Summary
Se presenta un método eficiente y simple para aislar embriones en las primeras etapas de desarrollo desde
Abstract
En las plantas con flores, el embrión se desarrolla dentro de un tejido nutritivo - el endospermo - rodeado por los tegumentos de semillas materna (o cubierta de la semilla). Como consecuencia de ello, el aislamiento de los embriones de la planta en las primeras etapas (1 celda a la etapa globular) es técnicamente difícil, debido a su relativa inaccesibilidad. La disección manual de eficiente en las primeras etapas está fuertemente afectada por el pequeño tamaño de jóvenes semillas de Arabidopsis y la adhesividad del embrión a los tejidos circundantes. Aquí, se describe un método que permite el aislamiento eficiente de pequeños embriones de Arabidopsis, un rendimiento de hasta 40 embriones en 1 hora a 4 horas, dependiendo de la aplicación aguas abajo. Los embriones se liberan en tampón de aislamiento por aplastamiento ligeramente 250-750 semillas con una mano de mortero de plástico en un tubo Eppendorf. Un vaso capilar se adjunta a una pipeta de laboratorio estándar (a través de un tubo de goma) o una microinyector mando hidráulico se utiliza para recoger los embriones de un lugar gotitasd en un portaobjetos de pocillos múltiples en un microscopio de luz invertida. Las habilidades técnicas requeridas son simples y fáciles de transferir, y la configuración básica no requiere de equipos costosos. Embriones recogidos son adecuados para una variedad de aplicaciones aguas abajo, tales como RT-PCR, secuenciación de ARN, análisis de metilación del ADN, hibridación fluorescente in situ (FISH), la inmunotinción, y ensayos de genes informadores.
Introduction
El embrión de plantas con flores está rodeado por el endosperma, un tejido nutritivo derivado de un segundo evento de la fertilización. Tanto el embrión y el endospermo están rodeadas por varias capas de células de la cubierta de la semilla. Colectivamente estos tejidos forman una semilla, que se desarrollan en el interior de la fruta. Por lo tanto, el tejido y los análisis específicos de células de embriones de Arabidopsis están fuertemente deteriorados por razón de su inaccesibilidad. Sin embargo, los embriones en las fases finales de globulares o temprano son relativamente susceptibles a la disección manual con el uso de agujas finas de tungsteno bajo el microscopio estereoscópico, o aplicando una ligera presión sobre la semilla utilizando pinzas para extraerlos. Tales técnicas se utilizaron con éxito para el análisis de perfiles de transcriptoma o epigenoma tales como microarrays de hibridación, secuenciación de bisulfito, o la secuencia de ARN (por ejemplo, 1-3). Por el contrario, los estudios de embriones en el cigoto a la etapa globular temprana siguen siendo un desafío técnico. Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios han repanálisis de transcriptoma orted en embriones jóvenes que utilizan ya sea microdisección de captura por láser (LCM) de tejidos embrionarios de semillas secciones fijas 4 o extracción manual de los embriones individuales desde dentro de las semillas utilizando herramientas finas 5. Sin embargo, equipos de LCM no está comúnmente disponible y la extracción manual de embriones en las primeras etapas es mucho tiempo y que requiere excelentes habilidades de disección que no son fácilmente transferibles. Además de los análisis de todo el genoma, en el análisis de expresión génica in situ también son difíciles de realizar en los jóvenes, todo el montaje embriones de Arabidopsis. Hasta cierto punto, los embriones jóvenes pueden ser liberados en portaobjetos de microscopio por una suave presión sobre las semillas y se utilizan para ensayos de genes informadores o la detección de proteínas mediante inmunotinción (por ejemplo, véase 6,7). Esta técnica, sin embargo, no permite el aislamiento de embriones de alto rendimiento, lo que dificulta los análisis cuantitativos.
Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo eficiente y rápidapara el aislamiento del embrión a partir de semillas de Arabidopsis que es fácil de configurar, fácil de transferir, y adecuado para una variedad de aplicaciones posteriores. El principio básico es machacar suavemente las semillas - disecado de silicuas jóvenes en un tubo Eppendorf con una mano de mortero de plástico en un tampón de aislamiento adecuado. El extracto de la semilla se coloca en gotas sobre un portaobjetos de múltiples pocillos y se analiza para detectar la presencia de embriones liberados en la etapa deseada usando un microscopio invertido. Los embriones se recogieron usando un vaso capilar se une a un microinyector o una pipeta de laboratorio estándar. Para aplicaciones moleculares, los embriones se lavan dos veces por la liberación repetida en gotas de nuevo tampón de aislamiento antes de transferirlos a la memoria intermedia de destino en un volumen mínimo. Para aplicaciones citológicas (reportero ensayos, inmunotinción, pescado), etapas de lavado se pueden omitir.
El método ofrece varias ventajas: (i) que produce 25-40 embriones en ~ 45 min para aplicación citológicocaciones o en 3-4 horas para aplicaciones moleculares (incluyendo los pasos de lavado), (ii) que permite el aislamiento de las etapas embrionarias específicas, (iii) que es fácilmente transferible a otras personas y laboratorios debido a su configuración sencilla, (iv) requiere un equipo asequible para la configuración básica que es susceptible de mejoras, y (v) que se utilizó con éxito para diversas aplicaciones aguas abajo, tales como la secuenciación de ARN 8, el análisis de la metilación del ADN de genes específicos de 9, los ensayos de reportero (10 y Raissig et al., en prep.) y FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédita, ver Figura 5).
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Protocol
El procedimiento se resume en el diagrama de flujo mostrado en la Figura 1. El microcapilares y la configuración instrumentales se muestran en la Figura 2 y la Figura 3, y los pasos típicos de aislamiento embrión se muestran en la Figura 4.
1. Material y Preparación Tampón
1.1 silicio de revestimiento de vidrio microcapilares
- Coloque el microcapilares en un tubo Falcon de 15 ml con 5 ~ ml de Sigmacote (Sigma) y se invierte varias veces.
- Retirar la solución, colocar el tubo Falcon que contiene los capilares en una lámina de aluminio y hornear durante 3 horas a 60 ° C. Guarde a temperatura ambiente.
1.2 Obtención de ~ 50 a 100 micras de diámetro consejos microcapilares
- Tire de 1 mm de diámetro capilares de vidrio, ya sea manualmente sobre un mechero Bunsen o mediante el uso de un extractor comercial (vertical filamento extractor o extractor de micropipeta).
- Utilice un diamantela punta del lápiz o cuchilla para cortar la punta del capilar tirado para crear la abertura deseada. Seleccione la mejor forma de capilares bajo un microscopio estereoscópico. La abertura debe ser de 50-100 micras (Figura 2).
1.3 Preparación del portaobjetos
- Siliconize portaobjetos limpios, cubriendo todos los pocillos con Sigmacote (~ 1 ml / diapositiva) durante 5 min, eliminar. Hornear 3 hr en papel de aluminio. Guarde a temperatura ambiente.
- Lavar los pocillos múltiples portaobjetos de microscopio de vidrio durante 10 min en 10% de SDS, 2 x 2 min en agua libre de nucleasa (autoclave DEPC-ddH 2 O), 2 min en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 100%, con aire secar. Todos los pasos se realizan en jarras Coplin autoclave. Las diapositivas se pueden volver a utilizar varias veces proporcionando una limpieza a fondo entre cada uso.
- Justo antes de la propagación aislamiento embrión ~ 0,5 l de 10 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) con una pipeta sobre toda la superficie de cada pocillo y secar al aire.
1.4 Microscopio y configuración capilar
<ol>1.5 Buffers
La Tabla 1 enumera los tampones de aislamiento y de destino en función de las aplicaciones posteriores.
- Prepare ~ 1 ml de tampón de aislamiento por muestra justo antes de su uso y mantener en hielo.
- Preparar el tampón de destino en un tubo de baja de unión a 0,5 ml Eppendorf en hielo (aplicaciones moleculares) o en un portaobjetos de microscopio (aplicaciones citológicas) en una cámara húmeda.
2. Disección Semilla y Extracción de Embriones
2.1 Sincronización de Mejoramiento de Semillas
- Emasculate flores y mantenerlos 2 días en la cámara de crecimiento, mientras que evitando el contacto de los pistilos expuestas con otras flores, a continuación, polinizar ellos (por ejemplo, 11).
- Prueba de la etapa de desarrollo bajo sus condiciones de crecimiento mediante la investigación microscópica de semillas despejadas. Con nuestras condiciones de crecimiento (16 horas de luz a 21 ° C, 8 horas de oscuridad a 18 ° C y 70% de humedad) semillas recogieron 2,5 días después de la polinización (DAP) produjeron principalmente 2-4 células de embriones y semillas recogieron 3,5-4 DAP produjo globular embriones.
2.2 Disección Semillas y Ruptura
- Retire la sEEDS 10-15 silicuas (~ 2,5 DAP) bajo un microscopio estereoscópico con pinzas y agujas de insulina.
- Sumerja las semillas en 20 tampón de aislamiento l en un tubo Eppendorf de fondo redondo de 2 ml se coloca en hielo.
- Aplastar suavemente las semillas con una mano de mortero de plástico (previamente limpiada con 10% de SDS, se enjuagó con DEPC-ddH 2 O y se lavó con etanol al 70%) para liberar los embriones hasta que el extracto de semilla está nublado. La fuerza a aplicar debe ser determinado por cada usuario al ensayo.
- Enjuagar el mortero con 300 l de tampón de aislamiento para lavar la mano del mortero y diluir la muestra.
- Spin-hacia abajo el extracto a 5000 xg durante 5 seg. Resuspender suavemente el extracto de sedimento con la pipeta hacia arriba y abajo 2-3 veces.
- Filtrar el extracto con 30 micras de malla de nylon (montado en adaptadores de tubo, por ejemplo, de PartecCelltricks). Enjuague la malla con un tampón de aislamiento adicional de 200 l.
3. Aislamiento de embriones
3.1 Preparación del portaobjetos
- <li> Colocar un portaobjetos de pocillos múltiples limpio, BSA recubierto y siliconado sobre la platina del microscopio invertido, resuspender el extracto de semilla de filtrado por pipeteado suavemente hacia arriba y hacia abajo y pipetear 2 gotas de extracto de semilla de 40-50 l en 1 o 2 pozos . El cribado sólo 1 o 2 gotas a la vez evita la evaporación de la muestra.
- Lugar 50 l de tampón de aislamiento fresca (1 st gota lavado) en un pocillo de una diapositiva diferente preparado como antes. Conserva esta diapositiva en una cámara cubierta y húmeda para evitar la evaporación.
3.2 pantalla, limpiar, recoger
- Pantalla de las gotas de extracto de semilla de embriones en la etapa deseada con el objetivo de 10 aumentos. Si es necesario, confirme el escenario con 20 aumentos. Los embriones generalmente se hunden en la parte inferior de la corredera.
- Eliminar manualmente los desechos alrededor del embrión con una aguja de tungsteno, una aguja de insulina o un equipo similar.
- Mueva el capilar de vidrio cerca del embrión utilizando el micromanipulador, take el embrión con el mínimo posible de solución.
- Recoge varios embriones (por ejemplo, todos de una gota) y liberarlos en la 1 ª caída de lavado (solicitud molecular) o en el búfer de destino (aplicaciones citológicas). Cada ronda de recolección debe mantenerse dentro de 5-10 min y embriones deberán ser recogidos en un volumen mínimo (el volumen total de todas las rondas de recolección debe ser <5 l).
- Repita la selección y recolección hasta que la cantidad deseada de embriones se recoge en la 1 ª caída de lavado (en el centro, si es posible, para facilitar la recolección).
- Recordar todos los embriones a la vez desde la caída de lavado (si los residuos se llevan encima, quitar con una aguja antes de recogimiento).
- Suelte los embriones en una 2 ª caída de lavado de 50 l. Repita 3.2.6.
- Suelte los embriones en el búfer de destino. La transferencia debe implicar sólo un contacto y no inmersión de la punta capilar.
- Vuelva a colocar la microcapilLary para la siguiente muestra.
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Representative Results
Nuestro procedimiento de aislamiento del embrión (Figura 1) permite el aislamiento de hasta 40 embriones en 4 horas si se procede con los lavados, por ejemplo, para aplicaciones moleculares, o en menos de una hora si lavados se omiten, por ejemplo, para aplicaciones de citológicos. Figura 2 muestra alta y baja consejos microcapilares de calidad y la Figura 3 muestra la configuración de la máquina de aislamiento de embrión. Figura 4 muestra el proceso de aislamiento de los embriones en el microscopio invertido.
Hemos aplicado con éxito nuestro procedimiento para varias aplicaciones publicadas en varios artículos recientes. El método fue desarrollado originalmente para analizar la contribución de los padres a principios del transcriptoma embrionario. Embriones híbridos generados a través de los cruces entre dos accesiones diferentes de Arabidopsis (Landsberg erecta (L er) y Columbia (Col-0)) fueron aislados en la etapa de 2-4 células. Se extrajo el ARN total, ADNcbibliotecas se produjeron utilizando amplificación lineal y secuenciados en una plataforma sólida. Los transcriptomes alelo-específicas se generaron sobre la base de análisis de SNP 8. Para controlar nuestras bibliotecas de ADNc de embriones antes de la secuenciación se amplificó transcripciones embrión-específicos, WUSCHEL-homeobox 2, 8 y 9 (WOX2, WOX8, WOX9) y actina 11 (13,14, Figura 5A).
Adicionalmente, se utilizó este método para aislar embriones jóvenes para analizar los patrones de metilación del ADN-embrionarias en loci específicos en el genoma. Los embriones se aislaron y se lavaron en 1 x tampón TE. Secuenciación de bisulfito de pequeña escala se realizó tal como se describe 9,15.
Del mismo modo, el aislamiento de embriones ha demostrado ser muy útil en ensayos de gen reportero con baja expresión embrionaria, y donde la cubierta de la semilla materna confunde detección o está enmascarado por la expresión de reportero en los tejidos que rodean el embrión (endospermo, cubierta de la semilla). Los embriones carr ying el transgén reportero se tiñen (ß-glucuronidasa; GUS) o directamente analizada (proteína fluorescente verde o rojo; GFP, RFP) después del aislamiento. Un ejemplo se da en la Figura 5B para los embriones que expresan un gen indicador GUS bajo el control del promotor de MEDEA (p MEA) 10. La relativa facilidad con la que muchos embriones se pueden aislar también permite análisis cuantitativos (por ejemplo, número de embriones teñidos en diferentes fondos genéticos, Raissig, Grossniklaus et al., En preparación).
Por último, se aplicó con éxito Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) y las técnicas de inmunotinción para estudiar la arquitectura nuclear en embriones aislados incrustado en las almohadillas de acrilamida en las diapositivas. Un ejemplo de FISH utilizando sondas contra las repeticiones centrómero y regiones organizadoras del nucléolo se muestra en la Figura 5C.
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Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de aislamiento del embrión El protocolo se divide en tres partes: 1 - Preparación del material; 2 - disección de semillas; 3 - Aislamiento de embriones..
Figura 2. Consejos microcapilares. A. consejos microcapilares de alta calidad con una apertura sin problemas de unos 100 m. B. Recomendaciones microcapilares de baja calidad con amplia apertura y el contorno irregular (los consejos son aceptables sólo para aplicaciones citológicas). Barra de escala: 2 mm.
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Figura 3. Puesta en marcha de un microscopio aislamiento embrión. A. y B. cribado se realiza en el microscopio en un microscopio invertido. Los embriones se recogieron usando un vaso capilar se fija en un micromanipulador para controlar con precisión su posición (véase también la Figura 4) y conectado a ya sea un microinyector (A) o estándar de laboratorio pipeta (B). A. El vidrio microcapilar está vinculado a un hidráulicamente controlado microinyector (por ejemplo, Eppendorf célula tranvía Vario) para un control preciso durante la recogida de embriones B. El vidrio microcapilar está unido a un estándar de P-200 pipeta a través de un tubo de goma flexible. Recogida de embriones y la liberación se controla girando la rueda de calibración de la pipeta. Cut-end puntas de pipeta se utilizan como conectores y las uniones están selladas con parafilm. La microcapillary se fija en el micromanipulador través de bloques de poliestireno, tubos Falcon y cinta.
La Figura 4. Proceso de aislamiento de embriones. A. Un embrión de 2-4 células (flecha) se identificó en el extracto de la semilla (gota cribado) y está rodeado por escombros (fragmentos de testa). B. Los escombros que rodea fue retirado manualmente con una aguja. C. El capilar de vidrio se mueve a la derecha al lado del embrión (flecha). D. El embrión se recogió y es ahora dentro de los capilares (flecha). E. Varios embriones en la última gota después de lavados. Escala = 50 micras.
F igura 5. Aplicaciones posteriores de aislamiento embrión A. análisis de expresión génica.: Amplificación por PCR de WOX9, WOX2, WOX8 y ACTIN11 13,14 en bibliotecas de cDNA (generado como se describe 8) 2-4 células de embriones se lavaron 1x veces (primera pista) y genómica . DNA (segundo carril) B. ensayo Periodista: Un embrión de 8 células aisladas de plantas portadoras ap MEA :: GUS construir se tiñó en una diapositiva de una solución estándar de tinción GUS (reproducido de Raissig et al, 2011, después de la autorización de la. Plant Cell, ASPB copyright). C. Hibridación Fluorescente In Situ (FISH): un embrión de 8 células se hibridó con sondas contra centroméricas repite (rojo), y 45S rDNA repite (verde) antes de inmunodetección indirecta 16. Las imágenes PESCADO dos colores se cubrieron con la contratinción DAPI e imágenes (DIC microscopio de epifluorescencia DM6000B, Leica, Alemania).
| Aplicación | Tampón de aislamiento | Búfer de destino |
| Extracción de ARN (por ejemplo, para la amplificación y transcriptómica) | 1x tampón primer capítulo (Invitrogen), DTT 1 mM, 4% RNaseOUT | Tampón de extracción de ARN |
| Extracción de ADN (por ejemplo, para la secuenciación de bisulfito) | 100 mM de Tris, 10 mM de EDTA, pH 8 (TE) | Extracción de ADN tampón o tampón TE 1x |
| Análisis reportero GFP | 1 M glicina en 0,5 x MS 1 | 1 M glicina en 0,5 x MS |
| Análisis de GUS reportero | buffer de tinción 2 sin X-Gluc (sustrato) | tampón de tinción con X-Gluc (sustrato) |
| PESCADO Y inmunotinción | Fosfato 100 mM de solución salina tamponada (PBS) | Acryl activado: mix Bisacryl (33:3) en un Superfrost Plus diapositivas polimerizar durante 30 min |
Tabla 1. Tampones de aislamiento y de destino para diferentes aplicaciones posteriores. Los tampones se pueden adaptar a las necesidades experimentales específicas. 1 Murashig y Skoog. 2 por ejemplo, Jefferson et al., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
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Discussion
Hemos desarrollado un protocolo de aislamiento embrión que es rápida, eficaz, y se puede transferir fácilmente a otros laboratorios.
El equipo descrito aquí consiste en un microscopio invertido, un micromanipulador, vidrio microcapilares, un extractor de filamento vertical y un microinyector (Figura 3A). La configuración es similar a la descrita para el aislamiento de células animales solo para los análisis de transcriptómica 17. También trabajamos con éxito con una configuración más básica que el vidrio microcapilares se estira manualmente sobre una llama (y cortar con una cuchilla de diamante) y es operado a través de una pipeta de laboratorio estándar (Pipetman P-200) en lugar de un microinyector (Figura 3B). En ese caso el microcapillary se adjuntó a la pipeta a través de un tubo de goma. 10 l Filtertips fueron utilizados para hacer las uniones, que se envuelven con parafilm para hacerlos estanco al aire. El capilar - en poder de la punta de pipeta - se fijó en el micrbrazo omanipulator utilizando bloques de poliestireno y cinta (Figura 3B). Esta configuración básica ha demostrado ser eficiente y confiable 8. Sin embargo, una de las principales dificultades fue el mantenimiento de las uniones herméticas entre el microcapilar y la pipeta, especialmente cuando se cambia el capilar. Verificación y ajuste de la presión en el capilar - para asegurar una recogida de embriones afinado en un volumen mínimo - puede llevar mucho tiempo con esta configuración básica. La mejora de la instalación con un micromanipulador controlado hidráulicamente y un extractor de filamento vertical es una mejora considerable y ahorra tiempo.
Las habilidades requeridas para la aplicación exitosa de este método son fácilmente transferibles. Cinco usuarios en nuestro laboratorio aprendieron con éxito el método en un tiempo relativamente corto. Algunas simplificaciones del protocolo son posibles dependiendo de la facilidad del usuario en la manipulación. Por ejemplo, es posible omitir los pasos 2.2.5 y 2.2.6, mientrasla disección de sólo 5 silicuas (en lugar de 15) y la limpieza de los alrededores de embrión de fondo a partir de los desechos con una aguja de tungsteno (este procedimiento se aplicó en 8). La sincronización de desarrollo de la semilla a través de la emasculación y polinización retardada es facultativa, pero recomienda aumentar el número de embriones en la misma etapa de desarrollo, particularmente en las primeras etapas. Además, el aislamiento embrión puede ser acelerada si se omiten las etapas de lavado, por ejemplo, para aplicaciones citológicas. Además, siliconización diapositiva (paso 1.3.2) no es necesario para los usuarios que trabajan rápidamente, de tal manera que los embriones que se adhieren a la superficie del vidrio en el tiempo no es un problema.
Ya sea filtrado o sea de aplicación la limpieza manual, es muy importante para evitar el arrastre de restos de tejido que crea la contaminación potencial de ARN intermedios o aplicaciones de ADN. Esta cuestión se planteó recientemente en un estudio de perfiles de transcriptoma utilizando un método diferente de aislamiento de embriones18. Por contraste con el protocolo de aislamiento de embriones mayor descrito aquí, los autores diseccionan embriones Arabidopsis manualmente desde dentro de cada semilla con agujas finas, un procedimiento largo que requiere excelentes habilidades de disección. Este procedimiento aparentemente requiere 2 o más lavados para evitar el arrastre de las posibles células contaminantes del tejido que rodea las semillas, una situación que se encuentra cuando se utiliza este método, dado el pequeño tamaño de los embriones, las dificultades para acceder a ellas con agujas de disección y la adhesividad de las células circundantes. Por el contrario, nuestro procedimiento permite (i) la dilución de los embriones-extruido a partir de las semillas al triturarse-y rodea los desechos en un gran volumen (500 l) antes de la recolección de embriones, (ii) la selección visual de los embriones carentes de adhesivo, contaminando escombros, y (iii) la dilución de la posible contaminación de ARN-fugas de ruptura de las células por las etapas de lavado. Si bien es posible utilizar sólo un paso de lavado si elembriones parecen muy limpias y son recogidos en menos de 5 l 8, una segunda etapa de lavado es recomendable, especialmente para los usuarios de primera vez que pueden recoger los embriones de varias rondas (es decir, con un volumen de aditivo). Los embriones se deben recoger en el menor posible de solución, lo que permite la dilución máxima de contaminantes potenciales en cada etapa de lavado. Cada ronda de recogida debe mantenerse corto (dentro de 5-10 minutos) para permitir la máxima recuperación en caso de liberación en la gota de lavado (ya presencia en el capilar tiende a reducir la tasa de recuperación). Además, la transferencia de los embriones recolectados en el medio de extracción (tras los pasos de lavado) sólo debe implicar un contacto con la abertura de la punta microcapilar y no inmersión de la punta, ya que esto podría así transferir los desechos se pegue en la pared por encima de microcapilar la apertura. Por último, el capilar debe cambiarse entre cada nuevo extracto de semilla.
El protocolo permite varias bajadasaplicaciones tream por el simple uso de un tampón de aislamiento adecuado que preservar la integridad molecular de ARN, ADN, cromatina, reportero enzima o fluorescente. Se aislaron con éxito embriones en tampón de aislamiento de ARN-protector para la extracción de ARN y análisis transcriptómica 8, 1x de tampón TE para los análisis de metilación del ADN 9, fosfato 100 mM de solución salina tamponada (PBS) para FISH y la inmunotinción (Jaenisch, Grossniklaus y Baroux, no publicado, la figura 5C), y la solución de tinción sin sustrato para los ensayos de reportero GUS (19, Figura 5B). La aplicación más sensible a las condiciones de aislamiento / calidad de embriones es, sin duda ARN extracción y amplificación. La cantidad de ARN extraído de embriones aislados fue más bien baja. De ~ 30 embriones en la etapa de célula de 2-4 (60-120 por lo tanto, las células en total) que estima una cantidad de ~ 1 ng de ARN total sobre la base de tanto Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) y mediciones qubit (Invitrogen). Following RNA de extracción, la calidad del ARN se verificó en un Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies). Sin embargo, la baja cantidad de ARN extraído no siempre es suficiente para producir un perfil fiable. Por lo tanto, más pruebas se deben hacer en el material amplificado (cDNA) (por ejemplo, PCR detectar bajos expresó, genes específicos de embrión y / o un perfil Bioanalyzer).
Por último, la capacidad de aislar embriones por criterios visuales en nuestro protocolo es un gran activo. Los embriones de la misma silicua (fruta Arabidopsis) no desarrollan sincrónicamente. Por lo tanto, trabajando en extractos silicua enteros (por ejemplo, para los análisis de RT-PCR o ensayos cuantitativos reportero) no permite una perfecta correlación con una etapa de desarrollo determinada. Aislamiento de embriones en una etapa específica del desarrollo soluciona este problema. Además, un problema similar se presenta cuando se trabaja con mutantes heterocigotos donde silicuas contienen diferentes genotipos de embriones. Aislamiento de embriones en base a criterios visuales para distinguish por ejemplo, de tipo salvaje de fenotipos mutantes de embriones permite correlacionar los análisis posteriores con el genotipo. Lo hemos hecho con éxito para analizar la metilación del ADN en loci específicos en diferentes genotipos 20.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Tal Nawy y Martin Bayer por sus consejos sobre el aislamiento del embrión. MTR, VG, UG y CB idearon el equipo de aislamiento de embriones. MTR, VG y CB desarrollaron el protocolo de aislamiento de embrión. MTR, VG y CB establecen el protocolo, aislaron los embriones, y el embrión generado cDNA, VG realizó la PCR, MTR la tinción GUS, JJ experimentos de los peces. MTR, VG, CG UG y escribió el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Zürich, una beca de la Fundación de Investigación de Roche (a MTR), y subvenciones de la Fundación Nacional de Suiza (a la UG y CB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
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