Summary
Interações de proteínas intracelulares são determinantes importantes da função das células beta no pâncreas. Detalhado aqui é um método adaptado a partir de um modelo de co-cultura de synaptogenesis-para investigar como as proteínas transmembrana específicos influenciar a secreção de insulina. As células HEK293 transfectadas expressam as proteínas de interesse, células beta não precisa ser transfectadas directamente ou de outro modo perturbado.
Abstract
Interações entre proteínas de superfície celular ajudar a coordenar a função das células vizinhas. Células beta do pâncreas são agrupados dentro de ilhotas pancreáticas e agir de forma coordenada para manter a homeostase da glicose. Está se tornando cada vez mais claro que as interações entre proteínas transmembrana nas superfícies de células beta adjacentes são importantes determinantes da função das células beta.
Elucidação dos papéis particulares interações transcelulares por estudos knockdown, nocaute ou superexpressão em células beta cultura ou in vivo necessita de perturbação direta de mRNA e expressão da proteína, potencialmente afetando a saúde das células beta e / ou função de maneiras que poderiam confundir análises dos efeitos de interacções específicas. Estas abordagens também alterar os níveis dos domínios intracelulares das proteínas alvo e podem evitar os efeitos devido às interacções entre as proteínas no interior da mesma membrana da célula para ser disdiferenciadas das efeitos das interacções transcelulares.
Aqui, um método para a determinação do efeito de interacções específicas transcelular na capacidade de segregar insulina e capacidade de resposta das células beta é apresentado. Este método aplica-se a linhas de células-beta, tais como células INS-1, e para as células beta primárias dissociadas. Baseia-se em modelos de co-cultura desenvolvidas por neurobiólogos, que descobriu que a exposição de neurônios cultivados às proteínas neuronais específicos expressos em HEK293 (ou COS) camadas de células identificadas proteínas importantes para a condução de formação de sinapses. Dadas as semelhanças entre a maquinaria de secreção das sinapses neuronais e das células beta, que argumentou que a maturação funcional das células beta pode ser conduzido por interações transcelulares semelhantes. Foi desenvolvido um sistema em que as células beta são cultivadas sobre uma camada de células HEK293 expressando uma proteína de interesse. Neste modelo, o citoplasma da célula beta é tocada enquanto extracelular da proteína-proteína interactions são manipulados. Embora o foco aqui primariamente em estudos de glicose estimulada a secreção de insulina, outros processos podem ser analisados, por exemplo, as alterações na expressão do gene, como determinado por imunotransf erência ou qPCR.
Introduction
Descrevemos aqui um método para facilitar as investigações de como os domínios extracelulares de proteínas transmembrana específicos afetam a secreção de insulina. O método sondas os efeitos das interacções da proteína de interesse com proteínas (ou possivelmente de outras moléculas), na superfície das células beta do pâncreas. O método permite investigações de como as proteínas da superfície celular, expressas por células beta ou por outras células vizinhas (por exemplo, células endoteliais, neurónios, células alfa pancreáticas) afectam a função das células beta através de interacções transcelulares (isto é, através de interacções com os parceiros de interacção na superfície adjacente células beta).
A membrana plasmática celular contém um conjunto complexo de proteínas estruturais e funcionais, que servem como ponte para o ambiente extracelular. Pela formação de ligações transcelular ou por abertura de eventos de sinalização de plástico, as interações entre proteínas de superfície celular pode ajudar a coordenar afunção das células vizinhas. Células beta do pâncreas são agrupados dentro das ilhotas pancreáticas e agir de forma coordenada para manter a homeostase da glicose 1. Como revelado, por exemplo, a importância da extracelular EPHA-ephrinA e neuroligin-2 interações na regulação da glicose estimulada a secreção de insulina, está se tornando cada vez mais claro que o aumento do conhecimento das interações entre proteínas extracelulares que ocorrem nas superfícies das adjacente células beta será de grande importância para a obtenção de uma compreensão completa da secreção de insulina, a maturação funcional das células beta e na manutenção da homeostase da glicose 1-3. O objectivo do método descrito aqui é o de permitir investigações dos efeitos sobre a função de interacções envolvendo transcelular transmembranar específica ou de outro modo, as proteínas de superfície celular associados à célula beta. Por células beta co-cultura com células HEK293 transfectadas com diferentes construções de expressão, os efeitos sobre a bfunção das proteínas da superfície das células diferentes ou variantes mutadas célula eta do mesmo pode ser eficientemente sondadas. Isto é conseguido sem a necessidade de transfectar as próprias células beta.
Elucidação dos papéis particulares interações transcelulares por estudos knockdown, nocaute ou superexpressão em células beta cultura ou in vivo necessita de perturbação direta de mRNA das células beta e expressão da proteína, potencialmente afetando a saúde das células beta e / ou função de maneiras que poderiam confundir análise de os efeitos das interacções extracelulares específicos. Estas abordagens também alterar os níveis dos domínios intracelulares das proteínas alvo e, além disso, não permitem que os efeitos devido às interacções entre as proteínas sobre ou dentro da mesma célula para se distinguir os efeitos de interacção intracelular. Aqui, um método para determinar o efeito das interacções específicas transcelular na capacidade de segregar insulina e capacidade de resposta das células beta é described. Este método aplica-se a linhas de células beta secretoras de insulina, tais como as células INS-1, 4 e roedor primárias dissociadas ou células beta humanas. Baseia-se em modelos de co-cultura desenvolvidos por neurobiologists, que verificaram que a exposição de culturas de neurónios a proteínas neuronais específicos expressos em HEK293 (COS), as camadas de células conseguiu identificar as proteínas que conduzem a formação de sinapses 5,6. Dadas as semelhanças entre a maquinaria de secreção das sinapses neuronais e das células beta, que argumentou que a função das células beta e maturação funcional pode ser conduzido por interações transcelulares semelhantes 7-9. A fim de investigar estas interacções, foi desenvolvido o sistema aqui descrito, em que as células beta são co-cultivadas numa camada de células HEK293 expressando uma proteína de interesse 10. Este sistema permite que o citoplasma das células beta para permanecer intacta enquanto extracelulares interacções proteína-proteína são manipulados.
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Protocol
1. A transfecção de HEK293 Camada
- Prepara HEK293 meio celular por adição a 500 ml de frascos de meio DMEM (com 4,5 g / ml de glucose e de vermelho de fenol e sem glutamina): 50 ml de FBS, 5 mL de 100X solução de estreptomicina penicilina /, 5 ml de solução de L-glutamina e 500 100x anfotericina ul B.
- Placa para células HEK293 em uma placa de 24 poços utilizando 0,5 ml de meio por poço HEK293. Assegure-se que as células são distribuídos uniformemente em toda a parte inferior da placa.
- Quando as células HEK293 chegar a 100% de confluência, transfecção com 0,8 ug do plasmídeo que codifica a proteína de interesse (inserido num vector de expressão de mamífero) e 2 ul de Lipofectamina 2000, de acordo com o protocolo de lipofectamina. Optou-se por utilizar o pcDNA 3,3 backbone projetado para expressão em células de mamíferos.
- Opcionalmente, após 6 horas de incubação, a troca da mídia transfecção descrito no protocolo Lipofectamine com HEK293 meios normais.
- Para avaliar a expressão da prote transfectadasnum subconjunto dos poços de cultura de tecidos transfectados podem ser usadas para a detecção de imunofluorescência da proteína expressa ou para análise por Western blot da expressão da proteína, utilizando técnicas convencionais.
2. A fixação opcional de células HEK293 que expressam a proteína Transfectadas
As células HEK293 transfectadas podem ser fixados suavemente, a fim de facilitar a co-cultura em meios que podem ser prejudiciais para a vida (por exemplo, células HEK293 passo 3.9 abaixo), ou para permitir que a preparação eficiente de antecedência de placas para várias experiências de uma só vez (ver também a discussão).
- Realizar estudos piloto para determinar a evolução no tempo da expressão da proteína nas células HEK293.
- Após transfecção de células da camada HEK293, aspirar os meios de comunicação das células no ponto de tempo pós-transfecção associado com maior nível de expressão. Se isto ocorre dentro das primeiras 24 horas, não se aspirar até 24 horas após a transfecção.
- Lave HEK293 células suavemente com D-PBS, em seguida adicionar 500 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. (Para fazer a solução de PFA 4%, comece com uma solução de 16% em 1X PBS e diluir 1:04 com 1X PBS).
- Utilizando PBS estéril, lavar suavemente as células três vezes em PBS e incubar O / N a 4 ° C.
- Lavar as células 3 vezes com PBS estéril, em seguida, adicionar PBS e deixar a 4 ° C até ser necessário (tempo máximo de armazenamento poderá variar dependendo da proteína expressa. Nós armazenar células HEK293 transfectadas para expressar neuroligina isoformas de até 2 semanas, sem alterações significativas nos efeitos observados sobre a secreção de insulina).
3. Co-cultura de INS-1 beta células com células HEK293
- Prepara INS-1 media adicionando a 500 ml de meio RPMI 1640 (com glicose e de vermelho de fenol e sem glutamina): 50 ml de FBS, 5 mL de 100X de penicilina / estreptomicina, 5 ml de solução de L-glutamina 100X, 5 mL de piruvato de sódio, 500 mL de anfotericina B, 500 ul de beta-mercaptoetanol (isto é quase idêntico ao do medihum normalmente usado para a cultura ilhéu principal, exceto para a adição de beta-mercaptoetanol).
- Utilizando-celular de remoção (ou outro removedor de células não enzimática), INS-1 de colheita de células de aproximadamente 70-80% de confluência fora da parte inferior de um frasco de cultura T75. Cada frasco de células irá fornecer aproximadamente suficiente para 48 poços.
- Depois girando as células na centrífuga durante 3 min a 1200 rpm, ressuspender em uma mistura 50/50 de INS-1 e meios de HEK. Para um frasco confluente de 70-80% de células INS-1, ressuspender em cerca de 25 ml de meios mistos.
- Se estiver usando células HEK293 que foram fixados em paraformaldeído, em vez de células vivas HEK293, ressuspender as células INS-1 em 100% INS-1 media, em vez de mídia mista.
- Utilizando uma pipeta de 10 ml, desalojar as células da pelota para fazer uma suspensão de células homogéneas.
- Aspirar para remover os meios de comunicação sobre as células HEK293.
- Usando uma pipeta P1000, adicionar cuidadosamente 500 ul de suspensão de célula INS-1 sobre a camada de células HEK ao longo dos lados of poço. Após cada 6 poços, usar uma pipeta de 10 ml para ressuspender as células INS-1 de novo para assegurar uma suspensão homogénea de células. O esquema geral da co-cultura set-up é mostrado na Figura 1.
- Incubar as células durante 24-48 horas, dependendo do protocolo experimental.
- Se for necessário mais de 48 período de co-cultura hr, use passos opcionais na seção 2 acima para corrigir as células HEK293.
- Se estiver usando o roedor dissociada primária ou ilhotas humanas [eg ver protocolos anteriores em Jove 11-15], certifique-se de que uma mídia adequados, como RPMI com 5 ml pen / strep, 5 ml L-Glut, 0,5 ml anfotericina-B é usado em vez de media uma INS-. Embora se possa utilizar as células das ilhotas dissociadas numa placa de 24 poços, na prática, devido ao grande número de ilhotas potencialmente necessários, é recomendado que seja tida em consideração a redução de escala para uma placa com cavidades 48 (necessitando de menos células de ilhéus por poço). Em uma placa de 48, adicionar cerca de 100 ilhotas no valor de dissociaçãoted células por placa para começar. Dependendo da eficácia de dissociação e do método utilizado, menor número de ilhotas pode ser necessária.
4. Glicose estimulada secreção de insulina
- Pré-incubação de células em 250 uL de 2,5 mM de glucose em KRB (tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer) durante um mínimo de 1 hora. Para pré-incubar, remova o meio de co-cultura e substituir imediatamente com KRB. Esta troca deve ser feito um poço de cada vez para minimizar a exposição de células INS-1 para oxigênio ambiental. Aspirar com uma mão enquanto a pipetagem baixa (2,5 mM) de KRB de glicose com a outra.
- Taxas de pré-incubação de KRB a 250 ul de ambos 2,5 mM ou 20 mM de glucose em um tampão KRB assim de cada vez.
- Se for apropriado para o ensaio específico, secretagogos adicionais, tais como 100 ^ M de IBMX pode ser adicionado para produzir uma resposta mais forte de secreção de insulina estimulada. Células beta das ilhotas principais dissociadas em particular, são pouco responsiva ao aumento da concentração de glicose alone, portanto, aqui especialmente a adição de IBMX ou outros secretagogos deve ser considerada 16,17.
- Após 1 hora de incubação, transferir mídia para microcentrifugue tubos e girar 1.500 xg por 5 min.
- Remover 200 ul do sobrenadante e utilizar este para a análise da insulina por RIA ou ELISA.
- Para se preparar o ligado celular, adicionar 100 ul de tampão de lise celular RIPA (NaCl 150 mM, 1,0% IGEPALCA-630 ou Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris a 50 mM, pH 8,0) com inibidores de protease para o placa imediatamente após a remoção de meios de comunicação e incubar a 4 ° C durante 20 min.
- Girar lisado durante 15 minutos a 10000 xg e retirar 50 ul de sobrenadante para a análise da insulina por RIA ou ELISA.
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Representative Results
Utilizando o método descrito aqui, testámos o efeito de diferentes variantes do neuroliguinas proteína na secreção de insulina. Isto complementa a obra publicada a investigar o efeito da neuroliguinas-2 em função das células beta 10. Figura 2, por exemplo, descreve os resultados obtidos a partir coculturing INS-1 células beta com células HEK293 transfectadas para expressar uma isoforma neuroliguinas referido aqui como NL- X. Esta experiência foi concebida para testar a hipótese de que NL-X se engaja em interações transcelulares que aumentam a secreção de insulina. Na Figura 2A, pode-se observar que a expressão de NL-X basal e aumento da secreção de insulina estimulada por co-cultivadas células INS-1. A abordagem de transfecção de células HEK293 que expressam de modo NL-X permite-nos saber que é o domínio extracelular que é a região exibida na superfície da célula HEK293 e, assim, capaz de entrar em contacto com o co-cultivadas células INS-1, que traz sobre a observed aumento na secreção. A NL-X domínio extracelular deve estar interagindo com uma outra proteína (ou talvez qualquer outra molécula) na superfície da célula INS-1, para fazer com que as células INS-1 para segregar mais insulina. Se desejado, a insulina secretada também pode ser expresso como uma percentagem do teor de insulina celular, que pode ser medida após a lise das células.
Nas Figuras 2B e 2C, os resultados de outros tipos de análises que utilizam o sistema de co-cultura são descritos: especificamente, a análise do efeito de interacções envolvendo transcelular neuroliguinas variante NL-Y sobre o conteúdo celular e a insulina nos níveis de ARNm de insulina e de PDX-1. NL-Y aumentou o conteúdo de insulina das co-cultivadas células INS-1 (Figura 2B). Testes adicionais seriam necessárias para determinar se este era devido a um aumento na quantidade de insulina por célula ou devido ao aumento da proliferação de células INS-1. Na Figura 2C, o RNA foi colhido a partir da célulacamada e analisado por RT-qPCR. Uma vez que as células HEK293 são de origem humana, para a transcrição que podem estar presentes em ambos HEK293 e células INS-1, a utilização de iniciadores de PCR específico do rato (células INS-1 são de origem do rato) garante que apenas ARNm de INS-1 origem é medido. Aqui pode ser visto que a co-cultura com a NL-Y insulina aumentada PDX-1 e os níveis de mRNA (normalização foi RNA 18S). Os primers e metodologias utilizadas para esta análise RT-qPCR foram previamente descritos 10, suplemento online.
Figura 1. Coculture set-up. Células HEK293 (células HEK) são adicionadas a placas de cultura de tecidos de 24 poços e em seguida transfectadas. Uma imagem de campo brilhante de uma camada de células HEK293 representativo é mostrado no topo, à direita. As células HEK são transfectados para expressar uma proteína transmembranar marcadas com epítopo. Aqui, a coloração de imunofluorescência é usado para revelar a transfcélulas (verde). Em seguida, as células INS-1 são adicionados. Coloração de imunofluorescência para a insulina foi realizada para permitir a visualização das co-cultivadas células INS-1 (vermelho).
Figura 2. Os resultados obtidos a partir de coculturing INS-1 células beta com células HEK293 transfectadas para expressar as variantes de proteínas neuroligina NL-NL-X ou Y (preenchido, as colunas pretas). Controlo células HEK293 foram transfectadas com as mesmas construções de plasmídeos a não alteraram de modo proteína expressa (colunas brancas). A, a secreção de insulina por co-cultivadas células INS-1 sob condições de baixa (2,5 nM) e elevada (20 mM) de glucose, e também após a estimulação por alta concentração de glicose, juntamente com IBMX. B, INS-1, o conteúdo de insulina celular após co-cultura com células HEK293 expressando NL-Y. C, analysé de insulina e um PDX-os níveis de transcrição por RT-qPCR utilizando ARN isolado a partir de INS-1, as células co-cultivadas com células HEK293 transfectadas, quer com a NL-Y ou com controlo de células HEK293 transfectadas. (*, P <0,05, **, P <0,01; ***, P <0,001).
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Discussion
O método de co-cultura aqui descrito fornece um meio eficaz para determinar a importância fisiológica das proteínas beta da superfície da célula, transmembranares específicos, e, especificamente, dos seus domínios extracelulares. Por cultura de células beta (ou células de insulinoma, tais como as células INS-1 utilizados aqui), em contacto com células HEK293 que indica uma proteína de interesse sobre a superfície celular, as experiências podem ser concebidas para determinar os efeitos da extracelulares interacções proteína-proteína sem perturbar directamente o meio intracelular das células. Uma vez que as proteínas de interesse são expressos por células HEK293, quaisquer efeitos sobre a função das células-β que podem ser mediadas pelos domínios intracelulares das proteínas transf estaria ausente e, portanto, não iria complicar a análise dos efeitos de interacções extracelulares.
Efeitos sobre a secreção de insulina pode ser facilmente determinada através da comparação da secreção a partir de células beta co-cultivadas com células HEK293expressando a proteína de interesse para a secreção das células beta co-cultivados em contato com o controle de células HEK293. As células de controlo pode ser simulada HEK293 transfectadas, ou, alternativamente, transfectadas com uma variante do plasmídeo experimental construção mutada para produzir uma variante de não-funcional da proteína de interesse. Em nossas mãos, os dois tipos de controles produziram resultados idênticos. Como a superfície da célula HEK293 inerentemente contém uma grande variedade de proteínas, ou outro tipo de controlo permite que a função das células beta em contacto com várias moléculas de superfície de células diferentes, incluindo a proteína de interesse, a ser comparado com a função de células beta em contacto com o mesmo conjunto de moléculas da superfície celular, com a excepção de a proteína de interesse (ou incluindo uma versão mutante da proteína de interesse).
INS-1 ou outras células (células beta) são adicionados às HEK293 camadas de baixa densidade de modo que haja pouco ou nenhum contacto de INS-1, as células com outros INS-1 cells. Isto permite que os efeitos de transcelular interacções entre a proteína de interesse expresso na superfície de células HEK293 e proteínas na superfície da célula INS-1 até ser observada na ausência do potencial de ruído de fundo causado por interacções que envolvem o mesmo transcelular proteína expressa endogenamente no INS superfície das células -1.
Após a transfecção, a camada de células HEK293 podem ser fixados suavemente. Essa fixação opcional pode ser utilizado para permitir múltiplas placas de co-cultura a ser preparada de uma vez por adição subsequente de células beta em data posterior. A fixação das células HEK293 Também seria vantajoso se houvesse a preocupação de que HEK293 metabolismo ou função secretora de alguma forma interferir com a análise da função das células beta. Finalmente, o protocolo de fixação podem ser utilizados para facilitar as experiências de co-cultura prolongados. Aqui, a principal vantagem da utilização de células HEK293 fixos é que o meio de cultura ideal para as células beta pode ser empregue em vez de utilizar ummídia mista (por exemplo, veja o passo 3.3) necessários para a manutenção HEK293 co-cultivados e células beta simultaneamente. Em experimentos de co-cultura prolongados, o uso do mixed-media que não é o ideal para qualquer tipo de célula, pode prejudicar a viabilidade das células beta.
HEK293 são empregues aqui, porque eles são altamente susceptíveis a transfecção: eles podem ser transfectadas com alta eficiência, usando uma variedade de diferentes reagentes de transfecção 18,19. HEK293 é um dos dois tipos de células, juntamente com as células COS - que são rotineiramente utilizados em sistemas de co-cultura neuronal semelhantes 5. Lipofectamine 2000 é um reagente de transfecção comprovada muito usados com células HEK293 e rotineiramente eficiências de transfecção (percentagem de células transf) de mais do que 95% em estudos publicados 18-20. Outros reagentes podem atingir eficiências semelhantes de transfecção 19,20. Com a construção do plasmídeo neuroliguinas-2, a eficiência de transfecção é geralmente ~ 80%. AltHough nos concentrarmos aqui em estudos de glicose estimulada a secreção de insulina, outros modos de análise são possíveis, por exemplo, FACS, imuno-histoquímica, western blotting e / ou, como se vê na Figura 2C, qPCR.
Apesar de ser uma ferramenta muito útil para ajudar a descobrir a função de determinadas interações protéicas extracelulares, o método descrito aqui não é sem seus limites. Uma vez que as células beta precisam de estar em contacto directo com a camada de células HEK293, as linhas celulares de insulinoma, tais como as células INS-1, são particularmente bem adequados para este sistema de co-cultura de 4. Traduzindo os resultados para as células das ilhotas primárias implica a dispersão dos ilhéus isolados. Uma vez que a estrutura em si ilhéu é parte integrante da sinalização adequada e resposta à glicose, a resposta de insulina estimulada é embotada em células beta primárias dispersas em relação ao ilhotas intactas 1,3,17. Além disso, devido a transfecção transiente não resulta na expressão uniforme dos th e proteína através do relvado HEK, quando realizando experiências imagiológicos (imunohistoquímica), um método para normalizar os níveis de expressão de proteína podem ser necessárias para interpretar os resultados. Uma abordagem experimental que tira vantagem desta expressão não uniforme para analisar o efeito da proteína transfectada sobre a maquinaria de secreção de co-cultivadas células INS-1 é mostrada na Figura 3 em Suckow et ai., 10, 2012.
Também deve ser notado que o grau de contacto entre qualquer dada célula beta e células vizinhas expressando a proteína de interesse é susceptível de ser menor do que no presente sistema em ilhotas intactas in vivo, em que as células beta pode ser rodeado por todos os lados por células expressando a proteína. Este contacto de célula para célula relativamente reduzida pode reduzir a magnitude das mudanças na secreção de insulina para abaixo do que seria observado se as interacções relevantes foram de alguma forma transcelular eliminado da ilhéus nativos.
e_content "> Uso de uma população clonal de estavelmente transfectadas células HEK293, em vez de transfecção transitória resultaria na expressão mais uniforme e, possivelmente, simplificar montagem experimental, mas exigiria substancialmente mais inicial de tempo e esforço, a fim de gerar o estavelmente as células que expressam. Estudos futuros irão determinar se, por transfecção de duas ou mais proteínas de transmembrana para a camada de células HEK293, os possíveis efeitos sinérgicos podem ser observadas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concessão R01DK080971 e Juvenile Diabetes Research Foundation concessão 37-2009-44. Agradecemos também o apoio recebido do Pediatric Diabetes Research Center UCSD (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
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