Summary
Les interactions entre protéines transcellulaires sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta du pancréas. Détaillé ici est une méthode adaptée à partir d'un modèle de co-culture de synaptogénèse-pour étudier comment les protéines transmembranaires spécifiques influencent la sécrétion d'insuline. Cellules HEK293 transfectées expriment des protéines d'intérêt, les cellules bêta n'ont pas besoin d'être transfectées ou non directement perturbé.
Abstract
Les interactions entre les protéines de surface cellulaire aider à coordonner la fonction des cellules voisines. les cellules bêta du pancréas sont regroupés au sein des îlots pancréatiques et d'agir de manière coordonnée pour maintenir l'homéostasie du glucose. Il devient de plus en plus clair que les interactions entre protéines transmembranaires à la surface des cellules bêta adjacents sont des déterminants importants de la fonction des cellules bêta.
L'élucidation du rôle des interactions particulières transcellulaires par effet de choc, coup de grâce ou la surexpression des études dans les cellules bêta en culture ou in vivo nécessite perturbation directe de l'ARNm et l'expression des protéines, ce qui pourrait affecter la santé des cellules bêta et / ou la fonction d'une manière qui pourrait fausser les analyses des effets des interactions spécifiques. Ces approches modifient également les niveaux des domaines intracellulaires des protéines ciblées et peuvent prévenir les effets dus aux interactions entre protéines dans la même membrane cellulaire pour être affichéedistingué des effets des interactions transcellulaires.
Ici, un procédé pour déterminer l'effet des interactions spécifiques transcellulaires sur la capacité de sécréter de l'insuline et de la réactivité des cellules bêta est présenté. Cette méthode est applicable aux lignes des cellules bêta, comme les cellules INS-1, et pour les cellules bêta primaires dissociées. Il est basé sur des modèles développés par coculture neurobiologistes, qui ont trouvé que l'exposition des neurones en culture de protéines neuronales spécifiques exprimés sur HEK293 (ou COS) des couches de cellules protéines identifiées sont déterminantes pour stimuler la formation des synapses. Étant donné les parallèles entre les mécanismes de sécrétion des synapses neuronales et des cellules bêta, nous avons pensé que la maturation fonctionnelle des cellules bêta peut être entraînée par des interactions transcellulaires similaires. Nous avons développé un système où les cellules bêta sont cultivées sur une couche de cellules HEK293 exprimant une protéine d'intérêt. Dans ce modèle, le cytoplasme des cellules bêta est intact tandis extracellulaire INTERACTIONS de protéine-protéinens sont manipulés. Bien que nous nous concentrons ici principalement sur les études de glucose stimulée par la sécrétion d'insuline, d'autres procédés peuvent être analysés, par exemple, des changements dans l'expression des gènes tels que déterminés par immuno ou qPCR.
Introduction
Nous décrivons ici une méthode pour faciliter les enquêtes sur la façon dont les domaines extracellulaires de protéines transmembranaires spécifiques affectent la sécrétion d'insuline. La méthode des sondes les effets des interactions de la protéine d'intérêt avec des protéines (ou éventuellement d'autres molécules) sur la surface des cellules bêta pancréatiques. Le procédé permet des enquêtes de comment les protéines de surface cellulaire exprimée par des cellules bêta ou par d'autres cellules voisines (par exemple des cellules endothéliales, des neurones, des cellules alpha du pancréas) affectent la fonction des cellules bêta par des interactions transcellulaires (soit par des interactions avec des partenaires d'interaction sur la surface de côté cellules bêta).
La membrane de plasma cellulaire contient un ensemble complexe de protéines structurales et fonctionnelles servant de ponts pour le milieu extracellulaire. Par la formation de connexions transcellulaires ou par l'initiation des événements de signalisation en plastique, les interactions entre les protéines de surface cellulaire peuvent aider à coordonner l'la fonction des cellules voisines. les cellules bêta du pancréas sont regroupés dans les îlots pancréatiques et d'agir de manière coordonnée pour maintenir l'homéostasie du glucose 1. Comme l'a révélé, par exemple, par l'importance des extracellulaire EPHA-ephrinA et neuroligin-2 interactions dans la régulation du glucose stimulée par la sécrétion d'insuline, il devient de plus en plus clair que l'augmentation de la connaissance des interactions extracellulaires qui se produisent entre les protéines sur les surfaces de côté cellules bêta seront d'une grande importance pour acquérir une compréhension complète de la sécrétion d'insuline, les bêta maturation fonctionnelle des cellules et le maintien de l'homéostasie du glucose 1-3. Le but de la méthode décrite ici est de permettre à des enquêtes sur les effets sur la fonction des cellules bêta des interactions transcellulaires impliquant transmembranaire spécifique ou des protéines non-surface cellulaire associés. Par les cellules bêta co-culture avec des cellules HEK293 transfectées avec différentes constructions d'expression, les effets sur la bla fonction des cellules ETA de différentes protéines de surface cellulaire ou des variantes mutantes de celui-ci peut être sondé efficacement. Ceci est accompli sans avoir à transfecter les cellules bêta eux-mêmes.
L'élucidation du rôle des interactions particulières transcellulaires par effet de choc, coup de grâce ou la surexpression des études dans les cellules bêta en culture ou in vivo nécessite perturbation directe de l'ARNm des cellules bêta et l'expression des protéines, ce qui pourrait affecter la santé des cellules bêta et / ou la fonction d'une manière qui pourrait fausser l'analyse des les effets des interactions spécifiques extracellulaires. Ces approches également modifier les niveaux des domaines intracellulaires des protéines ciblées et, de plus, ne laissez pas les effets dus aux interactions entre protéines sur ou dans la même cellule à se distinguer des effets des interactions transcellulaires. Ici, un procédé pour déterminer l'effet des interactions spécifiques transcellulaires sur la capacité de sécréter de l'insuline et de la réactivité des cellules bêta est Described. Cette méthode est applicable aux lignes des cellules bêta qui sécrètent l'insuline, tels que les cellules INS-1, 4 et rongeurs primaire dissocié ou des cellules bêta humaines. Il est basé sur des modèles développés par coculture neurobiologistes, qui ont trouvé que l'exposition des neurones en culture à des protéines neuronales spécifiques exprimés sur HEK293 (ou COS) des couches de cellules pourrait identifier les protéines qui conduisent à la formation des synapses 5,6. Étant donné les parallèles entre les mécanismes de sécrétion des synapses neuronales et des cellules bêta, nous avons pensé que la fonction des cellules bêta et la maturation fonctionnelle pourraient être conduits par des interactions similaires transcellulaires 7-9. Afin de sonder ces interactions, nous avons développé le système décrit ici, dans lequel les cellules bêta sont co-cultivées sur une couche de cellules HEK293 exprimant une protéine d'intérêt 10. Ce système permet le cytoplasme des cellules bêta de rester intact pendant des interactions protéine-protéine extracellulaire sont manipulés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. La transfection de cellules HEK293 couche
- Préparer milieu cellulaire HEK293 en ajoutant à bouteilles de 500 mL de DMEM (avec 4,5 g / ml de glucose et rouge de phénol et sans glutamine): 50 ml de FBS, 5 ml 100X pénicilline / solution de streptomycine, 5 ml de solution de L-glutamine 100x et 500 amphotéricine ul B.
- Plate sur les cellules HEK293 dans une plaque de 24 puits en utilisant 0,5 ml de HEK293 médias par puits. S'assurer que les cellules sont réparties uniformément sur le fond de la plaque.
- Lorsque les cellules HEK293 atteindre 100% de confluence, transfect avec 0,8 ug de plasmide codant la protéine d'intérêt (inséré dans un vecteur d'expression mammalien) et 2 ul de Lipofectamine 2000, selon le protocole Lipofectamine. Nous avons choisi d'utiliser le pcDNA 3.3 épine dorsale conçu pour l'expression dans les cellules de mammifères.
- Eventuellement, après 6 heures d'incubation, échange les médias de transfection décrit dans le protocole Lipofectamine avec HEK293 médias normales.
- Pour évaluer l'expression de la prote transfectéesdans un sous-ensemble des puits de culture tissulaire transfectées peut être utilisé pour la détection par immunofluorescence de la protéine exprimée ou pour l'analyse par Western blot de l'expression de protéines en utilisant des techniques standard.
2. Fixation facultative de cellules HEK293 exprimant la protéine transfectées
Cellules HEK293 transfectées peuvent être fixés doucement afin de faciliter co-culture dans les médias susceptibles de nuire à la vie des cellules HEK293 (par exemple étape 3.9 ci-dessous) ou pour permettre la préparation efficace à l'avance des plaques de plusieurs expériences à la fois (voir également la discussion).
- Mener des études pilotes afin de déterminer l'évolution temporelle de l'expression de la protéine dans les cellules HEK293.
- Après transfection de la couche de cellules HEK293, aspirer le support à partir des cellules au point de temps après la transfection associé à plus haut niveau d'expression. Si cela se produit dans les 24 premières heures, ne pas aspirer jusqu'à 24 heures après transfection.
- Lavez HEK293 cellules doucement avec D-PBS puis ajouter 500 ul paraformaldéhyde 4% (PFA) et incuber à température ambiante pendant 30 min. (Pour faire une solution à 4% PFA, commencer avec une solution de 16% dans du PBS 1X et diluer à 1:4 avec du PBS 1X.)
- Utiliser PBS stérile, laver délicatement les cellules 3 fois et les incuber dans du PBS O / N à 4 ° C.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS stérile, puis ajouter PBS et laisser à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire (durée de stockage maximale peut varier en fonction de la protéine exprimée. Nous stockons des cellules HEK293 transfectées pour exprimer isoformes neuroligin pendant 2 semaines sans changements importants dans les effets observés sur la sécrétion d'insuline).
3. Co-culture de cellules INS-1 bêta avec cellules HEK293
- Préparer INS-1 média en ajoutant à 500 ml de milieu RPMI 1640 (avec le glucose et le rouge de phénol et sans glutamine): 50 ml de FBS, 5 ml 100X pénicilline / streptomycine, 5 ml de solution 100X L-glutamine, 5 ml de pyruvate de sodium, 500 amphotéricine pl B, 500 pl bêta-mercaptoéthanol (ce qui est presque identique à la médecineum généralement utilisé pour la culture des îlots primaire à l'exception de l'ajout de bêta-mercaptoéthanol).
- Utilisation de Cell-strip-teaseuse (ou un autre solvant de cellule non enzymatique), INS-1 récolte des cellules à environ 70-80% de confluence du fond d'un flacon de culture T75. Chaque flacon fournira suffisamment de cellules pour environ 48 puits.
- Après filer vers le bas des cellules dans la centrifugeuse pendant 3 min à 1200 rpm, remettre en suspension dans un mélange 50/50 de l'INS-1 et médias HEK. Pour un flacon confluent de 70-80% des cellules INS-1, remettre en suspension dans environ 25 ml de médias mixtes.
- Si vous utilisez des cellules HEK293 qui ont été fixés dans du paraformaldéhyde plutôt que des cellules vivantes HEK293, remettre en suspension les cellules INS-1 à 100% INS-1 médias plutôt que de techniques mixtes.
- En utilisant une pipette de 10 ml, de déloger des cellules de la pastille pour faire une suspension de cellules homogène.
- Aspirer à retirer le support sur les cellules HEK293.
- Avec une pipette P1000, ajouter délicatement 500 pl de suspension cellulaire INS-1 sur la couche de cellules HEK le long des côtés of le puits. Après tous les 6 puits, utiliser une pipette de 10 ml pour remettre à nouveau les cellules INS-1 pour assurer une suspension de cellules homogène. L'économie générale de la co-culture set-up est représenté dans la figure 1.
- Incuber les cellules pendant 24-48 heures selon le protocole expérimental.
- Si plus de 48 période de coculture h est nécessaire, utiliser des étapes facultatives de la section 2 ci-dessus pour fixer les cellules HEK293.
- Si vous utilisez rongeur dissocié primaire ou îlots humains [voir par exemple les protocoles antérieurs dans JoVE 11-15], veiller à ce que des médias appropriés, tels que RPMI avec stylo 5 ml / streptomycine, 5 ml L-Glut, 0,5 ml d'amphotéricine-B est utilisé à la place de INS-1 médias. Même si on peut utiliser des cellules d'îlots dissociées dans une plaque à 24 puits, dans la pratique, en raison du grand nombre d'îlots potentiellement nécessaires, il est recommandé que l'on envisage de mise à l'échelle vers le bas sur une plaque à 48 puits (nécessitant moins de cellules des îlots pancréatiques par puits). Sur une plaque à 48 puits, ajouter environ 100 îlots de dollars de dissociationted cellules par plaque pour commencer. Selon l'efficacité de la dissociation et la méthode utilisée, moins d'îlots peuvent être nécessaires.
4. Glucose sécrétion d'insuline stimulée
- Préincuber cellules dans 250 ul de 2,5 mM de glucose dans KRB (tampon bicarbonate de Krebs-Ringer) pour un minimum de 1 heure. Pour préincuber, éliminer le milieu de co-culture et remplacer immédiatement avec KRB. Cet échange devrait se faire un bien à la fois pour minimiser l'exposition des cellules INS-1 à l'oxygène de l'environnement. Aspirer avec une main pendant le pipetage le bas (2,5 mm) KRB de glucose avec l'autre.
- Bourse pré-incubation KRB à 250 pi de 2,5 mM ou 20 mM de glucose dans KRB tampon d'un bien à un moment.
- Le cas échéant, pour l'expérience spécifique, sécrétagogues supplémentaires telles que 100 um IBMX peuvent être ajoutés pour produire une réponse de sécrétion d'insuline stimulée plus robuste. Les cellules dissociées bêta des îlots pancréatiques primaires en particulier, sont mal répondre à l'augmentation des concentrations de glucose alone, alors voici surtout plus de IBMX ou autres sécrétagogues doit être considérée 16,17.
- Après 1 heure d'incubation, le milieu de transfert à Microfuge tubes et filent 1500 g pendant 5 min.
- Retirer 200 pi du surnageant et l'utiliser pour l'analyse par l'insuline RIA ou ELISA.
- Pour préparer lysat cellulaire, ajouter 100 ul de tampon de lyse cellulaire RIPA (NaCl 150 mM, 1,0% IGEPALCA-630 ou Nonidet P-40, 0,5% de désoxycholate de sodium, SDS 0,1%, Tris 50 mM, pH 8,0) avec les inhibiteurs de protéase pour le plaque immédiatement après avoir retiré les médias et incuber à 4 ° C pendant 20 min.
- Isoler lysat pendant 15 min à 10000 xg et éliminer 50 pi de surnageant pour analyse par l'insuline RIA ou ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En utilisant la méthode décrite ici, nous avons testé l'effet de différentes variantes de la neuroligin de protéines sur la sécrétion d'insuline. Cela complète notre travail publié étudier l'effet de neuroligin-2 sur la fonction des cellules bêta 10. Figure 2, par exemple, décrit les résultats obtenus à partir INS-1 co-culture de cellules bêta avec des cellules HEK293 transfectées pour exprimer un neuroligin isoforme appelée ici NL- X. Cette expérience a été conçue pour tester l'hypothèse selon laquelle NL-X à des interactions transcellulaires qui augmentent la sécrétion d'insuline. Dans la figure 2A, on peut voir que l'expression de NL-X a augmenté basal et stimulé la sécrétion d'insuline par les cellules INS-1 cocultivés. L'approche de la transfection de cellules HEK293 afin qu'ils expriment NL-X nous permet de savoir que c'est le domaine qui extracellulaire est la région affichée sur la surface des cellules HEK293 et donc en mesure d'entrer en contact avec cocultivées cellules INS-1-qui apporte sur le observed augmentation de la sécrétion. Le domaine extracellulaire NL-X doit être en interaction avec une autre protéine (ou éventuellement une autre molécule) sur la surface des cellules INS-1 pour amener les cellules INS-1 à sécréter plus d'insuline. Si vous le souhaitez, l'insuline sécrétée pourrait également être exprimé en pour cent de la teneur en insuline cellulaire, qui peut être mesurée après la lyse des cellules.
Dans les figures 2B et 2C, les résultats d'autres types d'analyses utilisant le système de co-culture sont représentées: en particulier, les analyses de l'effet des interactions transcellulaires impliquant neuroligin variante NL-Y sur le contenu de l'insuline cellulaire et le PDX-1 et les niveaux d'ARNm de l'insuline. NL-Y augmente la teneur en insuline des cellules INS-1 cocultivés (figure 2B). Des tests supplémentaires serait nécessaire pour déterminer si cela était dû à une augmentation de la quantité d'insuline par la cellule ou en raison d'une prolifération accrue des cellules INS-1. Dans la figure 2C, l'ARN a été récolté à partir de la cellulecouche et analysés par RT-qPCR. Puisque les cellules HEK293 sont d'origine humaine, les transcriptions qui pourraient être présents dans les deux cellules HEK293 et des INS-1, l'utilisation d'amorces PCR spécifique du rat (cellules INS-1 sont d'origine rat) assure que seul l'ARNm de l'INS-1 origine est mesurée. Ici, on peut voir que co-culture avec NL-Y augmenté insuline et PDX-1 niveaux d'ARNm (normalisation était à ARN 18S). Les amorces et la méthodologie utilisés pour cette analyse par RT-qPCR ont été décrits précédemment 10, supplément en ligne.
Figure 1. Coculture set-up. Cellules HEK293 (HEK) sont ajoutés à des plaques de culture tissulaire à 24 puits, puis transfectées. Une image lumineuse de champ d'une couche de cellules représentant HEK293 sont indiqués en haut, à droite. Les cellules HEK sont transfectées pour exprimer une protéine transmembranaire épitopique. Ici, immunofluorescence coloration est utilisée pour révéler la transfectéescellules (vert). Ensuite, les cellules INS-1 sont ajoutés. Immunofluorescence pour l'insuline a été réalisée pour permettre la visualisation des cellules INS-1 cocultivés (rouge).
Figure 2. Les résultats obtenus à partir de SIN-1 co-culture de cellules bêta avec des cellules HEK 293 transfectées pour exprimer les variants protéiques neuroligin NL-X ou NL-Y (rempli dans les colonnes noires). Contrôle des cellules HEK 293 ont été transfectées avec les mêmes constructions plasmidiques modifiés afin de ne pas expriment la protéine (colonnes blanches). A, la sécrétion d'insuline par les cellules co-culture INS-1 dans des conditions de faibles (2,5 nM) et élevée (20 mM), glucose et également après stimulation par l'hyperglycémie avec l'IBMX. B, SIN-1, la teneur en insuline des cellules après co-culture avec des cellules HEK293 exprimant NL-Y. C, analysest de l'insuline et les niveaux de transcription PDX-1 par RT-qPCR utilisant l'ARN isolés à partir de cellules INS-1 cocultivés avec des cellules HEK293 transfectées avec NL-Y ou avec des cellules transfectées contrôle HEK293. (*, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La méthode décrite ici co-culture est un moyen efficace pour déterminer l'importance physiologique de protéines beta-cell-surface, transmembranaires spécifiques, et en particulier de leurs domaines extracellulaires. Par les cellules bêta de culture ou de cellules d'insulinome (comme les cellules INS-1 utilisés ici) en contact avec les cellules HEK293 affichant une protéine d'intérêt sur la surface de la cellule, les expériences peuvent être conçues pour déterminer les effets des interactions protéine-protéine extracellulaire sans déranger directement le milieu intracellulaire des cellules. Étant donné que les protéines d'intérêt sont exprimés par les cellules HEK293, les effets sur la fonction β-cellulaire qui pourraient être médiés par les domaines intracellulaires des protéines transfectées seraient absents et ne seraient donc pas compliquer l'analyse des effets des interactions extracellulaires.
Effets sur la sécrétion d'insuline peuvent être facilement déterminées en comparant la sécrétion par les cellules bêta co-cultivées avec des cellules HEK293exprimer une protéine d'intérêt à la sécrétion par les cellules bêta co-cultivés en contact avec les cellules HEK293 commande. Les cellules HEK293 contrôle peuvent être faussement transfectées ou, en variante, transfectée avec une variante de l'expérimental construction plasmidique muté pour produire une variante non fonctionnelle de la protéine d'intérêt. Dans nos mains, les deux types de contrôles ont donné des résultats identiques. Depuis la surface des cellules HEK293 contient intrinsèquement une grande variété de protéines, soit le type de contrôle permet à la fonction des cellules bêta en contact avec de nombreuses molécules de surface cellulaire différents, y compris la protéine d'intérêt, à comparer à la fonction des cellules bêta en contact avec le même ensemble de molécules de surface cellulaire, à l'exception de la protéine d'intérêt (ou comprenant une version mutée de la protéine d'intérêt).
Cellules INS-1 (ou d'autres cellules bêta) sont ajoutés aux HEK293 couches à faible densité de sorte qu'il ya peu ou pas de contact des cellules INS-1 avec d'autres INS-1 cells. Ceci permet les effets des interactions transcellulaires entre la protéine d'intérêt exprimé à la surface et des protéines de cellules HEK293 sur la surface des cellules INS-1 d'être observée en l'absence d'un potentiel de bruit de fond provoqué par des interactions transcellulaires impliquant la même protéine exprimée de façon endogène sur le SIN surface de la cellule 1.
Après la transfection, la couche de cellules HEK293 peut être fixé en douceur. Cette fixation en option peut être utilisée pour permettre à plusieurs plaques de coculture de se préparer à la fois pour l'addition ultérieure de cellules bêta à une date ultérieure. Fixation des cellules HEK293 serait également avantageux si on craignait que HEK293 métabolisme ou de la fonction sécrétoire serait en quelque sorte interférer avec l'analyse de la fonction des cellules bêta. Enfin, le protocole de fixation peut être utilisé pour faciliter les expériences de coculture prolongées. Ici, le principal avantage de l'utilisation de cellules HEK293 fixes, c'est que le milieu de culture optimal pour les cellules bêta peut être utilisée plutôt que d'utiliser unmédias mixtes (par exemple, voir étape 3.3) nécessaires pour maintenir HEK293 cocultivés et les cellules bêta simultanément. Dans les expériences de coculture prolongées, l'utilisation du mixed media, qui n'est pas optimale pour chaque type de cellule peut nuire à la viabilité des cellules bêta.
Cellules HEK293 sont employés ici parce qu'ils sont prête très bien à la transfection: ils peuvent être transfectées avec un rendement élevé en utilisant une variété de différents réactifs de transfection 18,19. HEK293 est l'un des deux types de cellules-avec des cellules COS - qui sont couramment utilisés dans les systèmes de coculture neuronaux similaires 5. Lipofectamine 2000 est un réactif de transfection éprouvée très couramment utilisé par les cellules HEK293 et atteignant régulièrement l'efficacité de transfection (pour cent des cellules transfectées) de plus de 95% dans les études publiées 18-20. D'autres réactifs peuvent réaliser des efficacités similaires de transfection 19,20. Avec notre concept neuroligin-2 plasmide, l'efficacité de la transfection est généralement ~ 80%. AltHough nous nous concentrons ici sur les études de glucose stimulée par la sécrétion d'insuline, d'autres modes d'analyse sont possibles, par exemple par FACS, immunohistochimie, western blot et / ou, comme on le voit dans la figure 2C, qPCR.
En dépit d'être un outil très utile pour aider à découvrir la fonction de certaines interactions entre protéines extracellulaires, la méthode décrite ici n'est pas sans limites. Parce que les cellules bêta doivent être en contact direct avec la couche de cellules HEK293, les lignées cellulaires d'insulinome tels que les cellules INS-1 sont particulièrement bien adaptés à ce système de co-culture 4. Traduire les résultats de cellules des îlots pancréatiques primaires nécessite la dispersion des îlots isolés. Puisque la structure îlot lui-même fait partie intégrante de la signalisation et de réponse au glucose appropriée, la réponse à l'insuline stimulée est émoussée dans les cellules bêta primaires dispersés par rapport aux îlots intacts 1,3,17. En outre, parce que la transfection transitoire n'aboutit pas à l'expression uniforme de th e protéines à travers la pelouse HEK, lors de l'exécution des expériences d'imagerie à base de (immunohistochimie), une méthode pour normaliser les niveaux d'expression de protéines peut être nécessaire pour interpréter les résultats. Une approche expérimentale qui tire profit de cette expression non uniforme pour analyser l'effet de la protéine transfectées sur la machinerie de sécrétion des cellules INS-1 cocultivés est représenté dans la figure 3 dans Suckow et al., 2012 10.
Il convient également de noter que le degré de contact entre une cellule bêta donnée et les cellules voisines exprimant la protéine d'intérêt est susceptible d'être moins dans ce système que dans les îlots intacts in vivo, dans laquelle les cellules bêta pourraient être entouré de tous côtés par les cellules exprimer la protéine. Ce contact de cellule à cellule relativement réduit pourrait réduire l'ampleur des changements dans la sécrétion d'insuline au-dessous de ce que l'on observerait si les interactions transcellulaires concernés ont été en quelque sorte éliminés îlots indigènes.
e_content "> Utilisation d'une population clonale de cellules transfectées de manière stable HEK293 plutôt que de transfection transitoire se traduirait par une expression plus uniforme et peut-être simplifier expérimentale mise en place, mais il faudrait beaucoup plus up-front temps et d'efforts afin de générer la manière stable Les cellules exprimant. futures études permettront de déterminer si, par transfection de deux ou plusieurs protéines transmembranaires dans la couche de cellules HEK293, les effets synergiques possibles ont pu être observées.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les Instituts de la Santé subvention R01DK080971 et Juvenile Diabetes Research Foundation subvention 37-2009-44 nationale. Nous apprécions également le soutien reçu de la Pediatric Research Center Diabetes UCSD (CEDE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
