Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Summary

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Abstract

Genome-scale Verhör der Genfunktion mittels RNA-Interferenz (RNAi) birgt ein enormes Versprechen für die schnelle Identifizierung von chemisch gefügig Krebszelle Schwachstellen. Die Begrenzung der Potenzial dieser Technologie ist die Unfähigkeit, schnell zu beschreiben die mechanistische Grundlage der Ergebnisse und somit phänotypische informieren die Entwicklung von molekular zielgerichtete therapeutische Strategien. Wir skizzieren hier Methoden zur zellulären Phänotypen durch RNAi-vermittelte Gen-Targeting mit Multiplex-Reporter-Systeme, die Überwachung der wichtigsten Krebszelle-assoziierte Prozesse ermöglichen induziert dekonstruieren. Diese High-Content-Screening-Methode ist vielseitig und kann leicht für das Screening von anderen Arten von großen molekularen Bibliotheken angepasst werden.

Introduction

Eine Vielzahl von Luciferase-basierte Reporter zur Überwachung einer Vielfalt von zellbiologischen Prozesse sind im Handel erhältlich. Die Mehrzahl dieser DNA-Konstrukte kodieren Proteine, die Luciferase induziert durch spezifische Reize Zelle oder Störungen auszudrücken. Die robuste transkriptionell basierte Reportern platzieren die Expression eines Enzyms Luciferase unter der Kontrolle von synthetischen Enhancer-Elemente oder Gen-Promotor-Regionen für ihre Zuverlässigkeit in der Berichterstattung eine physiologisch relevante Transkriptions-Veranstaltung ^1,2 etabliert. Es gibt auch trans-Reporter Luciferase-Systeme, die GAL4-UAS zu nutzen, um Luciferase Proteinexpression fahren. Gal4 ist ein Hefe-Transkriptions-Aktivator und die UAS ist ein Enhancer, die Gal4 spezifisch bindet, um die Transkription der Gensequenzen angeordnet stromabwärts davon ³ zu aktivieren. Diese Arten von Luciferase-Systeme sind in der Regel von zwei DNA-Plasmide getragen - ein GAL4-Protein kodiert, das fusioniert an die regulatorischery Teil eines Proteins von Interesse, und die zweite Luciferase kodiert für ein Protein unter der Kontrolle eines oder mehrerer UAS-Sequenzen angeordnet. Somit spiegelt die zelluläre Luciferasesignal die Aktivität des Proteins von Interesse. Eine andere übliche Anwendung von Luciferase-basierte Reporter dient zur Überwachung Proteinstabilität, wodurch ein Protein von Interesse an einer Luciferaseenzyms ⁴ fusioniert ist. Unabhängig von der Art der Reporter wird ein Gewährleistungsausschluss hier kann man nicht davon ausgehen, die Spezifität von jedem Reporter zu gut verhört haben zur Kenntnis genommen. Somit wird Due Diligence in den Einbau von neuen Reporter-Konstrukte in jeder Forschung Strategie erforderlich.

Die Auswahl des Luciferaseenzyms Auslesen kann ebenso wichtig sein wie die Zuverlässigkeit der DNA-Elemente, die ihren Ausdruck kontrollieren. Während Glühwürmchen-Luciferase (FL) ist das am häufigsten verwendete Enzym in im Handel erhältlichen Konstrukte wird das Aufkommen der neuen Luciferase-Reporter-Systeme, die keine ATP (wie im Fallvon FL-basierte Reaktionen) oder dass integrieren stabiler Enzyme, die stärkere Signale aussenden versprechen, um die Effizienz und Zuverlässigkeit dieser Forschungsplattform zu verbessern. Ein wichtiger Hinweis für die Auswahl der Luciferase Reporter in chemische Untersuchungen ist die Anfälligkeit von FL auf chemische Hemmung, die Anlass zu falschen Berichten geben könnte. Nach unserer Erfahrung sind auch andere Enzyme wie Renilla Luciferase oder Gaussia (RL und GL, respectively), die Coelenterazin verwenden als Substrat weniger leicht gehemmt durch kleine Moleküle ^5.

Das gängigste Format zum Multiplexen Luciferase Auslesen bringt die Verwendung von FL und RL weitgehend angesichts der Verfügbarkeit von easy-to-use-Kits mit der Fähigkeit, nacheinander messen enzymatischen Aktivitäten aus einer einzigen Probe. In den meisten Kits, werden die Proben zunächst auf Luciferin ausgesetzt Ebenen der FL Aktivität durch eine Quenchreagens gefolgt, die gleichzeitig mit Coelenteracin abgeschieden wird, um eine gebraucht ergeben offenbarendary RL Signal. Mit dem Zusatz von anderen Luciferasen, wie GL oder dass auf ein weiteres Substrat, wie Cypridina Luciferase (CL), eine größere Anzahl von Möglichkeiten zur Erzeugung von Daten mit hohen Luciferasen entstanden abgesondert werden kann. Ein Beispiel für eine genomweite RNAi-Bildschirm mit Hilfe dieser Technik können hier ⁶ gefunden werden. Diese technologischen Fortschritte haben wiederum trieb die Entwicklung von spezifischen Mechanismen, um jede Art von Luciferaseenzyms stillen, um cross-talk ⁷ begrenzen. In unseren Händen, stellen wir eine größere Häufigkeit von "Randeffekte" (unerklärliche Trends in Zellaktivität mit der Kante des hohen Titer Kultur Platten verbunden sind), mit abgesondert Luziferasen wie GL oder CL. Auf der anderen Seite sind solche sezerniert Luciferasen aus kinetischen Assays nützlich, da sie Signalabtastung ohne Verfälschung Zelllebensfähigkeit ermöglichen.

Für unsere hier vorgestellten Studie, werden wir gleichzeitig die Aktivitäten der drei Krebs-relevantezelluläre Prozesse: die p53, Kras und Wnt Signaltransduktion. Die Reporter in unserer Studie einbezogen sind die pp53-TA-Luc FL Reporter von Clontech (im Folgenden auch als p53-FL Reporter bezeichnet) ^8, eine Elk1-GAL4/UAS-CL Reporter System (im Folgenden Elk-1-Reporter, Agilent), und die 8X TCF RL Reporter, die mehrere synthetische Enhancer-Elemente von den Wnt-Signalweg Transkriptionsfaktoren wie T-Zell-Faktoren (oder TCFs) ^9-11 bekannt anerkannt enthält.

Protocol

Entire Protokoll dauert ca. 4 Tage.

1. Vorbereitung der Zellen für siRNA Transfektion und Reporter

Wir werden hier vorstellen ein Protokoll für die Abfrage von siRNA-Bibliotheken mit einem kleinen Satz von siRNAs (384 verschiedene siRNA-Pools Array in 96-Well-Format mit jedem Pool, bestehend aus 4x siRNAs ein einzelnes Gen) aus einer genomweiten siRNA-Bibliothek zu illustrativen Zwecken. Für diese besondere Studie werden wir nutzen HCT116 Zellen, die abweichende Wnt-Signalisierung und Kras ausstellen, und p53-Aktivität. Die geeignete Zelllinie in Studien bei Abfragen andere zelluläre Prozesse von Interesse gerichtet sind, müssen identifiziert und bewertet werden in ähnlicher Weise.

1. Waschen 5 x 10 cm ² Platten aus 80-90% konfluenten Zellen mit PBS HCT116 dann Ernte Zellen durch Trypsin mit 1 ml Trypsin-Lösung / Platte durch Neutralisation mit 10 ml von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gefolgt, die 2% Fetal Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Platte.
2. Übertragen suspendierten Zellen auf eine 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei ~ 130 xg für 5 min, entfernen Überstandes und Resuspendieren Zellpellet wurde in 10 ml DMEM / 2% FBS / 1% Penicillin / Streptomycin.
3. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Zelle Zähler, und dann eine Zell-Lösung mit 10 ⁵ Zellen / ml, 150 ml halten Zellsuspension für den nächsten Schritt. Teller 10 ⁴ Zellen (100 ul) in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte mit einer Mehrpunkt automatisierten Liquid Dispenser (fortan Multidrop). Die Zellsuspension sollte ausreichend sein, in diesem Fall für die Beschichtung 12 x 96-Well-Platten.
4. Die Inkubation mit Zellen bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO ₂ während der Vorbereitung der Transfektionsansatz.

2. Vorbereiten der Reporter Construct Stammlösung

1. Isolieren hochwertige Reporterkonstrukt DNA unter Verwendung von Standard Midiprep Kits (NucleoBond Xtra Midi produziert vonClontech) und löst die DNA in einer Endkonzentration von 1 mg / ml für jede Reporter.
2. Bereiten Sie 100 ul Reporterkonstrukt Stammlösung durch die Kombination von 30 ul p53-FL, 30 ul 8X TCF-RL, 30 ul Elk1-Gal4, UAS 6 ul-CL und 4 ul H ₂ O, um eine DNA-Mix mit erreichen eine endgültige 1:1:1:0.2 Verhältnis der Reporter. Endgültige DNA Konzentration dieser DNA-Mix stock Lösung beträgt 0,3 mg / ml.

3. Vorbereiten der siRNA / DNA Transfektion Mix

In diesem Teil des Protokolls, bereiten wir siRNA / DNA Transfektion Mischungen, die ausreichen, um das Transfizieren 12 x 96-Well-Platten werden. Für diesen Test Bibliothek der 4 x 96-Well-Platte von siRNAs, werden wir jede siRNA Pool in dreifacher Ausfertigung transfektieren. Das Transfektionsreagenz wir verwenden heißt Effectene (Qiagen). In unseren Händen ist dies die einzige Reagenz, das für die gleichzeitige Aufnahme von siRNA und DNA in kultivierte Zellen funktioniert.

1. Verdünnen Sie 80 ul Reporter Konstrukt stock solution in 8 ml EC-Puffer (Effectene Kit), um eine DNA-Lösung mit einer Endkonzentration von 3 pg / ml zu erreichen. In der Regel bereiten genug DNA-Lösung Mix für den sofortigen Einsatz.
2. Die Platte 20 ul dieser DNA-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well / Platte. Die Zahl der 96-Well-Platten auf, wie viele siRNA Pools getestet werden abhängen. Zum Beispiel kann in diesem Fall müssen 4 x 96-Well-Platten zu 384 verschiedene Pools siRNA bewerten.
3. Die siRNAs getestet werden sollte an einer Börse Konzentration von 5 &mgr; m betragen. Wenn nicht, können sie replikaplattiert und verdünnt dieser Konzentration mit der empfohlenen Verdünnungspuffer mit jeder Bibliothek zugeordnet sind.
4. Übertragen 2 ul jeder 5 uM siRNA Lager in die entsprechende Vertiefung der PCR-Platte mit der verdünnten DNA Aktien mit einem Biomek Automated Liquid Handler. Je nach Umfang der Studie kann eine Mehrkanalpipette ausreichen.
5. Jetzt werden wir 1 ul Enhancer-Lösung (Effectene Kit) in jede Vertiefung der DNA / siRNA pla hinzufügente. Dies wiederum kann entweder mit einem automatisierten Liquid-Handling-oder Mehrkanal-Pipette erreicht werden.
6. Lassen Sie die Enhancer Reaktion bei RT für 5 min auftreten fügen Sie dann 3 ul Effectene Transfektionsreagenz in jede Vertiefung und Inkubation bei RT für weitere 10 min.
7. Zur Transfektion Komplexbildung zu stoppen, mit 10 ul DMEM / 2% FBS / 1% Penicillin / Streptomycin in jedes Well der PCR-Platte.
8. Werden 10 ul der Transfektionsgemisch in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, welche die Zellen (wird aus der Zelle Inkubator). Da jeder Transfektion in dreifacher Ausführung durchgeführt werden, wird die gleiche Mischung zu zwei zusätzliche 96-Well-Platten mit Zellen eingesetzt werden.
9. Inkubieren der Zellen mit der Transfektion Mischungen bei 37 ° C in einer feuchten Umgebung mit 5% CO ₂ für 36 Stunden zugegeben.

4. Bestimmen Luciferaseaktivitäten von Zellproben

Nach 36 Stunden sind Luciferaseaktivitäten zur Messung bereitin transfizierten Zellen. Der Endpunkt sollte auf einer Pro-Experiment festgelegt werden. In unserer Studie war eine 36 h Inkubationszeit zuvor eine ausreichend robuste Signal nach dem Sinn Ergebnis Bestimmung ergab. Wie diese Studie umfasst verschiedene Reporter (ein in das Kulturmedium, und die beiden anderen im Zytoplasma der Zelle exprimiert sekretiert), wir Messungen sowohl Kulturmedium sowie ein Zelllysat zu erhalten.

1. Nachweis von CL-Aktivität im Kulturmedium:
   1. 20 ul Kulturmedium replica-überzogen in einer weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platte (entweder über die Biomek Liquid Handler oder Mehrkanal-Pipette).
   2. In 20 ul CL-Assay-Puffer (Targeting Systems) in jede Vertiefung.
   3. In 10 ul Cypridina Luciferinsubstrat (Targeting Systems) in jede Vertiefung und erkennen CL-Aktivität mit einem Luminometer (die Platte Pherastar Leser von BMG zum Beispiel produziert).
2. Nachweis von FL und RL-Aktivität:
   1. Lyse der cEllen indem zunächst das Kulturmedium. Dies kann schnell durch Drehen Platte auf den Kopf und warf Medium in einer Senke erreicht werden. Verbleibende Medium kann durch leichtes Antippen der Platte kopfüber auf Küchenpapier entfernt werden. In 30 ul 1X Passive Lysis Buffer (Promega) in jede Vertiefung der Zellen unter Verwendung des Multidrop und Ort auf einer Plattform Wippe (Bellco ist ein Unternehmen, das diese macht) gesetzt eine mittlere Geschwindigkeit für 5 min bei RT.
   2. In 20 ul des Luciferase Assay Reagent II (Teil des Dual-Luciferase Promega Kit) mit dem Multidrop und sofort messen FL Aktivität mit dem Luminometer. Als Nächstes fügen Stop & Glo Reagenz (Promega), die die FL Aktivität auslöschen und erlauben die Messung von RL Aktivität. Hinweis: wenn Sie mit Substrat Mixe, die verlängerte Dauer des Signals (wie Dual-Glo Luciferase Kits von Promega) ermöglicht werden, erfordert die Verwendung von Flash-Kits schnelle Messung auf dem Substrat zusätzlich (innerhalb von 5 min).

Representative Results

Trotz der Fortschritte bei der Kartierung der Mutations-Landschaft von verschiedenen Krebsarten mit massiven Genom-Sequenzierung Bemühungen ^12-14, haben wir noch nicht im Ort haben einen systematischen Ansatz für die Umsetzung dieser Beobachtungen in Interventionsstrategien. In Darmkrebs (CRC), Mutationen, die voraussichtlich drei Komponenten des zellulären Prozesse beeinflussen werden - Wnt / β-Catenin, p53 und Kras-Signalisierung - sind in 99% aller Tumoren hindeutet, sie sind wichtige Treiber der zellulären Transformation im Darm gefunden ^13. So werden Krebsgenoms Datensätze wahrscheinlich nach Genen, die gemeinsamen Nenner Krebs unterstützen Förderung Prozesse angereichert, und das könnte zur schnellen Identifikation der Krebszelle Sicherheitslücken ausgenutzt werden. Um diese Hypothese zu untersuchen, haben wir Strategien zugänglich Hochdurchsatz-Abfrage der Genfunktion in Bezug auf Wnt / β-Catenin, p53, Kras und Signalisierung entwickelt. Wir wollen zunächst zeigen die Spezifität der einzelnen Reporter-Systems in einzelne Reporter Tests (Abbildung 1) und dann den Nachweis erbringen, dass diese Reporter zusammen könnte für gleichzeitige Messungen der Genaktivität dieser drei wichtige zelluläre Prozesse (Abbildung 2) verwendet werden.

Abbildung 1. Hochdurchsatz-Luciferase-Assays für die Überwachung der Wnt / β-Catenin, p53 und Kras / Erk Signalweg Status in Säugerzellen. Die Robustheit von drei verschiedenen Screening-Plattformen wurden einzeln vor Multiplexen mit Steuerung siRNAs etablierten Weg Komponenten beurteilt. Indiziert Darmkrebs-Zelllinien wurden mit dem 8X TCF, pp53-TA-Luc oder Elk-1 Glühwürmchenluciferase-encoding Reporter-Konstrukte zusammen mit Pools von siRNAs β-Catenin, p53 oder Kras, beziehungsweise. Transfiziert Pathway-relevanten Genotypen für jede Zelllinie angegeben. Die Stärke der einzelnen Screening-Plattform wurde von der Reproduzierbarkeit dieser siRNAs-induzierten Effekte auf die relevanten Signaltransduktionsweg beurteilt. Die β-Catenin siRNAs haben keinen Einfluss auf 8X TCF Reporter Aktivität in RKO-Zellen im Gegensatz zu DLD-1 und HCT-116-Zellen, die jeweils einen Mangel an der APC-Suppressor-Protein sind und sich ausdrücken eine aktivierte Form von β-Catenin. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung .

Abbildung 2. Multiplexing Luciferase basierten Reporter für High-Content-Analyse von Gen-zellulären Funktion. A. Schematische Darstellung einer Strategie zur gleichzeitigen Überwachung Wnt / β-cat enin, p53 und Kras Weg Aktivitäten. FL = Glühwürmchenluciferase, RL = Renilla Luciferase, CL = Cypridina Luciferase (sezernierte Enzym). FL und RL Aktivitäten in Lysat werden mittels Luciferin und Coelenteracin Substraten. CL-Aktivität in dem Kulturmedium unter Verwendung Oxiluciferin. * Andere Reporter-Systeme können in dieses Protokoll aufgenommen werden, um den Inhalt jedes Experiment zu erhöhen. Zum Beispiel kann das Mehl CytoTox Assay verwendet werden, um zelluläre Toxizität überwacht durch Abtasten der Ebenen einer intrazellulären Protease in das Kulturmedium freigesetzt werden. Die Zugabe des CytoTox Assayreagens hat keinen Einfluss auf die Aktivität des CL Reporter. B. Bezeichnung des Weg-spezifische Schwachstellen mittels RNAi. Die Fähigkeit des Multiplex-Luciferase-System in "A" beschrieben, um Gen Hingabe an zelluläre Funktion Quantifizierung wurde unter Verwendung der angegebenen siRNA-Pools.nk "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Discussion

Es gibt mehrere Lieferanten von Luciferase Reporter-basierte Systeme (wie Promega, Zielsysteme, New England Biolabs, und Thermo Fisher), die nützliche Online-Ressourcen zur Verfügung für diejenigen unterhaltsam ein Hochdurchsatz-Screening für die erste Zeit. Darüber hinaus sollte eine Reihe von ausgezeichneten Bewertungen in Bezug auf die Optimierung der Nutzung von High-Throughput-Screens für die Gen-Entdeckung und wie RNAi-basierte Screening-Ergebnisse mit anderen-omics-basierten Datensätzen integriert werden hilfreich sein ^15,16. Methoden für die Auswahl von "Hits" von High-Throughput-Screens sind Gegenstand der weiteren Diskussion, die über den Rahmen dieses Berichts ist. Mehrere Übersichten zu diesem Thema sind ^17,18. Allerdings ist ein wichtiges Kriterium für die Validierung von ausgewählten Hits aus Bildschirmen über den Einsatz von transkriptionell aktiviert Reportern basiert die Fähigkeit für den gleichen Perturbagen (RNAi-basierte oder chemisch), um die gleiche Wirkung auf validierten Zielgene zu induzieren, gemessen mittels RT-PCR, qPCROder Microarray-Analyse. Darüber hinaus, denken Sie daran, dass das Ausmaß der Reaktion als durch die Reporter gemessen typischerweise höher ist als die Induktion einer endogenen Reporter gegeben, dass ein Merkmal eines erfolgreichen synthetischen Reporter ein zuverlässiges Signal zu liefern. Schließlich ist ein Vorteil dieser Kotransfektion Strategie die Leichtigkeit, mit der man schnell montieren können verschiedene Reporter Cocktails für die Überwachung einen gewünschten Satz von zellulären Aktivitäten. Obwohl arbeitsintensiver, die Verwendung von Zelllinien stabil beherbergen die Reporter wahrscheinlich erhöhen das Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund der Variabilität der Reaktion ist nun vor allem darauf beschränkt siRNA Transfektionseffizienz allein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System	Agilent Technologies Inc.	219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector	Clontech Lab Inc.	631914
Effectene Transfection Reagent	Qiagen Inc.	301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega Corp.	E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent	Targeting Systems	VLAR-1
HCT116 cells	ATCC	CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay	Promega Corp.	G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser	Labsystems Inc.	Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers	Hausser Scientific Company	1490