Summary
Transcellular 단백질 상호 작용은 췌장 베타 세포 기능의 중요한 결정 요인이다. 여기에 자세한 방법을 적응 특정 막 단백질은 인슐린 분비에 영향을 미치는 방법을 조사 시냅스 - 용의 배양 모델에서. 형질 HEK293 세포는 그 단백질을 표현, 베타 세포는 형질 전환하거나 직접 교란 할 필요가 없습니다.
Abstract
세포 표면 단백질 사이의 상호 작용은 이웃 세포의 기능을 조정하는 데 도움이. 췌장 베타 세포는 췌장 내에서 함께 클러스터링과 포도당 항상성을 유지하기 위해 조정 방식으로 작동합니다. 그것은 인접 베타 세포의 표면에있는 막 단백질 사이의 상호 작용이 베타 세포 기능의 중요한 결정 요인임을 점점 더 분명 해지고있다.
배양 된 베타 세포 또는 생체 내에서 최저 녹아웃 또는 발현 연구에 의해 특정 transcellular 상호 작용의 역할의 해명은 잠재적 효과 분석을 혼동 수있는 방법으로 베타 세포의 건강 및 / 또는 기능에 영향을 미치는 발현 및 단백질 발현의 직접 섭동을 필요로 특정 상호 작용. 이러한 방법은 타겟 단백질의 세포 내 도메인 수준을 변경하고 표시 할 같은 세포막에서 단백질 사이의 상호 작용에 의한 영향을 방지 할 수 있습니다transcellular 상호 작용의 영향에서 tinguished.
여기에 베타 세포의 인슐린 분비 능력 및 응답의 특정 transcellular 상호 작용의 효과를 결정하기위한 방법이 제공됩니다. 이 방법은 INS-1 세포와 같은 베타 세포 라인에 그리고 해리 차 베타 세포에 적용 할 수 있습니다. 그것은 HEK293 (또는 COS) 시냅스 형성을 구동하기위한 중요한 세포층 확인 된 단백질의 발현 특정 신경 세포의 단백질 배양 신경 세포의 노출을 발견 신경 생물 학자에 의해 개발 된 배양 모델을 기반으로합니다. 시냅스의 베타 세포의 분비 기계 사이의 평행선을 감안할 때, 우리는 베타 세포 기능의 성숙 유사 transcellular 상호 작용에 의해 구동 될 수 있다는 추론. 우리는 베타 세포가 관심의 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 레이어에 배양 시스템을 개발했다. 이 모델에서 베타 세포의 세포질은 그대로되어 세포 단백질 - 단백질 자원 활용하면서NS는 조작된다. 우리는 주로 포도당 자극 인슐린 분비의 연구에 여기에 초점을하지만, 다른 프로세스를 분석 할 수 있으며, 예를 들면, 유전자 발현의 변화로 immunoblotting을 또는 qPCR에 의해 결정됩니다.
Introduction
우리는 여기에서 특정 막 단백질의 세포 외 도메인이 인슐린 분비에 영향을 미치는 방법 연구를 촉진하는 방법을 설명합니다. 췌장 베타 세포의 표면에 단백질 (또는 다른 분자)와 관심의 단백질의 상호 작용의 방법 프로브는 효과. 방법은 베타 세포 또는 다른 이웃 세포 (예 : 내피 세포, 신경 세포, 췌장 알파 세포)에 의해 표현 세포 표면 단백질 transcellular 상호 작용 (즉, 인접한 표면에 상호 작용 파트너와의 상호 작용을 통해 통해 베타 세포 기능에 영향을 어떻게 조사 할 수 있습니다 베타 세포).
세포의 세포막은 세포 외 환경에 교량 역할을 구조적, 기능적 단백질의 복잡한 배열을 포함하고 있습니다. transcellular 연결의 형성에 의해 또는 플라스틱 신호 이벤트의 개시에 의해, 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 조정할 수 있습니다이웃 세포의 기능. 췌장 베타 세포는 췌장 내에서 함께 클러스터링과 포도당 항상성 1을 유지하기 위해 조정 방식으로 작동합니다. 로 세포 EphA-ephrinA과 포도당 자극 인슐린 분비의 조절에 neuroligin-2 상호 작용의 중요성에 의해, 예를 들어, 공개, 그것은 점점 더 분명 해지고있다 그 인접의 표면에 단백질 사이에서 발생하는 세포 상호 작용의 지식 증가 베타 세포는 인슐린 분비, 베타 세포 기능의 성숙과 1-3 포도당 항상성의 유지 완전한 이해를 얻기위한 중요성 될 것입니다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 특정 횡단하거나 세포 표면과 연관된 단백질을 포함 transcellular 상호 작용의 베타 세포의 기능에 미치는 영향의 조사를 가능하게하는 것입니다. 다른 식 구조로 형질 HEK293 세포, B에 대한 효과와 공동 배양 (co-culture)의 베타 세포에 의해다른 세포 표면 단백질 또는 돌연변이 변종 ETA 세포의 기능은 그 효율적으로 탐색 할 수 있습니다. 이 베타 세포 자체를 형질하지 않고도 수행 할 수 있습니다.
배양 된 베타 세포 또는 생체 내에서 최저 녹아웃 또는 발현 연구에 의해 특정 transcellular 상호 작용의 역할의 해명은 잠재적으로 분석을 혼동 수있는 방법으로 베타 세포의 건강 및 / 또는 기능에 영향을 미치는 베타 세포의 mRNA와 단백질 발현을 직접 섭동을 필요로 특정 세포 상호 작용의 효과. 이들은 또한 타겟 단백질의 세포 내 도메인 수준을 변경하고, 추가, transcellular 상호 작용의 효과를 구별 할 수 또는 동일한 셀에있는 단백질 사이의 상호 작용에 의해 영향을 허용하지 않는 접근한다. 여기에 베타 세포의 인슐린 분비 능력 및 응답의 특정 transcellular 상호 작용의 효과를 결정하기위한 방법은 DESCR입니다IBED. 이 방법은 INS-1 세포를 4로 인슐린을 분비하는 베타 세포 라인에 그리고 해리 기본 짐승이나 인간의 베타 세포에 적용 할 수 있습니다. 그것은 HEK293 (또는 COS) 세포 레이어에 표현 된 특정 신경 세포의 단백질 배양 신경 세포의 노출을 발견 신경 생물 학자에 의해 개발 된 배양 모델을 기반으로 해당 드라이브의 시냅스 형성 5,6 단백질을 확인할 수 있습니다. 시냅스의 분비 기계 사이의 베타 세포의 평행선을 감안할 때, 우리는 베타 세포 기능과 기능 성숙 유사 transcellular 상호 작용 7-9에 의해 구동 될 수 있다는 추론. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해, 우리는 베타 세포가 그 10의 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 레이어에 동시 배양되는 문서에 설명 된 시스템을 개발했다. 이 시스템은 세포 단백질 - 단백질 상호 작용을 조작하는 동안 베타 세포의 세포질을 그대로 유지 할 수 있습니다.
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Protocol
1. HEK293 레이어의 형질 전환
- 50 ML FBS 5 ML 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 5 ML 100X L-글루타민 용액 500 μL 암포 테리 신 : DMEM의 500 ML 병 (4.5 g / ML 포도당과 페놀 레드와 글루타민이없는)에 추가하여 HEK293 세포 매체를 준비합니다 B.
- 물론 당 HEK293 매체의 0.5 ML를 사용하여 24 - 웰 플레이트에 HEK293 세포 밖으로 접시. 세포가 플레이트의 하단에 균등하게 분산되어 있는지 확인합니다.
- HEK293 세포 플라스미드 lipofectamine과 프로토콜에 따라 관심의 단백질 (포유류 발현 벡터에 삽입) 및 lipofectamine과 2000 년 2 μl를 코딩의 0.8 μg으로 자랄 100 %, 형질에 도달합니다. 우리는 포유 동물 세포에서 발현을 위해 설계 pcDNA 3.3 백본을 사용하기로했다.
- 선택적으로, 배양 6 시간 후, 교환 형질 미디어 정상 HEK293 미디어 lipofectamine과 프로토콜 설명했다.
- 형질 전환 prote의 식을 계산하려면에 형질 전환 조직 문화 우물의 하위 집합을 표현 단백질의 면역 형광 검출 또는 표준 기술을 사용하여 단백질 발현의 서양 얼룩 분석에 사용할 수 있습니다.
2. HEK293 세포의 선택적 고정은 형질 전환 단백질을 표현
형질 HEK293 세포는 부드럽게 HEK293 세포 (예를 들어, 아래의 단계 3.9) 거주 또는 (또한 토론 참조) 한 번에 여러 가지 실험 플레이트 사전에 효율적으로 준비 할 수 있도록에 유해 할 수 있습니다 미디어에서 배양을 촉진하기 위해 고정 할 수 있습니다.
- HEK293 세포에있는 단백질의 발현의 시간 과정을 결정하기 위해 파일럿 연구를 실시한다.
- HEK293 세포 층을 형질 후, 표현의 높은 수준과 관련된 포스트 형질 시점에서 세포에서 미디어를 대기음. 이 첫 번째 24 시간 내에서 발생하는 경우, 형질 전환 후 24 시간 전까지 대기음하지 않습니다.
- HE 세척부드럽게 D-PBS와 K293 세포는 500 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가하고 30 분 동안 RT에서 품어. (4 % PFA 솔루션을 만들려면 1X PBS에서 16 % 용액으로 시작하고 1X PBS로 1:4 희석).
- 멸균 PBS를 사용, 가볍게 4 ℃에서 PBS O / N에있는 세포에게 3 번과 부화를 씻어
- 세포에게 멸균 PBS로 3 회 세척 한 후 PBS를 추가하고 4시에 떠나 ° C까지 필요 (최대 저장 시간은 발현 단백질에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 관찰 된 효과에 큰 변화없이 이주에 대한 neuroligin의 아형을 표현 형질 HEK293 세포를 저장 인슐린 분비).
3. HEK293 세포와 INS-1 베타 세포의 공동 배양
- (포도당과 페놀 레드와 글루타민없이) 500 ML RPMI 1640에 추가하여 INS-1 미디어를 준비 : 50 ML FBS 5 ML 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML 100X L-글루타민 용액, 5 ML 나트륨 피루 베이트, 500 μL 암포 테리 신 B, 500 μL 베타 - 머 캅토 에탄올 (이 메디 거의 동일합니다음 일반적으로 베타 - 머 캅토 에탄올의 추가)을 제외한 주요 섬 문화에 사용됩니다.
- (또는 다른 비 효소 세포 제거) 세포 스트리퍼를 사용하여 수확 INS-1 T75 문화 플라스크의 바닥 떨어져 자랄 약 70-80%에서 세포. 각각의 플라스크에 48 우물 대략 충분한 세포를 제공합니다.
- INS-1과 HEK 미디어 50 / 50 혼합에 resuspend을 1,200 rpm에서 3 분을 위해 원심 분리기에서 세포를 스핀 다운 후. INS-1 세포의 70~80% 합류 플라스크를 들어, 혼합 매체의 약 25 ML에 resuspend을.
- 오히려 라이브 HEK293 세포보다 파라 포름 알데히드에서 수정 된 HEK293 세포를 사용하는 경우, 100 %보다는 혼합 매체보다 INS-1 미디어 INS-1 세포를 resuspend을.
- 10 ㎖ 피펫 사용하여 균일 한 세포 현탁액을 만들기 위해 펠렛의 세포를 이동시키다.
- HEK293 세포에서 미디어를 제거하는 대기음.
- P1000 피펫을 사용하여 부드럽게 O는 측면을 따라 HEK 세포 층에 INS-1 세포 현탁액 500 μl를 추가F도. 매 6 우물 후, 균일 한 세포 현탁액을 보장하기 위해 다시 INS-1 세포를 resuspend을 위해 10 ㎖ 피펫을 사용합니다. 배양 셋업의 전체 구조는 그림 1에 묘사되어있다.
- 실험 프로토콜에 따라 24-48 시간 동안 세포를 품어.
- 이상 48 시간의 배양 기간이 필요한 경우, HEK293 세포를 해결하기 위해 절에서는 위의 2에서 선택적 단계를 사용하십시오.
- 기본 해리 짐승이나 인간의 섬을 사용하면 [예 조브 11-15로 앞서 프로토콜을 참조]가 5 ML 펜 / strep의 5와 같은 RPMI 같은 적절한 미디어가 ML L-과잉, 0.5 ML 암포 테리 신-B가 대신 사용되도록 INS-1 미디어. 하나 때문에 잠재적으로 필요 섬의 많은 수의 연습, 24 웰 플레이트에 해리 섬 세포를 사용할 수 있지만, 그것은 고려가 48 잘 플레이트 (물론 당 적은 수의 췌도 세포를 필요로)로 스케일링 아래로 주어진 것이 좋습니다. 48 잘 접시에, dissocia의 가치가 약 100 섬을 추가시작 플레이트 당 테드 세포. 해리의 효능과 사용 방법에 따라 적은 섬이 필요할 수 있습니다.
4. 포도당은 인슐린 분비를 자극
- 1 시간의 최소 KRB 2.5 mM의 포도당 (크렙스 - 링거 중탄산염 버퍼) 250 μL의 세포를 Preincubate. , preincubate 배양 배지를 제거하고 즉시 KRB로 교체합니다. 이 교환은 환경에 산소 INS-1 세포의 노출을 최소화하기 위해 한 번에 제대로 하나를 수행해야합니다. 서로가 낮은 (2.5 ㎜) 포도당 KRB를 피펫 한 손으로 흡입.
- 2.5 mm 또는 시간에 잘 KRB 버퍼 하나에 20 mM의 포도당도 250 μL에 교환 배양 전 KRB.
- 특정 실험에 적합한 경우와 같은 100 μM의 IBMX 같은 추가 분비는보다 강력한 자극 인슐린 분비 반응을 생산하기 위해 추가 할 수 있습니다. 특히 해리 기본 췌장 베타 세포의 증가 포도당 농도 아론에 제대로 반응하는전자, 그래서 IBMX 다른 분비의 여기에 특히 첨가 16,17을 고려하여야한다.
- 배양 1 시간 후, 미디어 튜브의 microfuge 5 분 1,500 XG에 스핀을 전송할 수 있습니다.
- 상층 액 200 μl를 제거하고 인슐린 RIA 또는 ELISA로 분석이 사용합니다.
- 세포 해물을 준비하려면 (1.0 % IGEPALCA-630 또는 Nonidet P-40, 0.5 %의 나트륨 deoxycholate, 0.1 % SDS, 50 MM 트리스, 산도 8.0 150 mM의 NaCl을), 단백 분해 효소 억제제가에 RIPA 세포 용해 완충액 100 μl를 추가 바로 4에서 미디어와 부화를 제거 ° C를 20 분 후 접시.
- 10,000 XG에 15 분 동안 해물을 회전 인슐린 RIA 또는 ELISA로 분석 상층 액 50 μl를 제거합니다.
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Representative Results
방법을 사용하여 여기에 설명 된, 우리는 인슐린 분비 단백질 neuroligin의 다른 변형의 효과를 시험했다. 이 베타 세포 기능 10 neuroligin-2의 효과를 조사하는 우리의 게시 된 작품을 보완한다. 그림 2 예를 들어, 여기에 언급 neuroligin 이소을 표현 형질 HEK293 세포 coculturing의 INS-1 베타 세포에서 얻은 결과를 보여 NL- X. 이 실험은 NL-X는 인슐린 분비를 증가시키는 transcellular 상호 작용에 종사하는 가설을 테스트하도록 설계되었습니다. 그림 2A, 그것은 NL-X의 발현이 기저 증가와 동시 배양 INS-1 세포에 의해 인슐린 분비를 자극 함을 알 수있다. HEK293 세포를 형질의 접근 방식은 그래서 그들은 NL-X를 표현하는 것을 우리는 그것이 세포 도메인 동시 배양 INS-1 세포, 즉 제공과 접촉 할 수 있으므로 HEK293 세포 표면에 표시되는 영역이며 것을 알 수 있습니다 obse에 대한분비 rved 증가. NL-X 세포 도메인 INS-1 세포가 더 많은 인슐린을 분비하게하는 INS-1 세포 표면에있는 다른 단백질 (또는 다른 분자)와 상호 작용해야합니다. 원하는 경우, 분비 된 인슐린은 세포를 lysing 후 측정 할 수있는 세포의 인슐린 콘텐츠의 백분율로 표시 할 수 있습니다.
그림에서 2B 및 2C는 배양 시스템을 사용하여 분석을 다른 유형의 결과가 그려져있다 : 특히, 세포의 인슐린 함량과 PDX-1과 인슐린 mRNA 수준에 neuroligin 변종 NL-Y를 포함하는 transcellular 상호 작용의 효과 분석. NL-Y는 동시 배양 INS-1 세포 (그림 2B)의 인슐린 함량을 증가 시켰습니다. 추가 테스트는이 셀 당 인슐린의 양을 증가 또는 증가로 인해 INS-1 세포의 증식에 의한되었는지 여부를 확인할 필요가있을 것이다. 그림 2C에서 RNA는 세포에서 수확했다레이어와 RT-qPCR에 의해 분석 하였다. HEK293 세포 HEK293 및 INS-1 세포 모두에 존재있을 수 있습니다 성적표를 들어, 인간의 기원이기 때문에, INS-1 원산지 만 발현을 보장 쥐 특이 PCR 프라이머 (INS-1 세포가 쥐의 기원이다)의 사용 측정됩니다. 여기가 NL-Y와 함께 배양 인슐린과 PDX-1 mRNA 수준을 (정규화 18S RNA에 있었다) 증가 함을 알 수있다. 이 RT-qPCR의 분석에 사용되는 프라이머와 방법론은 이전 10 온라인 보충 설명 하였다.
그림 1. 배양 셋업. HEK293 (HEK) 세포는 24 잘 조직 배양 플레이트에 추가 한 후 형질 전환. 대표 HEK293 세포 층의 시야 이미지는 오른쪽 상단에 표시됩니다 수 있습니다. HEK 세포 에피토프 태그가 막 단백질을 표현하는 형질 전환됩니다. 여기에, 면역 형광 염색 형질 전환을 표시하는 데 사용됩니다세포 (녹색). 다음으로, INS-1 세포가 추가됩니다. 인슐린에 대한 면역 형광 염색 동시 배양 INS-1 세포 (적색)의 시각화를 할 수 있도록 하였다.
그림 2. coculturing의 INS-1 neuroligin 단백질 변종 NL-X 또는 NL-Y (채워진 검은 열). 제어 HEK293 세포를 표현하는 형질 HEK293 세포와 베타 세포에서 얻은 결과는 않기에 이렇게 변경 같은 플라스미드 구조로 형질 전환 된 특급 단백질 (흰색 열). (20 ㎜) 낮은 (2.5 NM) 고 포도당 조건 하에서도 IBMX과 함께 높은 포도당으로 자극 한 후 동시 배양 INS-1 세포에 의해 인슐린 분비. B, INS-1 세포의 인슐린 함량 NL-Y를 표현 HEK293 세포 배양 후. C, 분석가NL-Y이나 제어 형질 전환 HEK293 세포와 형질 중 하나를 HEK293 세포 동시 배양 INS-1 세포에서 분리 된 RNA를 이용하여 RT-qPCR에 의한 인슐린과 PDX-1 전사 수준이다. (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
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Discussion
여기에 설명 된 배양 방법은 특정 베타 세포 표면 막 단백질의 생리적 중요성을 확인하는 효과적인 방법을 제공합니다, 특히 자신의 세포 도메인으로. 세포 표면에 대한이자의 단백질을 표시하는 HEK293 세포와 접촉 배양 베타 세포 또는 인슐린 종 세포 (예 : 여기에 사용 된 INS-1 세포)에 의해 실험을 직접 방해하지 않고 세포 단백질 - 단백질 상호 작용의 효과를 결정하기 위하여 디자인 될 수있다 세포의 세포 내 환경. 관심의 단백질이 HEK293 세포에 의해 표현되기 때문에, 형질 전환 단백질의 세포 내 도메인에 의해 중재 될 수 β-세포 기능에 대한 영향은 없을 것입니다 따라서 세포 상호 작용의 효과 분석을 복잡하게하지 않을 것입니다.
인슐린 분비에 미치는 영향은 쉽게 HEK293 세포를 동시 배양 베타 세포에서 분비를 비교하여 확인할 수 있습니다제어 HEK293 세포와 접촉 동시 배양 베타 세포에서 분비 관심의 단백질을 표현. 제어 HEK293 세포는 모의 형질 전환거나, 또는 관심의 단백질의 비 기능적 변형을 생산하는 변이 생성 실험 플라스미드의 변형 형질 전환 할 수 있습니다. 우리 손에, 컨트롤의 두 가지 유형이 동일한 결과를 굴복했다. HEK293 세포 표면은 본질적으로 단백질의 큰 다양성을 포함하기 때문에, 제어 유형 중 하나가 관심의 단백질 등 다양한 세포 표면 분자와 접촉 베타 세포의 기능이 접촉하는 베타 세포의 기능을 비교 할 수 있습니다 그 (또는 관심의 단백질의 변이 된 버전을 포함)의 단백질의 예외 세포 표면 분자의 동일한 세트.
INS-1 세포 (또는 다른 베타 세포) 다른 INS-1 CEL와 INS-1 세포의 최소한의 또는 전혀 접촉이되도록 낮은 밀도 HEK293 레이어에 추가됩니다LS. 이 같은 단백질을 포함 transcellular 상호 작용에 의해 발생하는 잠재적 배경 소음의 부재에서 관찰 할 INS-1 세포 표면에 HEK293 세포 표면 단백질에 표현 관심의 단백질 사이의 transcellular 상호 작용의 효과가 INS에 내생 적 표현 할 수 있습니다 -1 세포 표면.
형질 전환 후, HEK293 세포 층을 부드럽게 고정 할 수 있습니다. 이 옵션 고정 여러 배양 접시가 나중에 베타 세포의 후속 추가를 위해 한 번에 준비 할 수 있도록 활용할 수 있습니다. HEK293 대사 또는 분비 기능이 어떻게 든 베타 세포 기능의 분석을 방해 할 우려가 있다면 HEK293 세포를 고정하면 유용 할 것이다. 마지막으로, 고정 프로토콜은 장기간 배양 실험을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 여기에 고정 HEK293 세포를 사용하여의 주요 장점은 베타 세포의 최적 배지 오히려를 사용하는 것보다 고용 할 수 있다는 것입니다혼합 매체 (예를 들어, 단계 3.3 참조)을 동시에 동시 배양 HEK293 및 베타 세포를 유지하기 위해 필요합니다. 장기간 배양 실험에서, 두 세포 유형 수 베타 세포의 생존에 악영향을위한 미디어하는 최적의 상태가 아닌 혼합으로 사용합니다.
그들은 형질에 매우 의무가 있기 때문에 HEK293 세포가 여기에 고용되어 그들은 서로 다른 형질 시약 18,19의 다양한 사용하여 높은 효율로 형질 전환 할 수 있습니다. 정기적으로 유사한 신경 세포 배양 시스템 5 고용 - HEK293는 유형 - 함께 COS 세포 두 개의 세포 중 하나입니다. lipofectamine과 2000은 매우 일반적으로 출판 된 연구 결과 18-20의 95 % 이상으로 HEK293 세포와 정기적으로 달성 형질 전환 효율 (세포의 %가 형질 전환 된) 함께 사용되는 검증 된 형질 시약이다. 다른 시약 형질 19,20 유사한 효율을 달성 할 수있다. 우리 neuroligin-2 플라스미드 구조로, 형질 전환 효율은 일반적으로 ~ 80 %이다. 고도무릎 우리가 포도당 자극 인슐린 분비의 연구에 여기에 초점, 분석의 다른 모드는 FACS, 면역, 웨스턴 블롯 및 / 또는 그림 2C, qPCR에 볼에 의해, 예를 들면 가능합니다.
특정 세포 단백질 상호 작용의 기능을 밝히기 데 매우 유용한 도구 임에도 불구하고, 방법은 한계가없는 것은 아니다 여기에 설명. 베타 세포 HEK293 세포 층과 직접 접촉 할 필요가 있기 때문에, 같은 INS-1 세포와 같은 인슐린 종 세포주 특히이 배양 시스템 4에 적합합니다. 주요 섬 세포에 결과를 변환하는 것은 고립 된 섬의 분산이 필요합니다. 섬 구조 자체가 적절한 신호 및 포도당 반응에 필수적이기 때문에, 자극 인슐린 반응은 그대로 섬 1,3,17을 기준으로 분산 된 차 베타 세포에서 무디게합니다. 또한, 때문에 일시적인 형질은 일의 균일 한 표정으로 발생하지 않습니다 영상 기반 (면역) 실험을 수행 HEK 잔디에 걸쳐 전자 단백질, 단백질 발현 수준으로 정상화하는 방법이 결과를 해석해야 할 수 있습니다. 동시 배양 INS-1 세포의 분비 기계에 형질 전환 단백질의 효과를 분석하기 위해이 비 균일 한 표현을 활용 실험 방법은 Suckow 등. 2012 년 10 그림 3에 묘사되어있다.
그것은 관심의 단백질을 발현하는 특정 베타 세포와 인접한 세포 사이의 접촉의 정도가 베타 세포가 세포에 의해 모든면에서 포위 될 수있는 생체 내에서 그대로 섬에 비해이 시스템에 적게 될 가능성이 있음도 주목해야한다 단백질을 표현. 관련 transcellular 상호 작용이 어떻게 든 네이티브 섬에서 제거 된 경우이 상대적으로 감소 휴대 전화의 접촉 인슐린 분비의 변화 관찰 할 것이 무엇 아래로의 크기를 줄일 수 있습니다.
e_content는 "오히려 일시적인 형질보다 안정적으로 형질 전환 HEK293 세포의 클론 인구의> 사용보다 균일 한 표현 될 수 있으며 아마도 실험 셋업 간단하지만, 생성하는 안정적 -를 위해 실질적으로 더 솔직한 시간과 노력을 필요로 할 세포를 표현. 미래 연구는 것 HEK293 세포 층에 두 개 이상의 횡단 단백질을 형질하여 가능한 상승 효과가 관찰 될 수 있는지 여부를 결정합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 건강 보조금 R01DK080971 및 청소년 당뇨병 연구 재단 보조금 37-2009-44의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 UCSD 소아 당뇨병 연구 센터 (PDRC)로부터받은 지원도 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
