकाओं और बातचीत देखने के लिए उपकरणों की एक अमूल्य सेट के साथ अन्य मॉडल और पत्तियों शोधकर्ताओं में ब्याज की तीन मार्करों के लिए विनिमय करने योग्य हैं. योजना सभी मार्करों और सेल प्रकार सफलतापूर्वक एक अलग चैनल में एक संवाददाता प्रतिदीप्ति अणु एकीकृत है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है.
यहां इस्तेमाल मानक तीन चैनलों के अलावा हम भी एक चौथे पाकिस्तानी चैनल (चित्रा -4 ए) और एक एसएचजी आधारित कोलेजन चैनल 7 (चित्रा 4 बी) एकीकृत कर रहे थे. यह vivo में और इसके अलावा में सेलुलर बातचीत में देख की संभावना फैली अनुमति देता है उपयोगकर्ता अन्य मार्करों के लिए दो चैनलों को बनाए रखना है, जबकि विशिष्ट सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के मिश्रण आबादी का कार्य करने के लिए. उदाहरण के लिए, हम अपने intratum की तुलना में एक ब्याज के साथ 01:03 के अनुपात में ट्यूमर कोशिकाओं (आरएफपी) और कैंसर स्टेम कोशिकाओं (पाकिस्तानी) पर ध्यान दिया हैमौखिक बातचीत (चित्रा -4 ए). हम मिश्रित आबादी के 7 दिनों के बाद आरोपण के अनुपात को सही ठहराया गया था और दोनों सेल आबादी अभी भी देखा जा सकता है कि मनाया.
पाकिस्तानी चैनल + कोशिकाओं वास्तव + GFP हैं कि उन लोगों से सच पाकिस्तानी परिभाषित करने के लिए पोस्ट इमेजिंग प्रसंस्करण की आवश्यकता उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा दोनों में और जैसे GFP चैनल के साथ ओवरलैप के कारण तकनीकी मुद्दों प्रदान करता है. पोस्ट इमेजिंग प्रसंस्करण Zeiss LSM सॉफ्टवेयर सीधे जिससे में निर्मित 2 फोटॉन माइक्रोस्कोप पर बाहर किया जा सकता है, GFP छवि (चित्रा -4 ए) को पीछे छोड़ दिया जा रहा है सच पाकिस्तानी कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप पाकिस्तानी छवि से घटाया जाता है. अनुपात घटाव के लिए आधार भी उतना ही चमकदार छवियों पर निर्भर है और GFP लेजर (488 एनएम) whilst के पाकिस्तानी और GFP कोशिकाओं दोनों fluorescing पाकिस्तानी लेजर (458 एनएम) के कारण है पाकिस्तानी कोशिकाओं प्रतिदीप्ति के लिए बहुत अधिक है. CFP के अलावा हम भी स्वयं सहायता समूह को देखने के लिए पहले प्रकाशित setups का उपयोग करने में सक्षम हैस्तर और इसलिए वाहिका आसपास के तहखाने झिल्ली, (चित्रा 4 बी) को बनाने के जो कोलेजन फाइबर को दर्शाती है.
इस मॉडल की एक और अनुकूलन व्यास में 2 मिमी के रूप में छोटे रूप में ऊतक के वर्गों चमकाना स्टीरियोटैक्टिक निर्देशित विकिरण का उपयोग करने की क्षमता है जो एक कस्टम बनाया छोटे जानवर irradiator का लाभ ले लिया है. विकिरण के साथ खिड़की को लक्षित करके यह है अंतर्निहित ऊतक पर प्रभाव विकिरण को देखने के लिए संभव है. हमने हाल ही में प्रभाव विकिरण को देख एक अध्ययन प्रकाशित किया है vasculature को BMDCs की भर्ती के संबंध में सामान्य मस्तिष्क के ऊतकों पर है, के बाद विकिरण ऊतक परिवर्तन में उनकी भूमिका पर विशेष रूप से देख रहे हैं. हम BMDCs की भर्ती समय और सामान्य ऊतकों 11 में निर्भर खुराक दोनों था.
यह दवा उपलब्ध कराने के चिकित्सा विज्ञान के वितरण और एकीकरण के तंत्र का अध्ययन करने के लिए संभव है एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग है. दौरानहमारे शोध हम VEGFTrap के उत्पादन, उत्पादन 25 की स्थानीय क्षेत्र में सभी VEGF के संकेत को रोकता है जो एक विरोधी angiogenic दवा को ट्रैक करने में सक्षम है. VEGFtrap उत्पादन, BMDC बातचीत और एक साथ वाहिका (चित्रा 4Cii): आनुवंशिक EGFP के लिए एक IRES के साथ मिलकर VEGFtrap जीन (चित्रा 4Ci) व्यक्त करने के लिए हमारे ट्यूमर कोशिकाओं को संशोधित करने और आरएफपी 'दाता' बी.एम. का उपयोग करके हम छवि EGFP करने में सक्षम थे. इस मॉडल और उपलब्ध चैनलों की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया. यह एकल कक्ष संकल्प के वादे के कारण दवा के कैनेटीक्स को देखने के लिए भी संभव है. Fluorescein (+ GFP) अधिक से अधिक लकीर 26 हासिल की है सुनिश्चित करने के लिए सर्जरी के दौरान ट्यूमर चित्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. नसों whilst के इमेजिंग इंजेक्शन लगाने के द्वारा यह चित्रण ट्यूमर कोशिकाओं को खुद में Fluorescein की सक्रिय तेज के माध्यम से नहीं होता है कि प्रदर्शित करने के लिए संभव है, लेकिन इसके बजाय दवा का संग्रह के माध्यम से टी के साथ स्ट्रोमल क्षेत्र मेंFluorescein (चित्रा 4D) के इंजेक्शन के बाद सह स्थानीयकरण 10 मिनट की कमी से देखा IME,.
कुल मिलाकर हमारी रणनीति गतिशील सेलुलर बातचीत के अध्ययन में फायदेमंद है, जो एक अद्वितीय प्रयोगात्मक मंच, प्राप्त करने के लिए उपन्यास और मौजूदा तकनीकों को जोड़ती है. इस रणनीति intracranially, चिकित्सा के जवाब में BMDC, ट्यूमर और सामान्य मस्तिष्क vascularity के उच्च संकल्प एकल कक्ष गतिशील विकास की जांच के लिए एक अमूल्य तरीका साबित हो गया है. Intravital इमेजिंग BMDC भर्ती, प्रवास और भेदभाव इंट्राक्रेनियल मस्तिष्क ट्यूमर vasculature में और साथ ही अन्य अनुसंधान क्षेत्रों के लिए अनुकूलनीय कई अन्य गतिशील प्रक्रियाओं का आणविक नियामकों की एक बेहतर समझ प्रदान कर सकते हैं. अन्य चिकित्सीय रणनीतियों के साथ संयोजन में BMDC कि विनियमित बाधा ख्यात कारकों मिश्रित उपचारों के सटीक समय की पहचान की सहायता कर सकते हैं. इसके अलावा, इस रणनीति के कई भविष्य के जनसंपर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैविवो intravital धुंधला रंगों में न केवल उपयोग, लेकिन यह भी छोटे आणविक अवरोधकों और fluorescently शोधकर्ताओं साथ ही उनके कैनेटीक्स पर अनुलंबीय देखने के रूप में और अधिक लक्षित चिकित्सा विज्ञान के वितरण और माइग्रेशन पैटर्न का पता लगाने के लिए अनुमति टैग कर रहे हैं कि नैनोकणों ojects.
The authors have nothing to disclose.
हम 2Photon माइक्रोस्कोप पर चैनलों की प्रारंभिक सेटअप में उनकी सहायता के लिए विशेष रूप से जेम्स Jonkman में, राजकुमारी मार्गरेट अस्पताल में उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सुविधा को धन्यवाद देना चाहूंगा. लेखकों विकिरण रिस्पांस (STTARR) कार्यक्रम और इसके संबद्ध आर्थिक सहायता एजेंसियों की spatio-अस्थायी लक्ष्यीकरण और प्रवर्धन स्वीकार करना चाहते हैं. हम VEGFTrap प्लास्मिड की आपूर्ति करने के लिए और उनकी पांडुलिपि सुधार और प्रतिक्रिया के लिए डॉ. पीटर टोंगे, Dr.Iacovos माइकल और Dr.Andras नागी धन्यवाद. BTRC में कर्मचारियों से समर्थन जारी रखा और चर्चा अमूल्य किया गया है और हम उनकी वैज्ञानिक इनपुट के लिए Dr.Abhijit गुहा मनाने करना चाहते हैं. काम CIHR और एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Reagent | |||
NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
Equipment | |||
Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
22G Needle | BD | 305156 | |
27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |