Summary
우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한 방법을보고
Abstract
배유 - - 임산부 씨 integuments (또는 종피)에 의해 둘러싸여 현화 식물에서 배아 영양 조직 내에서 개발하고 있습니다. 결과적으로, 초기 단계 (구상 단계 1 셀)에서 식물의 배아의 분리가 기술적으로 상대적인 어려움으로 인해 도전합니다. 초기 단계에서 효율적인 수동 박리 강력 젊은 애기 씨의 작은 크기와 주변 조직에 배아의 부착에 의해 손상된다. 여기, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간 40 배아까지 항복, 젊은 애기 태아의 효율적인 분리를 허용하는 방법을 설명합니다. 배아는 약간 에펜 도르프 튜브에 플라스틱와 유 봉, 250-750 씨앗을 분쇄하여 분리 버퍼에 해제됩니다. 유리는 표준 실험실 피 펫 중 하나에 연결 microcapillary (고무 튜브를 통해) 또는 유압 제어 microinjector은 방울 곳에서 배아를 수집하는 데 사용됩니다거꾸로 광학 현미경에 다 잘 슬라이드 라. 필요한 전문 기술은 간단하고 쉽게 양도 할 수 있으며, 기본 설정 값 비싼 장비를 필요로하지 않습니다. 수집 된 배아는 RT-PCR, RNA 서열, DNA 메틸화 분석, 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광 면역 염색 및 리포터 유전자 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합합니다.
Introduction
현화 식물의 배아는 배젖, 두 번째 수정 이벤트에서 파생 된 영양 조직으로 둘러싸여 있습니다. 모두 배아와 배유가 종피의 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 종합적으로 이러한 조직은 과일 내부 개발 종자를 형성한다. 따라서, 조직 및 애기 장대 배아의 세포 별 분석은 강력하게 자신의 어려움으로 인해 손상됩니다. 그럼에도 불구하고, 늦은 구형 또는 이후 단계에서 배아는 비교적 잘 입체 현미경 하에서 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 수동으로 해부 의무, 또는 그들을 추출하는 집게를 사용하여 초기에 약간의 압력을 적용하여 있습니다. 이러한 기술은 성공적으로 사체 또는 마이크로 어레이 하이브리드, 바이 설 파이트 시퀀싱, 또는 RNA 시퀀싱 (예 1-3)으로 epigenome 프로파일 분석에 사용 하였다. 반면, 초기 구상 단계에 수정란에서 배아의 연구는 기술적으로 도전 남아있다. 지금까지 몇 연구 담당자가고정 씨앗 섹션 4 좋은 도구 5를 사용하여 종자 내에서 개별 배아의 수동 추출에서 배아 조직 중 하나 레이저 캡처 microdissection을 (LCM)를 사용하여 젊은 배아 orted 사체 분석. 그러나 LCM 장비 초기 단계에서 일반적으로 사용되는 수동 배아 추출되지 않습니다 것은 시간이 쉽게 양도 할 수 없습니다 뛰어난 절개 기술을 소모하고 필요로하는 것입니다. 게놈 넓은 분석뿐만 아니라, 현장에서 유전자 발현 분석도 애기 장대의 젊은, 전체 마운트의 배아에서 수행하기가 어렵습니다. 어느 정도 젊은 배아는 씨앗 부드러운 압력에 의해 현미경 슬라이드에 해제 할 수 있습니다 (예를 들어 6,7 참조) 면역 염색하여 리포터 유전자 분석 또는 단백질 검출에 사용됩니다. 이 기술은, 그러나, 따라서 정량 분석을 방해, 높은 처리량 배아 분리를 허용하지 않습니다.
그러므로, 우리는 효율적이고 빠른 프로토콜을 개발쉽게 양도 및 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합한 설정이 간단하고 애기 장대 씨앗에서 초기 배아 분리합니다. 적절한 분리 버퍼에 플라스틱 유봉을 사용하여 에펜 도르프 튜브에 젊은 siliques에서 해부 - 기본 원칙은 부드럽게 씨앗을 분쇄하는 것입니다. 종자 추출물은 다 잘 슬라이드에 방울에 배치되어 거꾸로 현미경을 사용하여 원하는 단계에서 출시 된 배아의 존재 여부를 검사합니다. 배아는 유리 microinjector 또는 표준 실험실 피펫에 부착 microcapillary 사용하여 수집됩니다. 분자 응용 프로그램의 경우, 배아는 최소한의 볼륨에서 대상 버퍼로 전송하기 전에 새로운 절연 버퍼의 방울에 반복 릴리스 회 세척한다. 세포 학적 응용 프로그램 (기자 분석, 면역 염색, FISH)의 경우, 세척 단계는 생략 할 수 있습니다.
방법은 여러 가지 장점을 제공합니다 : (i)는 세포 학적 응용을위한 45 분 ~에 25-40 배아를 산출분자 응용 프로그램 (세척 단계 포함) lications 3-4 시간에서, (II) 그것은 특정 배아 단계의 분리는, (III)는 (IV), 쉽게 단순 설정에 따라 다른 사람과 실험실에 양도 할 수 있습니다 , 업그레이드에 대한 의무가 기본 설정을위한 저렴한 장비를 필요로하고, (v)이 성공적으로 RNA 염기 서열 8, 유전자의 특정 DNA 메틸화 분석 9, 기자 분석 (10 Raissig 등. 등 다양한 다운 스트림 응용 프로그램에 사용 된 의 준비.) 및 FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux되지 않은,)는 그림 5를 참조하십시오.
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Protocol
절차는 그림 1의 순서도에 요약되어 있습니다. microcapillaries과 악기 설정은 그림 2와 그림 3에 표시되고, 배아 분리의 일반적인 단계는 그림 4에 표시됩니다.
1. 재료 및 버퍼 준비
유리 microcapillaries 1.1 실리콘 코팅
- Sigmacote (시그마)의 ~ 5 ml의 15 ML 팔콘 튜브에 microcapillaries를 놓고 여러 번 반전.
- 용액을 제거, 60 ℃에서 알루미늄 호일에 모세 혈관을 포함 팔콘 튜브를 배치하고 3 시간을 위해 그들을 구울 상온에서 보관하십시오.
1.2 ~ 50-100 μm의 직경 microcapillary 정보를 얻을
- 수동 분젠 버너를 통해 또는 상용 풀러 (수직 필라멘트 끌어 당기는 사람 또는 micropipette의 풀러)를 사용하여 하나 1mm 직경의 유리 모세관을 당기십시오.
- 다이아몬드를 사용팁 펜이나 원하는 구멍을 만들 뽑아 모세관의 끝 부분을 잘라 블레이드. 스테레오 현미경 제일 모양의 모세 혈관을 선택합니다. 오프닝은 50 ~ 100 μm의 (그림 2)이어야한다.
1.3 슬라이드 준비
- 5 분 Sigmacote (~ 1 ML / 슬라이드) 모든 우물을 커버하여 깨끗한 슬라이드를 Siliconize, 제거합니다. 알루미늄 호일 빵 3 시간. 상온에서 보관하십시오.
- 10 % SDS, nuclease가없는 물에 2 × 2 분 (DEPC-DDH 2 O를 압력 가마로 소독), 70 % 에탄올에서 2 분, 100 % 에탄올에 2 분에서 10 분 동안 다 잘 유리 현미경 슬라이드를 씻어 공기 건조. 모든 단계는 멸균 코 플린 단지에서 수행됩니다. 슬라이드는 각각의 사용과 철저한 청소를 제공하는 여러 번 다시 사용할 수 있습니다.
- 직전 배아 분리 확산 ~ 10 0.5 μL MG / ML 소 혈청 알부민 (BSA) 각 잘 공기 건조의 전체 표면에 피펫.
1.4 현미경 및 모세관 설정
<OL>1.5 버퍼
표 1은 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 분리 및 대상 버퍼를 보여줍니다.
- ~ 샘플 당 1 ML 절연 버퍼 갓 전에 사용하고 얼음에 보관 준비.
- 얼음 (분자 응용 프로그램) 또는 습기 챔버 현미경 슬라이드 (세포 학적 응용 프로그램)에서 0.5 ML Eppendorf의 낮은 바인딩 튜브 대상 버퍼를 준비합니다.
2. 씨앗 해부 및 배아 추출
종자 개발 2.1 동기화
- 꽃 거세와 다른 꽃과 노출 암술의 접촉을 피하면서 그 성장 챔버 2 일 보관 후, 그들 (예 : 11) 수분.
- 취소 씨의 현미경 조사하여 성장 조건에 따라 개발 단계를 테스트합니다. 4 DAP는 구상 굴복 - 우리의 성장 조건에 씨앗 (DAP) 수분 후 2.5 일 수집 (21에서 16 시간 빛 ° C, 18, 어두운 8 시간 ° C 및 70 % 습도) 주로 2-4 배아와 씨앗은 3.5 수집 나왔고 배아.
2.2 씨의 해부 및 파열
- 의 제거를포셉과 인슐린 바늘 입체 현미경 하에서 15 siliques (~ 2.5 DAP)에서 eeds.
- 얼음에 배치 2 ㎖ 둥근 바닥 에펜 도르프 튜브에 20 ㎕의 절연 버퍼에 씨앗을 담가.
- 조심스럽게 씨앗 추출물 흐린 때까지 배아를 풀어 플라스틱 유봉 (DEPC-DDH 2 O로 세척, 10 % SDS로 미리 청소하고 70 % 에탄올로 세척)에 씨앗을 분쇄. 적용 할 힘은 재판시 모든 사용자에 의해 결정되어야한다.
- 유봉을 씻어 샘플을 희석 분리 버퍼 300 μL와 유봉을 씻어.
- 스핀 다운 5 초 동안 5,000 XG에서 추출합니다. 부드럽게 위아래 2 ~ 3 번 pipetting하여 펠렛 추출물을 resuspend을.
- 30 μm의 나일론 메쉬 (PartecCelltricks에서 예를 들어, 튜브 어댑터에 장착)와 추출물을 필터링합니다. 추가 200 μL 절연 버퍼 메쉬를 씻어.
3. 배아 분리
3.1 슬라이드 준비
- <리> 장소 거꾸로 현미경의 무대에 깨끗하고, BSA 코팅 및 실리콘 처리 다 잘 슬라이드 위아래로 부드럽게 pipetting하여 필터링 씨 추출물을 resuspend을 1 또는 2 우물에 40-50 μL 씨 추출물 2 방울을 피펫 . 한 번에 1 ~ 2 방울을 선별하여 샘플의 증발을 방지합니다.
- 이전으로 준비 다른 슬라이드의 잘에 신선한 격리 버퍼의 장소 50 μL (1 차 세척 드롭). 증발을 방지하기 위해 덮인, 습기 챔버에이 슬라이드를 유지합니다.
3.2 스크린, 청소, 수집
- 10X 배율 목적으로 원하는 단계에서 배아 종자 추출물의 방울을 화면. 필요한 경우, 20 배 배율로 단계를 확인합니다. 태아는 일반적으로 슬라이드의 바닥에 가라.
- 수동 텅스텐 바늘, 인슐린 바늘 또는 이와 유사한 장비와 배아 주위에 파편을 제거합니다.
- micromanipulator에, T를 사용하여 배아 근처 모세관 유리를 이동가능한 적은 솔루션으로와 배아까지 아케.
- 여러 개의 배아를 (예를 들어, 모두 한 방울의) 수집 및 1 차 세척 드롭 (분자 응용 프로그램) 또는 대상 버퍼 (세포 학적 응용 프로그램)에서 그들을 놓습니다. 각 수집 라운드 최소 볼륨 (모든 수집 라운드의 총 볼륨이 <5 μL이어야한다)에서 수집해야 5-10 분, 배아 내에서 유지되어야한다.
- 배아의 원하는 양 (중앙, 가능하면 기억을 용이하게하기 위해) 1 차 세척 드롭 수집 될 때까지 검사와 컬렉션을 반복합니다.
- 세척 드롭 (파편이 이월 된 경우, 기억하기 전에 바늘을 제거)에서 한 번에 모든 배아를 채취.
- 50 μL의 2 차 세척 드롭으로 배아를 놓습니다. 3.2.6 반복합니다.
- 대상 버퍼에 배아를 놓습니다. 전송은 모세관 끝의 유일한 접촉, 그리고 침수를 포함해야합니다.
- microcapil를 교체다음 샘플을 위해 라히.
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Representative Results
세척이 분자 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 수행하는 경우에 우리의 배아 분리 절차 (그림 1) 4 시간 40 배아까지의 분리를 허용하거나, 시간 미만의 세척은 생략 세포 학적 응용 프로그램의 예 경우. 그림 2는 표시 높고 낮은 품질 microcapillary 팁과 그림 3은 배아 분리 시스템의 설정을 보여줍니다. 그림 4는 거꾸로 현미경에서 배아 분리의 과정을 표시합니다.
우리는 성공적으로 몇 가지 최근 기사에 게시 된 다양한 애플리케이션을위한 우리의 절차를 적용했다. 이 방법은 원래 초기 배아 사체에 대한 부모의 기여도를 분석하기 위해 개발되었다. 두 개의 서로 다른 애기 accessions (란츠 베르크 erecta (L 어)와 컬럼비아 (골-1)) 사이의 교차를 통해 생성 된 잡종 배아는 2-4 세포 단계에서 분리 하였다. 총 RNA를 추출, cDNA를라이브러리는 선형 증폭을 사용하여 생산하고 견고한 플랫폼에 순서가되었다. 대립 유전자 특정 transcriptomes은 SNP 분석 8을 기반으로 생성되었다. 우리는 이전에, WUSCHEL-호 메오 박스 (homeobox) 2, 8, 9 (WOX2, WOX8, WOX9)과 액틴 11 (13,14, 그림 5A)를 배아 별 성적을 증폭 순서에 우리의 배아의 cDNA 라이브러리를 제어 할 수 있습니다.
또한이 방법은 게놈의 특정 유전자좌에서 배아 DNA 메틸화 패턴을 분석하는 젊은 배아를 분리하는 데 사용되었다. 배아는 고립 1X TE 버퍼로 세척 하였다. 9,15 설명 된대로 소규모 바이 설 파이트 시퀀싱을 수행 하였다.
마찬가지로 배아 격리 낮은 배아 표정으로 기자의 유전자 분석에 매우 유용하게 입증하고 있으며, 산모의 종피 탐지를 혼동하거나 배아 (배유, 종피)를 둘러싼 조직에서 기자 식으로 마스크입니다. 배아 카 (; GUS β-글루 쿠로) 또는 직접 (녹색 또는 빨간색 형광 단백질, GFP, RFP) 분석 리포터 유전자를 잉 물들 격리 다음. 예 MEDEA 프로모터 (P MEA) 10의 통제하에 GUS 리포터 유전자를 표현 배아 그림 5b에 제시되어있다. 상대적으로 많은 배아를 분리 할 수있는 편의성 또한 정량 분석 (다른 유전 적 배경, Raissig, Grossniklaus 등 스테인드 배아의 예 수. 준비) 할 수 있습니다.
마지막으로, 우리는 성공적으로 제자리 교잡 (FISH)와 슬라이드에 아크릴 아미드 패드에 내장 고립 된 배아의 핵 구조를 연구하는 면역 염색 기술의 형광 적용했다. 중심 소체 반복하고 nucleolar 조직 지역에 프로브를 사용하여 물고기의 예는 그림 5C에 표시됩니다.
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그림 1. 배아 분리 절차의 흐름도 프로토콜은 세 부분으로 나누어 져 있습니다 : 1 - 재료 준비, 2 - 시드 해부, 3 - 태아 격리..
그림 2. Microcapillary 팁. 약 100 ㎛의 부드러운 개통 A. 고품질 microcapillary 팁. 넓은 개방과 불규칙한 컨투어 B. 품질이 낮 microcapillary 팁 (그 끝은 세포 학적 응용 프로그램에만 허용됩니다). 스케일 바 : 2mm.
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그림 3. 배아 분리 현미경으로 설정합니다. A.와 B 검사가 거꾸로 현미경 현미경 슬라이드에 수행됩니다. 배아는 microcapillary 정확하게 위치를 제어하는 미세 조작기에 고정합니다 (그림 4 참조) 및 microinjector (A) 또는 표준 실험실 피펫 (B) 중 하나에 연결된 유리를 사용하여 수집됩니다. A. microcapillary 유리 유압 제어에 연결되어 배아 수집 B. 동안 정밀 제어 microcapillary 유리 microinjector (예 : Eppendorf의 세포 트램 바리오)는 고무 플렉스 관을 통해 표준 P-200 피펫에 부착되어 있습니다. 배아 수집 및 자료는 피펫의 교정 휠을 회전에 의해 제어됩니다. 컷 엔드 피펫 팁은 커넥터로 사용되며 접합은 파라 필름 (parafilm)로 밀봉되어 있습니다. MIcrocapillary 폴리스티렌 블록, 팔콘 튜브 및 테이프를 통해 micromanipulator에에 고정되어 있습니다.
그림 4. 배아 분리 과정. A.는 2-4 세포 배아 (화살표)은 종자 추출물 (심사 물방울)에서 확인되었고, 파편 (종피 조각)로 둘러싸여 있습니다. 주변의 파편 바늘을 사용하여 수동으로 B. 제거되었습니다. C.는 모세관 유리 오른쪽 배아 (화살표) 옆에 이동되었습니다. D. 배아가 수집 및 세척 후 마지막 한 방울의 모세관 (화살표). E. 여러 배아에서 지금 하였다. 규모 = 50 μm의.
에프 igure 5. 배아 격리 다운 스트림 응용 프로그램 A. 유전자 발현 분석 :. PCR의 WOX9, WOX2, WOX8의 증폭 및 2-4 배아에서의 cDNA 라이브러리에 ACTIN11 13,14 (8 설명 된대로 생성) 1X 번 세척 (1 차선)와 게놈에 . DNA (2 차선) B. 리포터 분석 :. AP MEA :: GUS 구조는 표준 GUS 염색 용액에 슬라이드 (의 허가 후 Raissig 외, 2011 년부터 재현에 염색 된 휴대 식물에서 고립 된 8 셀 배아 식물 세포, ASPB 저작권). C. 형광등에 원위치 하이브리드 화 (물고기가) : 8 셀 배아 중심 소체 반복 (빨강) 및 간접 면역 16 전 45S rDNA 염기 반복 (녹색) 프로브를 교배 하였다. 듀얼 컬러 FISH 이미지는 DAPI의 counterstaining 및 DIC 이미지 (DM6000B의 epifluorescence에 현미경, 라이카, 독일)와 겹쳐 있었다.
| 신청 | 절연 버퍼 | 대상 버퍼 |
| RNA 추출 (증폭 및 전사 체학을 위해 등) | 1X 우선 물가 버퍼 (Invitrogen 사), 1 mM의 DTT, 4 % RNAseOUT | RNA 추출 버퍼 |
| DNA 추출 (바이 설 파이트 시퀀싱 등) | 100 MM 트리스, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8 (TE) | DNA 추출 버퍼 또는 1X TE 버퍼 |
| GFP 기자 분석 | 0.5에서 1 M Glycin MS 1 | 0.5 MS 1 M Glycin |
| GUS 기자 분석 | X-Gluc (기판)하지 않고 버퍼 2 염색법 | X-Gluc (기판)와 버퍼를 얼룩 |
| FISH & 면역 염색 | 100 MM의 인산은 식염수 (PBS) | 활성화 아크릴 : 30 분 Superfrost 플러스 슬라이드 중합에 Bisacryl 혼합 (33:3) |
표 1. 다른 다운 스트림 애플리케이션을위한 절연 및 대상 버퍼. 버퍼는 특정 실험 요구 사항을 적용 할 수 있습니다. 1 Murashig & 매체를 스쿡 2. 예를 들어, 제퍼슨 등., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
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Discussion
우리는 효과적인 급속 배아 분리 프로토콜을 개발, 쉽게 다른 실험실로 전송 될 수 있습니다.
여기에 설명 된 장비는 거꾸로 현미경, 미세 조작기, 유리 microcapillaries, 수직 필라멘트 풀러와 microinjector (그림 3A)으로 구성되어 있습니다. 설치가 전사 체학 분석 17 한 동물 세포 분리에 대해 설명한 것과 비슷합니다. 우리는 또한 성공적으로 유리 microcapillaries를 수동으로 불꽃을 통해 늘어 (와 다이아몬드 블레이드로 절단) 대신 microinjector의 표준 실험실 피펫 (Pipetman P-200) (그림 3B)를 통해 운영 하였다보다 기본적인 설치를했습니다. 이 경우 microcapillary은 고무 튜브를 통해 피펫에 부착되었다. 10 μL filtertips은 그들을 밀폐하기 위해 파라 필름 (parafilm)으로 포장 된 접합을 만드는 데 사용되었다. 모세 - 피펫 팁으로 개최가 - MICR에 고정 된폴리스티렌 블록과 테이프를 사용 omanipulator 암 (그림 3B). 이 기본 설정은 8 효율적이고 신뢰할 수 입증했다. 그럼에도 불구하고 주요 문제 중 하나가 모세 혈관을 변경 특히, microcapillary과 피펫 사이 공기 꽉 접합 유지했다. 확인 및 모세 혈관의 압력을 조정 - 최소 볼륨 미세 조정 배아 컬렉션을 보장하는 것은 -이 기본 설정을 사용하여 시간이 소요될 수 있습니다. 유압 제어 micromanipulator에와 수직 필라멘트 풀러와 향상된 설치는 상당한 개선하고 시간을 절약 할 수 있습니다.
이 방법의 성공적인 응용 프로그램에 필요한 기술은 쉽게 양도 할 수 있습니다. 우리 실험실에서 다섯 성공적으로 비교적 짧은 시간에 방법을 배웠습니다. 프로토콜의 일부 단순화가 가능 조작에 사용자의 편리에 따라 수 있습니다. 예를 들어, 단계 2.2.5과 2.2.6 동안 건너 뛸 수도 있습니다만 5 siliques을 (대신 15) 해부 및 텅스텐 바늘 (이 절차는 8 적용)와 파편으로부터 철저하게 배아 주변을 청소. 거세 및 지연 수분을 통해 종자 개발의 동기화는 통성이지만, 특히 초기 단계에서 동일한 발달 단계에서 배아의 수를 증가하는 것이 좋습니다. 세척 단계를 생략하는 경우 또한, 배아 분리는 세포 학적 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 신속히 처리 할 수 있습니다. 또한, 슬라이드 siliconization 단계 (1.3.2) 신속하게 작업하는 사용자를 위해, 시간이 지남에 따라 유리 표면에 충실하도록 배아는 문제가되지 않습니다 필요가 없습니다.
필터링 또는 수동 청소가 적용되는지 여부, 그것은 스트림 RNA 또는 DNA 응용 프로그램에 대한 잠재적 인 오염을 만들어 조직 파편의 이월 방지하기 위해 매우 중요합니다. 이 문제는 배아 분리의 다른 방법을 사용하여 사체 프로파일 연구에서 최근에 제기되었다18. 여기에 설명 된 대량 배아 분리 프로토콜에 대조적으로, 저자는 미세 바늘, 우수한 해부 기술을 요구하는 긴 절차를 사용하여 수동으로 개별 씨앗 내에서 Arabidopsis의 배아를 해부. 이 절차는 분명히 배아 해부 바늘을 액세스하는 어려움의 작은 크기를 지정해,이 방법을 사용하면 주변의 씨앗 조직, 가능성이 발생하는 상황에서 가능한 오염 세포 이월 방지하기 위해 2 개 이상 세척 필요하며, 접착 주변 세포. 대조적으로, 우리의 절차는 접착제없는 배아 (II) 시각적 인 선택 분쇄 및 배아 수집하기 전에 많은 양 (500 μL)의 파편을 주변에 따라 씨앗의 배아 압출의 (I) 희석, 오염, 수 파편, 가능한 RNA를 세척 단계 세포에 의하여 파열에서 오염 누출 (III) 희석. 그것은 단지 하나의 세척 단계하다면 사용할 수 있지만태아는 매우 깨끗 나타납니다 미만 5 μl의 8 수집, 두 번째 세척 단계는 특히 (첨가제 볼륨 예) 몇 라운드에서 배아를 수집 할 수 있습니다 처음 사용자에게 권장됩니다. 배아는 모든 세척 단계에서 잠재적 인 오염 물질의 최대 희석 수 있도록 가능한 한 작은 솔루션으로에 수집되어야한다. 각 수집 라운드 세척 드롭 (모세 혈관의 이상 유무 회복 속도를 감소하는 경향이있다)에 릴리스시 최대 복구를 할 수 있도록 (5-10 분 이내) 짧게 유지해야합니다. 이뿐만 아니라 파편 위의 microcapillary 벽에 붙어 전송할 수 더욱이, 추출 매질 (세척 단계에 따라)에 수집 된 배아의 전송은, microcapillary 팁 오프닝과 끝없는 침수와 연락처를 포함해야 오프닝. 마지막으로, 모세 혈관은 각각의 새로운 종자 추출물 사이에서 변경해야합니다.
우리의 프로토콜은 몇 가지 다운 가능단순히 RNA, DNA, 염색질, 효소 또는 형광 기자의 분자 무결성을 유지 적절한 절연 버퍼를 사용하여 tream 응용 프로그램. 우리는 성공적으로 RNA 추출 및 전사 체학 분석 8, 1X DNA 메틸화 분석을위한 TE 버퍼 10, 100 MM의 인산 (Jaenisch, Grossniklaus 및 Baroux, 출판, 그림 물고기와 면역 염색 용 식염수 (PBS)를 버퍼에 대한 RNA - 보호 절연 버퍼에 배아를 격리 GUS 기자 분석 (19, 그림 5B)를위한 기판없는 5C), 그리고 염색 솔루션입니다. 절연 상태 / 배아의 질에 가장 민감한 응용 프로그램은 확실히 추출 및 증폭 RNA 있습니다. 고립 된 배아에서 추출한 RNA의 양이 오히려 낮았다. ~에서 2-4 세포 단계 30 배아 (총 따라서 60-120 세포) 우리는 모두 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트)와 큐 비트 (Invitrogen 사) 측정을 기반으로 총 RNA의 ~ 1NG의 양을 추정했다. FollowiNG RNA 추출, RNA 품질 애질런트 RNA 6000 피코 칩 (애질런트 테크놀로지스)에서 확인되었다. 그러나 추출 된 RNA의 낮은 양이 항상 신뢰할 수있는 프로필을 생성하기에 충분하지 않습니다. 따라서, 추가적인 테스트가 증폭 소재 (cDNA를) (예를 들어, PCR 낮은 발현, 배아 특정 유전자 및 / 또는 Bioanalyzer 프로필을 감지)에서 수행해야합니다.
마지막으로, 우리의 프로토콜 시각 기준에 따라 배아를 분리하는 능력은 큰 자산이다. 같은 silique (Arabidopsis의 열매)에서 배아 기적으로 발전하지 않는다. 따라서, 전체 silique 추출물 (RT-PCR 분석 또는 정량 기자 분석을 위해 등) 작업은 특정 발달 단계에 완벽한 상관 관계를 허용하지 않습니다. 특정 발달 단계에서 배아를 분리하면이 문제를 해결합니다. siliques 다른 배아 유전자형을 포함 이형 접합체 돌연변이로 작업 할 때뿐만 아니라, 유사한 문제가 제공합니다. D에 대한 시각 기준에 따라 배아를 분리돌연변이 배아 표현형에서 야생형 예 istinguish은 유전자형과 다운 스트림 분석을 연관 수 있습니다. 우리는 다른 유전자형 20의 특정 유전자좌에서 DNA 메틸화를 분석 성공적으로 수행했다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 배아 분리에 대한 자신의 조언을 탈 Nawy 마틴 바이어에게 감사의 말씀을 전합니다. MTR, VG, UG와 CB는 배아 분리 장비를 고안했다. MTR, VG와 CB는 배아 분리 프로토콜을 개발했다. MTR, VG와 CB는 프로토콜을 확립 배아를 격리하고, 생성 된 배아의 cDNA, VG는 PCR, MTR GUS 염색, JJ 물고기 실험을 수행 하였다. MTR, VG, CG 및 UG는 원고를 썼다. 이 작품은 취리히 대학교, 로슈 연구 재단 (MTR까지)의 친목 및 스위스 국립 재단 (UG와 CB까지)에서 교부금에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
