Summary
Transcellular प्रोटीन बातचीत अग्नाशय बीटा सेल समारोह के महत्वपूर्ण निर्धारक हैं. है यहाँ विस्तृत एक विधि अनुकूलित विशिष्ट transmembrane प्रोटीन इंसुलिन स्राव को प्रभावित जांच कैसे synaptogenesis के लिए की एक coculture मॉडल से. ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं ब्याज की प्रोटीन व्यक्त; बीटा कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट या अन्यथा सीधे परेशान होने की जरूरत नहीं है.
Introduction
हम यहाँ विशिष्ट transmembrane प्रोटीन की कोशिकी डोमेन इंसुलिन स्राव को प्रभावित कैसे की जांच की सुविधा के लिए एक विधि का वर्णन है. अग्नाशय बीटा कोशिका की सतह पर प्रोटीन (या संभवतः अन्य अणुओं) के साथ ब्याज की प्रोटीन की बातचीत की विधि जांच प्रभाव. विधि बीटा कोशिकाओं द्वारा या अन्य पड़ोसी कोशिकाओं (जैसे endothelial कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, अग्नाशय अल्फा कोशिकाओं) द्वारा व्यक्त सेल सतह प्रोटीन transcellular बातचीत (यानी आसन्न की सतह पर बातचीत के सहयोगियों के साथ बातचीत के माध्यम से के माध्यम से बीटा सेल समारोह को प्रभावित करने की जांच की अनुमति देता है बीटा कोशिकाओं).
सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली बाह्य वातावरण के लिए पुल के रूप में सेवारत संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रोटीन का एक जटिल सरणी शामिल हैं. Transcellular कनेक्शन के गठन तक या प्लास्टिक के संकेत घटनाओं की दीक्षा से, सेल सतह प्रोटीन के बीच बातचीत समन्वय में मदद कर सकते हैंपड़ोसी की कोशिकाओं के समारोह. अग्नाशय बीटा कोशिकाओं अग्नाशय islets के भीतर एक समूह और ग्लूकोज homeostasis 1 बनाए रखने के लिए एक समन्वित फैशन में अभिनय कर रहे हैं. के रूप में बाह्य EphA-ephrinA और ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव के नियमन में neuroligin-2 बातचीत के महत्व से, उदाहरण के लिए, पता चला, यह कभी भी और अधिक स्पष्ट होता जा रहा है कि आसन्न की सतहों पर प्रोटीन के बीच होने वाली कोशिकी बातचीत की वृद्धि हुई ज्ञान बीटा कोशिकाओं को इंसुलिन के स्राव, बीटा सेल कार्यात्मक परिपक्वता और 1-3 ग्लूकोज homeostasis के रखरखाव की पूरी समझ पाने के लिए काफी महत्व का हो जाएगा. यहाँ वर्णित विधि का लक्ष्य विशिष्ट transmembrane या अन्यथा सेल सतह से जुड़े प्रोटीन को शामिल transcellular बातचीत का बीटा सेल समारोह पर प्रभाव की जांच के लिए सक्षम है. अलग अभिव्यक्ति निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं, ख पर प्रभाव के साथ सह संवर्धन बीटा कोशिकाओं द्वाराअलग सेल सतह प्रोटीन या उत्परिवर्तित वेरिएंट की एटा सेल समारोह तत्संबंधी कुशलता की जांच की जा सकती है. इस बीटा कोशिकाओं को खुद transfect करने के लिए बिना पूरा किया है.
सुसंस्कृत बीटा कोशिकाओं में या विवो में पछाड़ना, पीटकर या overexpression के अध्ययन के द्वारा विशेष transcellular बातचीत की भूमिका की व्याख्या संभवतः के विश्लेषण उलझाना सकता है कि मायनों में बीटा सेल स्वास्थ्य और / या समारोह को प्रभावित करने, बीटा सेल mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रत्यक्ष गड़बड़ी जरूरी विशिष्ट कोशिकी बातचीत के प्रभाव. ये भी लक्षित प्रोटीन के intracellular डोमेन के स्तर में परिवर्तन और, आगे, transcellular बातचीत के प्रभाव से प्रतिष्ठित किया जाना पर या एक ही सेल में प्रोटीन के बीच बातचीत के कारण प्रभाव की अनुमति नहीं है दृष्टिकोण. इधर, बीटा कोशिकाओं से इंसुलिन स्रावित क्षमता और जवाबदेही पर विशिष्ट transcellular बातचीत के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए एक विधि descr हैibed. इस विधि में इस तरह आईएनएस-1 कोशिकाओं के रूप में 4 इंसुलिन स्रावित बीटा सेल लाइनों, के लिए और अलग प्राथमिक कृंतक या मानव बीटा कोशिकाओं के लिए लागू है. यह HEK293 (या भं.नि.) सेल परतों पर व्यक्त विशिष्ट neuronal प्रोटीन के लिए सभ्य न्यूरॉन्स की है कि जोखिम पाया जो neurobiologists, द्वारा विकसित coculture मॉडल पर आधारित है कि ड्राइव synapse गठन 5,6 प्रोटीन की पहचान कर सकता है. तंत्रिका synapses के स्रावी तंत्र के बीच और बीटा कोशिकाओं की समानताएं देखते हुए, हम बीटा सेल समारोह और कार्यात्मक परिपक्वता समान transcellular बातचीत 7-9 से संचालित किया जा सकता है समझाया. इन संबंधों की जांच करने के लिए, हम बीटा कोशिकाओं ब्याज 10 के प्रोटीन व्यक्त HEK293 कोशिकाओं की एक परत पर cocultured रहे हैं जिसमें यहाँ बताया प्रणाली विकसित की है. इस प्रणाली के बाह्य प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत छेड़छाड़ कर रहे हैं, जबकि बीटा सेल cytoplasm अछूता रहने के लिए अनुमति देता है.
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Protocol
1. HEK293 लेयर के अभिकर्मक
- 50 मिलीलीटर एफबीएस, 5 मिलीलीटर 100X पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, 5 मिलीलीटर 100x एल glutamine समाधान और 500 μl amphotericin: DMEM के 500 मिलीलीटर की बोतल (4.5 ग्राम / मिलीलीटर ग्लूकोज और फिनोल लाल के साथ और glutamine के बिना) को जोड़कर HEK293 सेल मध्यम तैयार बी
- अच्छी तरह से प्रति HEK293 मीडिया के 0.5 मिलीलीटर का उपयोग कर एक 24 अच्छी तरह से थाली में HEK293 कोशिकाओं बाहर प्लेट. कोशिकाओं प्लेट के नीचे भर में समान रूप से फैला रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
- HEK293 कोशिकाओं प्लाज्मिड Lipofectamine प्रोटोकॉल के अनुसार ब्याज की प्रोटीन (एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर में डाला) और 2000 Lipofectamine के 2 μl कोडिंग की 0.8 ग्राम के साथ confluency 100%, transfect तक पहुँचते हैं. हम स्तनधारी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए बनाया गया pcDNA 3.3 रीढ़ की हड्डी का उपयोग करने का विकल्प चुना है.
- वैकल्पिक रूप से, ऊष्मायन के 6 घंटे के बाद, विनिमय अभिकर्मक मीडिया सामान्य HEK293 मीडिया के साथ Lipofectamine प्रोटोकॉल में वर्णित है.
- ट्रांसफ़ेक्ट prote की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिएमें, ट्रांसफ़ेक्ट टिशू कल्चर कुओं का एक सबसेट व्यक्त प्रोटीन की immunofluorescent का पता लगाने के लिए या मानक तकनीक का उपयोग कर प्रोटीन अभिव्यक्ति के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. HEK293 कोशिकाओं की वैकल्पिक फिक्सेशन ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन व्यक्त
ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं धीरे HEK293 कोशिकाओं (उदाहरण के लिए नीचे कदम 3.9) रहने वाले या (भी चर्चा देखें) सभी एक ही बार में कई प्रयोगों के लिए प्लेटों के अग्रिम में कुशल तैयार करने की अनुमति देने के लिए हानिकारक हो सकता है कि मीडिया में coculture को सुविधाजनक बनाने के क्रम में तय किया जा सकता है.
- HEK293 कोशिकाओं में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के समय के पाठ्यक्रम निर्धारित करने के लिए पायलट अध्ययन का संचालन.
- HEK293 सेल परत transfecting बाद, अभिव्यक्ति के उच्चतम स्तर के साथ जुड़ा बाद अभिकर्मक समय बिंदु पर कोशिकाओं से मीडिया aspirate. यह पहले 24 घंटे के भीतर होता है, अभिकर्मक के बाद 24 घंटे तक महाप्राण नहीं है.
- महामहिम धोधीरे डी पीबीएस के साथ K293 कोशिकाओं तो 500 μl 4% paraformaldehyde (पीएफए) जोड़ने के लिए और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं. (4% पीएफए समाधान बनाने के लिए, 1X पीबीएस में 16% समाधान के साथ शुरू और 1X पीबीएस के साथ 01:04 पतला.)
- बाँझ पीबीएस का प्रयोग, धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस हे / एन में कोशिकाओं 3 बार और सेते धोने
- कोशिकाओं बाँझ पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, तो पीबीएस जोड़ने और 4 में छोड़ डिग्री सेल्सियस तक की जरूरत (अधिकतम भंडारण समय व्यक्त प्रोटीन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. हम मनाया प्रभाव में महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना 2 सप्ताह तक के लिए neuroligin isoforms व्यक्त करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं की दुकान इंसुलिन स्राव पर).
3. HEK293 कोशिकाओं के साथ आईएनएस -1 बीटा कोशिकाओं के सह संवर्धन
- (ग्लूकोज और फिनोल लाल के साथ और glutamine के बिना) 500 मिलीलीटर 1640 RPMI को जोड़कर आईएनएस -1 मीडिया तैयार: 50 मिलीलीटर एफबीएस, 5 मिलीलीटर 100X पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 मिलीलीटर 100X एल glutamine समाधान, 5 मिलीग्राम सोडियम पाइरूवेट, 500 μl amphotericin बी, 500 μl बीटा mercaptoethanol (इस दवा के लिए लगभग समान हैउम आम तौर पर बीटा mercaptoethanol के अलावा) के लिए छोड़कर प्राथमिक आइलेट संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया.
- (या किसी अन्य गैर enzymatic सेल पदच्युत) सेल स्ट्रिपर का प्रयोग, फसल आईएनएस -1 एक T75 संस्कृति कुप्पी के नीचे बंद confluency लगभग 70-80% पर कोशिकाओं. प्रत्येक कुप्पी 48 कुओं के लिए लगभग पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान करेगा.
- आईएनएस -1 और HEK मीडिया का एक 50/50 मिश्रण में resuspend 1,200 rpm पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं नीचे कताई के बाद. आईएनएस-1 कोशिकाओं की एक 70-80% मिला हुआ कुप्पी के लिए, मिश्रित मीडिया की लगभग 25 मिलीलीटर में resuspend.
- बल्कि जीने HEK293 कोशिकाओं से paraformaldehyde में तय किया गया है कि HEK293 कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, तो 100% बल्कि मिश्रित मीडिया से आईएनएस-1 मीडिया में आईएनएस-1 कोशिकाओं resuspend.
- एक 10 मिलीलीटर विंदुक का प्रयोग, एक समरूप सेल निलंबन बनाने के लिए गोली से कोशिकाओं को जगह देना.
- HEK293 कोशिकाओं पर मीडिया को दूर करने के महाप्राण.
- एक P1000 विंदुक का प्रयोग, धीरे ओ पक्षों के साथ HEK सेल परत पर आईएनएस -1 सेल निलंबन के 500 μl जोड़नेच अच्छी तरह से. हर 6 कुओं के बाद, एक समरूप सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए फिर से आईएनएस-1 कोशिकाओं resuspend एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग करें. coculture सेट अप की समग्र योजना चित्र 1 में दिखाया गया है.
- प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के आधार पर 24-48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- अधिक से अधिक 48 घंटा coculture अवधि की आवश्यकता है, HEK293 कोशिकाओं को ठीक करने के लिए खंड ऊपर 2 में वैकल्पिक चरणों का उपयोग करें.
- प्राथमिक अलग कृंतक या मानव टापू का उपयोग कर [जैसे जौव 11-15 में पूर्व प्रोटोकॉल देखने], तो 5 मिलीलीटर कलम / strep, 5 के साथ इस तरह RPMI के रूप में एक उपयुक्त मीडिया मिलीलीटर एल भरमार, 0.5 मिलीलीटर amphotericin बी के बजाय प्रयोग किया जाता है कि यह सुनिश्चित आईएनएस -1 मीडिया. क्योंकि एक संभावित जरूरत टापू की बड़ी संख्या के अभ्यास में, एक 24 अच्छी तरह से थाली में अलग आइलेट कोशिकाओं का उपयोग कर सकते हैं, यह विचार एक 48 अच्छी तरह से थाली (अच्छी तरह से प्रति कम आइलेट कोशिकाओं की जरूरत महसूस) के लिए स्केलिंग के लिए नीचे दिए जाने की सिफारिश की है. एक 48 अच्छी तरह से थाली पर, dissocia की कीमत लगभग 100 टापू जोड़शुरू करने के लिए थाली प्रति टेड कोशिकाओं. हदबंदी की प्रभावकारिता और प्रयोग विधि पर निर्भर करता है, कम टापू आवश्यकता हो सकती है.
4. ग्लूकोज इंसुलिन स्राव प्रेरित
- 1 घंटे की एक न्यूनतम के लिए KRb में 2.5 मिमी ग्लूकोज (क्रेब्स-घंटी बाइकार्बोनेट बफर) के 250 μl में कोशिकाओं Preincubate. , Preincubate coculture मध्यम हटाने और तुरंत KRb के साथ बदलने के लिए. यह विनिमय पर्यावरण ऑक्सीजन को आईएनएस-1 कोशिकाओं के जोखिम को कम करने के लिए एक समय में एक अच्छी तरह से किया जाना चाहिए. अन्य के साथ कम (2.5 मिमी) ग्लूकोज KRb pipetting जबकि एक हाथ से महाप्राण.
- 2.5 मिमी या एक समय में अच्छी तरह से KRb बफर में 20 मिमी ग्लूकोज या तो के 250 μl के लिए Exchange preincubation KRb.
- विशिष्ट प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं, तो इस तरह के 100 माइक्रोन IBMX के रूप में अतिरिक्त secretagogues एक और अधिक मजबूत प्रेरित इंसुलिन स्राव प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए जोड़ा जा सकता है. विशेष रूप से अलग प्राथमिक आइलेट बीटा कोशिकाओं में वृद्धि हुई ग्लूकोज सांद्रता alon को खराब उत्तरदायी हैंई, ताकि IBMX या अन्य secretagogues का यहां विशेष रूप से इसके अलावा 16,17 विचार किया जाना चाहिए.
- ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद, मीडिया ट्यूबों microfuge और 5 मिनट के लिए 1500 XG स्पिन करने के लिए स्थानांतरण.
- सतह पर तैरनेवाला के 200 μl निकालें और इंसुलिन रिया या एलिसा द्वारा विश्लेषण के लिए इस का उपयोग करें.
- सेल lysate तैयार करने के लिए, (1.0% IGEPALCA-630 या Nonidet पी -40, 0.5% सोडियम deoxycholate, 0.1% एसडीएस, 50 मिमी Tris, पीएच 8.0 150 मिमी NaCl,) protease inhibitors के साथ करने के लिए RIPA सेल lysis बफर के 100 μl जोड़ने तुरंत 4 पर मीडिया और सेते हटाने डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए के बाद थाली.
- 10,000 XG पर 15 मिनट के लिए lysate स्पिन और इंसुलिन रिया या एलिसा द्वारा विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला के 50 μl हटा दें.
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Representative Results
विधि का प्रयोग यहाँ वर्णित है, हम इंसुलिन स्राव पर प्रोटीन neuroligin की विभिन्न किस्मों के प्रभाव का परीक्षण किया है. इस बीटा सेल समारोह 10 पर neuroligin-2 के प्रभाव की जांच कर हमारे प्रकाशित काम पूरक. चित्रा 2, उदाहरण के लिए, यहाँ के रूप में जाना जाता था neuroligin isoform व्यक्त करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं के साथ coculturing आईएनएस -1 बीटा कोशिकाओं से प्राप्त परिणामों को दर्शाया गया नाथन- एक्स इस प्रयोग नाथन एक्स इंसुलिन स्राव को बढ़ा कि transcellular बातचीत में संलग्न है कि परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए डिजाइन किया गया था. चित्रा 2A में, यह नाथन एक्स की अभिव्यक्ति बेसल वृद्धि हुई है और cocultured आईएनएस-1 कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन के स्राव को प्रेरित किया है कि देखा जा सकता है. HEK293 कोशिकाओं transfecting के दृष्टिकोण ताकि वे नाथन एक्स व्यक्त कि हमें यह कोशिकी डोमेन जो cocultured आईएनएस-1 कोशिकाओं कि लाता है के साथ संपर्क में आने के लिए सक्षम इस प्रकार HEK293 कोशिका की सतह पर प्रदर्शित क्षेत्र है और है कि पता करने के लिए अनुमति देता है obse के बारे मेंस्राव में rved वृद्धि हुई है. नाथन एक्स कोशिकी डोमेन आईएनएस-1 कोशिकाओं को अधिक इंसुलिन का स्राव करने के लिए प्रेरित करने के लिए भारतीय नौसेना पोत -1 कोशिका की सतह पर एक प्रोटीन (या शायद कुछ अन्य अणु) के साथ बातचीत की जानी चाहिए. अगर वांछित, स्रावित इंसुलिन भी कोशिकाओं lysing के बाद मापा जा सकता है जो सेलुलर इंसुलिन सामग्री, का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जा सकता है.
आंकड़े में 2 बी और 2 सी, coculture प्रणाली का उपयोग कर विश्लेषण के अन्य प्रकार से परिणाम चित्रित कर रहे हैं: विशेष रूप से, सेलुलर इंसुलिन सामग्री पर और PDX-1 और इंसुलिन mRNA स्तर पर neuroligin संस्करण नाथन वाई को शामिल transcellular बातचीत के प्रभाव का विश्लेषण करती है. नाथन वाई cocultured आईएनएस-1 कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) के इंसुलिन सामग्री वृद्धि हुई. आगे के परीक्षण यह एक सेल प्रति इंसुलिन की मात्रा में वृद्धि या वृद्धि की वजह आईएनएस -1 सेल प्रसार करने के कारण हुई थी या नहीं यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक होगा. चित्रा -2, शाही सेना सेल से काटा गया थापरत और RT-qPCR से विश्लेषण किया. HEK293 कोशिकाओं HEK293 और आईएनएस-1 कोशिकाओं दोनों में मौजूद हो सकता है कि टेप के लिए, मानव मूल के हैं, आईएनएस -1 मूल की है कि केवल mRNA सुनिश्चित चूहे विशिष्ट पीसीआर प्राइमरों (आईएनएस-1 कोशिकाओं चूहे मूल के हैं) का उपयोग मापा जाता है. यहाँ यह नाथन वाई के साथ coculture इंसुलिन और PDX-1 mRNA स्तर (सामान्य बनाने 18S शाही सेना के लिए गया था) में वृद्धि हुई है कि देखा जा सकता है. इस RT-qPCR विश्लेषण के लिए इस्तेमाल प्राइमरों और कार्यप्रणाली पहले से 10, ऑनलाइन पूरक वर्णित किया गया.
चित्रा 1. Coculture सेट अप. HEK293 (HEK) कोशिकाओं 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों को जोड़ा जाता है और फिर ट्रांसफ़ेक्ट. एक प्रतिनिधि HEK293 सेल परत का एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि सही, शीर्ष पर दिखाया गया है रहे हैं. HEK कोशिकाओं एक मिलान टैग transmembrane प्रोटीन व्यक्त करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट हैं. इधर, immunofluorescent धुंधला ट्रांसफ़ेक्ट प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता हैकोशिकाओं (हरा). अगला, आईएनएस-1 कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं. इंसुलिन के लिए Immunofluorescent धुंधला cocultured आईएनएस-1 कोशिकाओं (लाल) के दृश्य की अनुमति देने के लिए किया गया था.
चित्रा 2. Coculturing आईएनएस -1 neuroligin प्रोटीन वेरिएंट नाथन एक्स या नाथन वाई (भरा में, काले स्तंभों). नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं को व्यक्त करने ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं के साथ बीटा कोशिकाओं से प्राप्त परिणाम के रूप में नहीं करने के लिए तो बदल ही प्लाज्मिड निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया एक्सप्रेस प्रोटीन (सफेद स्तंभों). (20 मिमी) कम (2.5 एनएम) और उच्च ग्लूकोज की शर्तों के तहत और भी IBMX साथ साथ उच्च ग्लूकोज से उत्तेजना के बाद cocultured आईएनएस-1 कोशिकाओं से एक, इंसुलिन स्राव. बी, आईएनएस -1 सेल इंसुलिन सामग्री नाथन वाई व्यक्त HEK293 कोशिकाओं के साथ coculture के बाद. सी, analysनाथन वाई के साथ या नियंत्रण ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं के साथ ट्रांसफ़ेक्ट या तो HEK293 कोशिकाओं के साथ cocultured आईएनएस-1 कोशिकाओं से अलग शाही सेना का उपयोग RT-qPCR द्वारा इंसुलिन और PDX-1 प्रतिलेख के स्तर की है. (*, पी 0.05 <; **, पी 0.01 <; ***, पी <0.001).
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Discussion
यहाँ वर्णित coculture विधि विशिष्ट बीटा सेल सतह, transmembrane प्रोटीन के शारीरिक महत्व को निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है, और विशेष रूप से उनके कोशिकी डोमेन की. कोशिका की सतह पर ब्याज की एक प्रोटीन प्रदर्शित HEK293 कोशिकाओं के संपर्क में संवर्धन बीटा कोशिकाओं या insulinoma कोशिकाओं (जैसे यहां कार्यरत आईएनएस-1 कोशिकाओं के रूप में) से, प्रयोगों सीधे परेशान बिना बाह्य प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए तैयार किया जा सकता है कोशिकाओं के intracellular परिवेश. ब्याज की प्रोटीन HEK293 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन के intracellular डोमेन द्वारा मध्यस्थता हो सकता है कि β सेल समारोह पर कोई प्रभाव अनुपस्थित हो जाएगा और इसलिए कोशिकी बातचीत के प्रभाव का विश्लेषण को मुश्किल नहीं होगा.
इंसुलिन स्राव पर प्रभाव तत्काल HEK293 कोशिकाओं के साथ cocultured बीटा कोशिकाओं से स्राव की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता हैनियंत्रण HEK293 कोशिकाओं के संपर्क में cocultured बीटा कोशिकाओं से स्राव के लिए ब्याज की एक प्रोटीन व्यक्त. नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं नकली ट्रांसफ़ेक्ट हो या, वैकल्पिक रूप से, ब्याज की प्रोटीन की एक गैर कार्यात्मक संस्करण का निर्माण करने के लिए उत्परिवर्तित निर्माण प्रयोगात्मक प्लाज्मिड का एक संस्करण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर सकते हैं. हमारे हाथ में, नियंत्रण के दोनों प्रकार के समान परिणाम सामने आए. HEK293 कोशिका की सतह स्वाभाविक प्रोटीन के एक महान विविधता शामिल है के बाद से, नियंत्रण के किसी भी प्रकार ब्याज की प्रोटीन सहित कई अलग अलग सेल सतह अणुओं के संपर्क में बीटा कोशिकाओं के समारोह के संपर्क में बीटा कोशिकाओं के समारोह की तुलना करने की अनुमति देता ब्याज (या ब्याज की प्रोटीन का एक उत्परिवर्तित संस्करण सहित) के प्रोटीन के अपवाद के साथ कोशिका की सतह अणुओं के एक ही सेट के साथ.
आईएनएस-1 कोशिकाओं (या अन्य बीटा कोशिकाओं) अन्य आईएनएस -1 सेल से आईएनएस-1 कोशिकाओं का कम या कोई संपर्क नहीं है कि इतनी कम घनत्व पर HEK293 परतों को जोड़ रहे हैंरास. यह एक ही प्रोटीन को शामिल transcellular बातचीत के कारण संभावित पृष्ठभूमि शोर के अभाव में मनाया जा आईएनएस -1 कोशिका की सतह पर HEK293 कोशिका की सतह और प्रोटीन पर व्यक्त ब्याज की प्रोटीन के बीच transcellular बातचीत के प्रभाव आईएनएस पर endogenously व्यक्त की अनुमति देता है -1 कोशिका की सतह.
अभिकर्मक के बाद, HEK293 सेल परत धीरे से तय किया जा सकता है. यह वैकल्पिक निर्धारण कई coculture प्लेटें एक बाद की तारीख में बीटा कोशिकाओं के बाद इसके लिए एक ही बार में तैयार रहने की अनुमति देने के लिए उपयोग किया जा सकता है. HEK293 चयापचय या स्रावी समारोह किसी भी तरह बीटा सेल समारोह के विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करेगा चिंता है कि अगर वहाँ थे HEK293 कोशिकाओं फिक्सिंग भी फायदेमंद होगा. अन्त में, निर्धारण प्रोटोकॉल लम्बी coculture प्रयोगों की सुविधा के लिए नियोजित किया जा सकता है. यहाँ, निश्चित HEK293 कोशिकाओं का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि बीटा कोशिकाओं के लिए इष्टतम संस्कृति के माध्यम से नहीं बल्कि एक का उपयोग करने से नियोजित किया जा सकता हैमिश्रित मीडिया (जैसे कदम 3.3 देखें) एक साथ cocultured HEK293 और बीटा कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए आवश्यक. लंबे समय तक coculture प्रयोगों में, या तो सेल में टाइप कर सकते हैं बीटा सेल व्यवहार्यता ख़राब लिए मीडिया जो इष्टतम नहीं है मिश्रित का उपयोग करें.
वे अभिकर्मक को अत्यधिक उत्तरदायी हैं क्योंकि HEK293 कोशिकाओं यहां कार्यरत हैं: वे अलग अभिकर्मक अभिकर्मकों 18,19 की एक किस्म का उपयोग उच्च दक्षता के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. नियमित तौर पर इसी तरह की तंत्रिका coculture प्रणालियों 5 में नियोजित कर रहे हैं कि - HEK293 प्रकार के साथ भं.नि. कोशिकाओं के साथ दो सेल में से एक है. 2000 Lipofectamine बहुत सामान्य प्रकाशित अध्ययन 18-20 में अधिक से अधिक से अधिक 95% की HEK293 कोशिकाओं और नियमित रूप से प्राप्त करने के अभिकर्मक क्षमता (कोशिकाओं का प्रतिशत ट्रांसफ़ेक्ट) के साथ इस्तेमाल एक सिद्ध अभिकर्मक अभिकर्मक है. अन्य अभिकर्मकों अभिकर्मक 19,20 के समान क्षमता हासिल कर सकते हैं. हमारे neuroligin -2 प्लाज्मिड निर्माण के साथ, अभिकर्मक दक्षता आम तौर पर ~ 80% है. ऑल्टHough हम ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव की पढ़ाई पर यहाँ ध्यान केंद्रित, विश्लेषण के अन्य साधनों FACS, immunohistochemistry, पश्चिमी सोख्ता और / या, के रूप में चित्रा -2, qPCR में देखा द्वारा उदाहरण के लिए, संभव हो रहे हैं.
विशेष रूप से बाह्य प्रोटीन बातचीत के समारोह को उजागर करने में एक बहुत ही उपयोगी उपकरण होने के बावजूद, विधि अपनी सीमाओं के बिना नहीं है यहाँ का वर्णन किया. बीटा कोशिकाओं HEK293 सेल परत के साथ सीधे संपर्क में रहने की जरूरत है, क्योंकि ऐसा आईएनएस-1 कोशिकाओं के रूप में insulinoma सेल लाइनों विशेष रूप से इस coculture प्रणाली 4 के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं. प्राथमिक आइलेट कोशिकाओं के लिए परिणाम अनुवाद अलग islets के फैलाव की आवश्यकता है. आइलेट संरचना ही उचित संकेत और ग्लूकोज के जवाब का अभिन्न अंग है, प्रेरित इंसुलिन प्रतिक्रिया बरकरार टापू 1,3,17 के सापेक्ष छितरी प्राथमिक बीटा कोशिकाओं में पा लिया है. इसके अलावा, क्योंकि क्षणिक अभिकर्मक वीं की वर्दी अभिव्यक्ति में परिणाम नहीं करता इमेजिंग आधारित (immunohistochemical) प्रयोगों प्रदर्शन जब HEK लॉन में ई प्रोटीन, प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्य करने के लिए एक विधि के परिणामों की व्याख्या करने के लिए आवश्यक हो सकता है. Cocultured आईएनएस-1 कोशिकाओं की स्रावी तंत्र पर ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस गैर वर्दी अभिव्यक्ति का लाभ लेता है कि एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण Suckow एट अल., 2012 10 में 3 चित्र में दिखाया गया है.
यह ब्याज की प्रोटीन व्यक्त किसी भी बीटा सेल और पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच संपर्क की हद बीटा कोशिकाओं कोशिकाओं द्वारा सभी पक्षों पर घिरा हुआ जा सकता है, जिसमें इन विवो में बरकरार टापू की तुलना में इस प्रणाली में कम होने की संभावना है कि यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए प्रोटीन व्यक्त. प्रासंगिक transcellular बातचीत किसी भी तरह देशी टापू से सफाया कर रहे थे, तो यह अपेक्षाकृत कम सेल करने वाली सेल संपर्क इंसुलिन के स्राव में परिवर्तन मनाया जाएगा क्या नीचे तक की भयावहता को कम कर सकता है.
e_content "बल्कि क्षणिक अभिकर्मक से स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं का एक प्रतिरूप आबादी का> उपयोग अधिक समान अभिव्यक्ति में परिणाम और संभवतः प्रयोगात्मक सेट अप को आसान बनाने, लेकिन उत्पन्न करने स्थिरतापूर्वक के आदेश में काफी अधिक ऊपर सामने समय और प्रयास की आवश्यकता होगी कोशिकाओं को व्यक्त. भविष्य के अध्ययन करेंगे HEK293 सेल परत में दो या दो से अधिक transmembrane प्रोटीन transfecting द्वारा, संभव synergistic प्रभाव देखा जा सकता है, तय है कि.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य अनुदान R01DK080971 और किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन अनुदान 37-2009-44 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. हम UCSD बाल चिकित्सा मधुमेह अनुसंधान केंद्र (PDRC) से प्राप्त समर्थन की सराहना करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
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