Summary
経細胞タンパク質相互作用は、膵臓β-細胞機能の重要な決定因子である。法適応特定貫通タンパク質がインスリン分泌にどのように影響するかを調査するためのシナプス-の共培養モデルからは、ここで詳しく説明します。トランスフェクトしたHEK293細胞は、目的のタンパク質を発現し、β細胞は、トランスフェクションまたは他の方法で直接摂動する必要はありません。
Abstract
細胞表面タンパク質間の相互作用は隣接セルの機能を調整するのに役立ちます。膵臓β細胞を膵島内にクラスタ化し、グルコース恒常性を維持するために調整された様式で作用している。これは、隣接したβ細胞表面の膜貫通タンパク質間の相互作用は、β細胞機能の重要な決定要因であることがますます明らかになりつつある。
培養β細胞またはin vivoでノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現の研究により、特定の経細胞相互作用の役割の解明は、潜在的影響の分析を混乱させることができる方法でβ-細胞の健康及び/又は機能に影響を与え、mRNAおよびタンパク質の発現の直接的な摂動を必要とする具体的な相互作用の。これらはまた、標的蛋白質の細胞内ドメインのレベルを変更し、DISであることが同じ細胞膜内のタンパク質間の相互作用による影響を防ぐことが近づく経細胞の相互作用の影響からtinguished。
ここでβ細胞のインスリン分泌能力と応答上の特定の経細胞相互作用の効果を決定するための方法が提示される。この方法は、例えば、INS-1細胞などのベータ細胞株、および解離プライマリβ細胞にも適用可能である。それはシナプス形成を駆動するための重要なタンパク質を同定したHEK293（またはCOS）細胞層に発現して、特定の神経細胞のタンパク質への培養神経細胞のその露出を発見した神経生物学者が開発した共培養モデルに基づいています。神経シナプスのとβ細胞の分泌機構との間に類似点を考えると、我々はβ細胞機能の成熟は、同様の経細胞の相互作用によって駆動されるかもしれないと考えた。我々は、β細胞は、目的のタンパク質を発現するHEK293細胞層上で培養されたシステムを開発した。このモデルでは、β-細胞の細胞質は、細胞外タンパク質interactioながらそのままですNSは、操作されます。我々は、主にグルコース刺激性インスリン分泌の研究に焦点を当てているが、ここで、他のプロセスを解析することができ、例えば、遺伝子発現の変化は、免疫ブロット法または定量PCRによって決定される。
Introduction
ここでは、特定の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、インスリン分泌をどのように影響するかの調査を容易にする方法が記載されている。膵臓β-細胞表面上のタンパク質（あるいは他の分子）と目的のタンパク質との相互作用の影響方法プローブ。この方法は、ベータ細胞または他の隣接セル（ 例えば、内皮細胞、神経細胞、膵臓α細胞）によって発現細胞表面タンパク質は、細胞間の相互作用（ すなわち、隣接する表面上の相互作用パートナーとの相互作用を介し介しβ細胞機能にどのように影響するかの調査を可能にするβ細胞）。
細胞の形質膜は、細胞外環境へのブリッジとしての構造的および機能的タンパク質の複雑な配列が含まれています。経接続の形成によりまたはプラスチックシグナル伝達事象を開始することにより、細胞表面タンパク質間の相互作用は、コーディネートすることができ隣接セルの機能を有する。膵臓β細胞を膵島内にクラスタ化し、グルコース恒常性を維持するために、1協調して作用している。細胞外EPHA-ephrinAおよびグルコース刺激性インスリン分泌の調節におけるニューロリギン-2相互作用の重要性によって、例えば、明らかにし、それがますます明らかになってきている隣接表面にタンパク質との間に発生する相互作用の増大した細胞外知識ベータ細胞がインスリン分泌、β細胞機能の成熟と1-3グルコース恒常性の維持の完全な理解を得るための非常に重要になります。ここに記載された方法の目的は、特定の膜貫通または他の細胞表面結合タンパク質を含む経細胞相互作用のβ細胞機能への影響の調査を可能にすることである。異なる発現構築物でトランスフェクトしたHEK293細胞との共培養β細胞、Bの効果によって異なる細胞表面タンパク質または変異した変異体のイータ細胞機能としては、効率的に探査することができる。これは、β細胞自体をトランスフェクトすることなく達成される。
培養β細胞またはin vivoでノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現の研究により、特定の経細胞相互作用の役割の解明は、潜在的の分析を混乱させることができる方法でβ細胞の健康及び/又は機能に影響を与え、β-細胞のmRNAおよびタンパク質の発現の直接的な摂動を必要とする特定の細胞外相互作用の効果。これらはまた、標的蛋白質の細胞内ドメインのレベルを変更し、さらに、経細胞間相互作用の影響を区別する上で、同じ細胞内のタンパク質間の相互作用による影響を許可しない近づく。ここでは、β細胞のインスリン分泌能力と応答上の特定の経細胞相互作用の効果を決定するための方法は、descrをあるアイベッド。この方法は、例えば、INS-1細胞4とインスリン分泌β-細胞株、および解離プライマリげっ歯類またはヒトβ細胞にも適用可能である。なお、HEK293（またはCOS）細胞層に発現して、特定の神経細胞のタンパク質に培養ニューロンの露出がドライブシナプス形成5,6というタンパク質を同定することができるが見つかりました神経生物学者、によって開発された共培養モデルに基づいています。神経シナプスのとβ細胞の分泌機構との間に類似点を考えると、我々は、β細胞機能を推論し、機能的成熟は、同様の経細胞の相互作用7-9によって駆動されることがあります。これらの相互作用を調査するために、我々は、β細胞が関心10のタンパク質を発現するHEK293細胞の層上に共培養された本明細書に記載のシステムを開発した。このシステムは、細胞外タンパク質 - タンパク質相互作用を操作しながらベータ細胞質をそのまま維持することができる。
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Protocol
1。 HEK293レイヤーのトランスフェクション
- DMEM 500mlのボトル（4.5グラム/ mlのグルコースとフェノールレッドとし、グルタミンなし）に追加することによりHEK293細胞培地を準備：50ミリリットルFBS、5ミリリットル100Xペニシリン/ストレプトマイシン溶液、5ml 100倍のL-グルタミン溶液と500μlのアムホテリシンをB.
- ウェル当たりHEK293 0.5mlのメディアを用いて24ウェルプレートでHEK293細胞外板。細胞がプレートの底に均等に分散されていることを確認。
- ときHEK293細胞は、プラスミドの0.8μgのは、目的のタンパク質（哺乳動物発現ベクターに挿入）とリポフェクタミンプロトコールに従ってリポフェクタミン2000年2μlのコーディングとトランスフェ密集度100％に達する。我々は、哺乳動物細胞での発現のために設計されたpcDNA 3.3バックボーンを使用することを選択した。
- オプションとして、インキュベーションの6時間後、正常HEK293メディアとリポフェクタミンプロトコールに記載のトランスフェクションのメディアを交換します。
- トランスフェproteの発現を評価するために、に、トランスフェクトされた組織培養ウェルのサブセットは、発現タンパク質の免疫検出のために、または標準的な技術を用いてタンパク質発現のウェスタンブロット分析のために使用することができる。
2。 HEK293細胞の任意の固定はトランスフェタンパク質を発現
トランスフェクトしたHEK293細胞を穏やかに（また、ディスカッションを参照）HEK293細胞（ 例えば下記ステップ3.9）生きているか、またはすべてを一度にいくつかの実験のためのプレートの前に効率的な準備を可能にするために有害かもしれないメディアで共培養を容易にするために固定することができる。
- HEK293細胞におけるタンパク質の発現の経時変化を決定するために、パイロット研究を行う。
- HEK293細胞層をトランスフェクションした後、発現の最高レベルに関連付けられているトランスフェクション後の時点で細胞から培地を吸引除去。これが最初の24時間以内に発生した場合、トランスフェクション後24時間までは吸引しないでください。
- HEを洗うD-PBSで軽くK293細胞は、次いで、500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を加え、室温で30分間インキュベートする。 （4％PFAのソリューションを作成するには、1×PBSで16％溶液を用いて開始し、1X PBSで1:4希釈してください。）
- 滅菌PBSを使用して、静かに4℃でPBS O / Nで細胞を3回とインキュベートを洗う
- 細胞を滅菌PBSで3回洗浄し、PBSを追加し、4のまま°Cを必要になるまで（最大記憶時間が発現されたタンパク質によって異なる場合があります私たちは、観察された効果を大幅に変更することなく、2週間までのニューロリギンアイソフォームを発現するようにトランスフェクトしたHEK293細胞を保存するインスリン分泌に）。
3。 HEK293細胞を用いたINS-1ベータ細胞の共培養
- 50ミリリットルFBS、5ミリリットル100Xペニシリン/ストレプトマイシン、5ミリリットル100X L-グルタミン溶液、5mlのピルビン酸ナトリウム、500μlのアンホテリシン：500ミリリットルRPMI 1640（グルコースおよびフェノール赤とグルタミンなし）に追加することにより、INS-1メディアの準備B、500μlのβ-メルカプトエタノール（これはメディとほぼ同じですええと、通常のβ-メルカプトエタノールの添加）を除いて主要な膵島培養に用いる。
- 収穫T75培養フラスコの底から約70〜80％コンフルエントでINS-1細胞、細胞ストリッパー（または別の非酵素的細胞の除去）を使用。各フラスコには、48の井戸のためにおよそ十分な細胞を提供する。
- INS-1およびHEKメディアの50/50ミックスで再懸1,200 rpmで3分間、遠心で細胞をスピンダウンした後。 INS-1細胞の70〜80％コンフルエントなフラスコは、ミクストメディア約25mlに懸濁します。
- むしろ生きたHEK293細胞よりもホルムアルデヒドで固定されたHEK293細胞を用いた場合、100％ではなく、混合メディアよりINS-1のメディアでINS-1細胞を再懸濁します。
- を10mlのピペットを用いて、均質な細胞懸濁液を作るためにペレットから細胞を取り除く。
- HEK293細胞にメディアを取り出すように吸引。
- P1000のピペットを用いて、穏やかoが側面に沿ってHEK細胞層上にINS-1細胞懸濁液500μLを加えるfをよく。毎年6井戸の後、均質細胞懸濁液を確保するために、再びINS-1細胞を再懸濁し、10ミリリットルピペットを使用しています。共培養のセットアップの全体的なスキームを図1に示されている。
- 実験プロトコルに応じて24〜48時間、細胞をインキュベート。
- 以上48時間共培養期間が必要な場合は、HEK293細胞を固定するために、上記のセクション2のオプションのステップを使用しています。
- プライマリー解離げっ歯類やヒト膵島 を使用している場合は、5ミリリットルペン/連鎖球菌、5ミリリットルL-供給過剰となRPMIとしてその適切なメディアを確実に0.5ミリリットルアンホテリシン-Bの代わりに使用されている[ 例えば、Joveの11-15で前のプロトコルを参照してください。] INS-1メディア。 1が原因で潜在的に必要とされる島の多数の実施においては、24ウェルプレートに解離膵島細胞を使用することができますが、それは配慮が48ウェルプレート（ウェルあたり少ない膵島細胞を必要とする）にスケーリングまで与えられることをお勧めします。 48ウェルプレートに、解離の価値は約100の小島を追加開始するためのプレート当たりテッド細胞。解離の効果、使用方法に応じて、より少ない膵島が必要とされてもよい。
4。グルコース刺激インスリン分泌
- 1時間の最低KRBで2.5 mMグルコース（クレブス - リンゲル重炭酸塩緩衝液）250μlの中の細胞をPreincubate。 、preincubate共存培地を除去し、直ちにKRBと交換する。この交換は、環境酸素にINS-1細胞の曝露を最小限にするために一度に1つのウェルを行う必要があります。お互いに低い（2.5 mM）をグルコースKRBピペッティングしながら片手で吸引。
- 2.5mMのか一度よくKRBバッファー1で20 mMグルコースどちら250μlのに為替プレインキュベーションKRB。
- 具体的な実験のために適切であれば、例えば100μMのIBMXなどの追加分泌は、より堅牢な刺激性インスリン分泌応答を生成するために添加してもよい。具体的には解離した一次膵島β細胞が増加したグルコース濃度のALONに乏しい応答するeはので、ここでIBMXまたは他の分泌促進物質の添加は、特に16,17考慮すべきである。
- インキュベーションの1時間後、メディアはチューブを微量、5分間1500×gでのスピンに移す。
- 上清200μlのを削除し、インスリンRIAやELISAによる分析のためにこれを使用しています。
- 細胞溶解物を調製するには、プロテアーゼ阻害剤とのRIPAの細胞溶解緩衝液（150mMのNaCl、1.0％IGEPALCA-630またはノニデットP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、50mMトリス、pH8.0）を100μlのを追加すぐに4でメディアとインキュベートを除去した後プレート℃で20分間。
- 10,000 xgで15分間ライセートをスピンダウンし、インスリンRIAやELISAによる分析のために上清50μlのを削除します。
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Representative Results
メソッドを使用してここで説明する、私たちは、インスリン分泌にプロテインニューロリギンの異なる亜種の効果をテストしました。これは、β細胞機能10上ニューロリギン-2の効果を調査我々の公開されて仕事を補完する。 図2は、例えば、ここで呼ばれるニューロリギンアイソフォームを発現するようトランスフェクトHEK293細胞と共培養するINS-1ベータ細胞から得られた結果を示すNL- X.この実験は、NL-Xは、インスリン分泌を増加させることを経細胞間相互作用に従事しているという仮説をテストするために設計されました。 図2Aにおいては、NL-Xの発現が増加し、基礎共培養INS-1細胞によるインスリン分泌を刺激していることが分かる。 HEK293細胞をトランスフェクトのアプローチは、彼らはNL-Xを表現することを、私たちは、それが細胞外ドメイン-共培養INS-1細胞 - そのもたらすと接触することができるため、HEK293細胞表面上に表示された領域であるとであることを知ることができますobseについて分泌rved増加。 NL-X細胞外ドメインは、INS-1細胞は、より多くのインスリンを分泌させるためにINS-1細胞表面上の別のタンパク質（または、おそらくいくつかの他の分子）と対話しなければならない。必要に応じて、分泌されたインスリンは、細胞を溶解した後に測定可能な携帯インスリン含量のパーセントとして表現できる。
図2Bおよび2Cに、共培養系を用いて分析を他のタイプの結果が示されている：すなわち、ニューロリギン変異体NL-Yを含む経細胞の相互作用の効果の解析、細胞インスリン含量オンとPDX-1とインスリンmRNAレベル。 NL-Yは、共培養INS-1細胞（ 図2B）のインスリン含量を増加させた。さらに試験は、これがセルまたは増加したINS-1細胞増殖に起因当たりのインスリン量の増加によるものかどうかを決定する必要がある。 図2Cに、RNAを細胞から回収した層およびRT-定量PCRにより分析した。 HEK293細胞はHEK293とINS-1細胞の両方に存在する可能性転写産物のために、ヒト起源であるので、INS-1起源のそのmRNAのみを保証ラット特異的PCRプライマー（INS-1細胞は、ラット由来のもの）の使用測定される。ここでは、NL-Yとの共培養は、インスリンとPDX-1 mRNAレベル（正規化18S RNAであった）が増加することが分かる。このRT-定量PCR分析に用いたプライマーおよび方法は、以前10、オンラインサプリメントを説明した。
図1。共培養セットアップ。 HEK293（HEK）細胞を24ウェル組織培養プレートに添加し、その後、トランスフェクトされる。代表HEK293細胞層の明視野像が右、上に示されている。 HEK細胞は、エピトープタグ貫通タンパク質を発現するようトランスフェクトされる。ここでは、免疫蛍光染色は、トランスフェクトさを明らかにするために使用される細胞（緑色）。次に、INS-1細胞を添加する。インスリン免疫蛍光染色を共培養INS-1細胞（赤）の可視化を可能にするために実施した。
図2。共培養のINS-1ニューロリギンタンパク質変異体NL-XまたはNL-Y（充填イン、黒色カラム）。制御HEK293細胞を発現するようトランスフェクトHEK293細胞とβ細胞から得られた結果ないようにように変更同じプラスミド構築物でトランスフェクトした急行タンパク質（白い柱）。（20 mM）を低く（2.5 nM）を、高グルコース条件下でもIBMXとともに高グルコースによる刺激後の共培養INS-1細胞による、インスリン分泌。B、INS-1細胞のインスリン含量NL-Yを発現するHEK293細胞と共培養した後。C、analysNL-YとまたはコントロールトランスフェクトしたHEK293細胞を用いたトランスフェクションのどちらHEK293細胞と共培養INS-1細胞から単離されたRNAを用いてRT-定量PCRによるインスリンとPDX-1転写レベルである。 （*、P <0.05; ** P <0.01、*** P <0.001）。
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Discussion
共培養方法は、β-細胞表面の特異的膜貫通タンパク質の、特にその細胞外ドメインの生理学的重要性を決定するために効果的な方法を提供ここで説明する。細胞表面上の関心のあるタンパク質を表示するHEK293細胞と接触で培養β細胞又はインスリノーマ細胞（例えば、ここで用いINS-1細胞など）により、実験を直接妨げることなく、細胞外タンパク質 - タンパク質相互作用の効果を決定するように設計することができる細胞の細胞内環境。興味のあるタンパク質がHEK293細胞によって発現されているため、トランスフェクションされた蛋白質の細胞内ドメインによって媒介される可能性があり、β細胞機能への影響は不在となり、したがって、細胞外相互作用の影響の解析を複雑にしないだろう。
インスリン分泌への影響を容易にHEK293細胞と共培養β細胞からの分泌を比較することによって決定することができる制御HEK293細胞と接触して共培養β細胞から分泌目的のタンパク質を発現する。制御HEK293細胞は、モックトランスフェクト又は、代替的に、目的のタンパク質の非機能的変異体を生成するために変異させた実験プラスミド構築物の変異体でトランスフェクトすることができる。我々の手では、コントロールの両方の種類が同一の結果が得られている。 HEK293細胞表面は本質的にタンパク質の多種多様を含んでいるので、制御のいずれかのタイプは、目的のタンパク質を含む多くの異なる細胞表面分子と接触するβ細胞の機能は、接触におけるβ細胞の機能と比較することができ目的のタンパク質（または目的のタンパク質の突然変異型を含む）を除いて、細胞表面分子の同じセットを持つ。
そこに最小限でないか、または他のINS-1 CELとINS-1細胞の非接触ようINS-1細胞（または他のβ細胞）を低密度でHEK293層に追加されますLS。これは、同じタンパク質を含む細胞間相互作用に起因する潜在的なバックグラウンドノイズの非存在下で観察されるようにINS-1細胞表面にHEK293細胞表面上に発現及びタンパク質目的のタンパク質間の相互作用を経細胞の影響がINSに内因的に発現可能にする-1細胞表面。
トランスフェクション後、HEK293細胞層は優しく固定することができる。このオプションの固定は、複数の共培養プレートは後日β細胞のその後の添加のために一度に製造することができるようにするために利用することができる。 HEK293代謝や分泌機能がどうにかベータ細胞機能の解析を妨げるという懸念があった場合HEK293細胞を固定することも有益であろう。最後に、固定プロトコルが長期の共培養実験を容易にするために使用することができる。ここでは、固定されたHEK293細胞を使用する主な利点は、β細胞のための最適培養培地を使用するのではなく、使用することができるということであるミクストメディア（ 例えばステップ3.3を参照）を同時に共培養HEK293とベータ細胞を維持するために必要。長引く共培養実験では、混合メディア細胞のどちらかに最適化されていませんの使用ベータ細胞の生存を損なうタイプは、することができます。
それらは、トランスフェクションに非常に適しているため、HEK293細胞を、ここに使用される。これらは、異なるトランスフェクション試薬18,19のさまざまな方法を使って高効率でトランスフェクトすることができる。日常的に同様の神経共存システム5で用いられる- HEK293は、2つの細胞型に沿ったCOS-細胞との一つである。リポフェクタミン2000は、実績のあるトランスフェクション試薬非常に一般的にHEK293細胞を用いて使用され、定期的に発表された研究18-20で95％以上のトランスフェクション効率（トランスフェクトされた細胞のパーセント）を達成することである。その他の試薬 は、トランスフェクション19,20の同様の効率を達成することができます。我々のニューロリギン-2プラスミド構築物でトランスフェクション効率は一般〜80％である。 Altキーハフ我々はグルコース刺激インスリン分泌の研究にここに焦点を当て、分析の他のモードでは、ウエスタンブロット法、及び/又は、 図2C、定量PCRに見られるように、FACS、免疫組織化学によって例えば、可能です。
特定の細胞外タンパク質相互作用の機能を明らかにするうえで非常に有用なツールであることにもかかわらず、ここで説明した方法には限界がないわけではありません。ベータ細胞は、HEK293細胞層と直接接触する必要があるので、そのようなINS-1細胞などのインスリノーマ細胞系は、特に、この共培養系4に適している。プライマリー膵島細胞に結果を翻訳する孤立島の分散を必要とします。膵島構造自体は、適切なシグナリングおよびグルコースに対する応答に不可欠であるので、刺激性インスリン応答が無傷膵島1,3,17に対して分散された一次β細胞において平滑化される。さらに、ため、一過性トランスフェクションは、番目の均一な表現にはなりません撮像系（免疫組織化学）実験を行うHEK芝生を横切る電子タンパク質、タンパク質発現レベルを正常化する方法は、結果を解釈するために必要とされてもよい。共培養INS-1細胞の分泌機構にトランスフェクトされたタンパク質の効果を分析するために、この不均一な発現を活用して実験的なアプローチはSuckow ら 、2012年10において、図3に示されている。
なお、β細胞が細胞によって四方を囲まれている可能性のある、目的のタンパク質を発現する任意のβ細胞と隣接セルとの間の接触の程度は、in vivoで無傷の膵島よりもこのシステムでは少なくなる可能性があることにも留意すべきであるタンパク質を発現する。この比較的小さく細胞 - 細胞接触は、関連経相互作用が何らかの形で天然の膵島から除外された場合に観察されるものを以下にインスリン分泌の変化の大きさを減らすことができる。
e_content "安定的にトランスフェクトしたHEK293細胞のクローン集団ではなく、一過性トランスフェクションの>を使用し、より均一な表現になり、おそらく実験のセットアップ簡素ですが、安定して、生成するために、実質的により多くのアップフロントの時間と労力を必要とするであろう発現細胞。今後の研究がされますHEK293細胞層に二つ以上の膜貫通タンパク質をトランスフェクションすることにより、可能な相乗効果を観察することができた、かどうかを決定します。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、健康助成R01DK080971と若年性糖尿病研究財団助成37-2009-44の国立研究所によってサポートされていました。また、UCSD小児糖尿病研究センター（PDRC）から受け取った支援に感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
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