Summary
Мы сообщаем эффективный и простой способ, чтобы изолировать эмбрионов на ранних стадиях развития от
Abstract
У цветковых растений, зародыш развивается в питательной ткани - эндосперма - окруженный материнской покровов семян (или семенной оболочки). Как следствие, изоляция растение эмбрионов на ранней стадии (1 клетки шаровидный этап) является технически сложной задачей из-за их относительной недоступности. Эффективное рассечение ручной на ранних стадиях сильно ухудшается малого размера молодые семена Arabidopsis и адгезивность эмбриона на окружающие ткани. Здесь мы описываем способ, который позволяет эффективно изоляции молодых эмбрионов Arabidopsis, дающие до 40 эмбрионов в 1 часа до 4 часов, в зависимости от вниз по течению приложения. Эмбрионы высвобождаются в изоляции буфер, слегка 250-750 дробление семян с пластиковой пестиком в пробирку Эппендорфа. Стакан микрокапилляра установки либо в стандартных лабораторных пипетки (через резиновую трубку) или гидравлическим управлением микроинъектор используется для сбора эмбрионов из капель местеD на мульти-и слайд на инвертированный микроскоп свет. Технических навыков, необходимых просты и легко переносятся, а основная установка не требует дорогостоящего оборудования. Сборник эмбрионы подходят для различных последовательных применений, таких как ОТ-ПЦР, РНК последовательности, анализ метилирования ДНК, флуоресценции в гибридизация (FISH), иммунные и анализы гена-репортера.
Introduction
Зародыш цветковых растений окружен эндоспермом, питательные ткани, полученные из второго события оплодотворения. Оба зародыша и эндосперма окружены несколько слоев клеток семенной кожуры. Взятые вместе, эти ткани образуют семена, которые развиваются внутри плода. Таким образом, ткани и клетки конкретных анализов Arabidopsis эмбрионы сильно обесцененные из-за их недоступности. Тем не менее, эмбрионов на поздних шаровидные или более поздних стадиях, относительно хорошо поддаются ручной вскрытия с помощью тонкой иглы вольфрама под стереомикроскоп или слегка надавив на семенах с помощью щипцов, чтобы извлечь их. Такие методы были успешно использованы для транскриптома или эпигенома анализы профилирования, такие как гибридизация микрочипов, бисульфит секвенирование, или РНК последовательности (например, 1-3). Напротив, исследования эмбрионов на ранних зиготы до шаровых этапе остаются технически сложными. На сегодняшний день только несколько исследований Reported транскриптома анализы на молодых эмбрионов с использованием либо лазерным захватом микродиссекции (LCM) эмбриональных тканей со стационарных разделов семян 4 или ручного извлечения отдельных эмбрионы изнутри семена с использованием тонких инструментов 5. Тем не менее, LCM оборудования, что является невозможным и ручное извлечение эмбрионов на ранних стадиях является трудоемким и требует отличные навыки вскрытия, которые не легко передаваться. В дополнение к генома анализы, на месте анализ экспрессии генов, также трудно выполнить на молодых, целом монтажа эмбрионов Arabidopsis. В некоторой степени, молодые эмбрионы могут быть выпущены на предметные стекла микроскопа путем осторожного давления на семена и используется для анализа репортерного гена или белка обнаружения иммунного (см., например, 6,7). Этот метод, однако, не дает высокую пропускную способность эмбриона изоляции, препятствуя тем самым количественного анализа.
Поэтому мы разработали эффективный и быстрый протоколдля раннего эмбриона изоляции от семян Arabidopsis, который прост в настройке, легко переносятся, и подходит для различных последующих применений. Основной принцип состоит, чтобы аккуратно раздавить семена - вырезали у молодых стручки в пробирку Эппендорф с помощью пластикового пестика в соответствующем буфере изоляции. Экстракт семян помещают в капли на мульти-и слайдов и подвергают скринингу на присутствие выпущен эмбрионов в нужной стадии с использованием инвертированного микроскопа. Эмбрионы собирали с использованием стекла микрокапилляра прикреплен к микроинъектор или стандартный пипетки лаборатории. Для молекулярных приложений, эмбрионы дважды промывали повторяется релиз в капли новый буфер изоляции до их передачи на буфер назначения в минимальном объеме. Для цитологических приложения (репортер анализы, иммунное, FISH), стадий промывки может быть опущен.
Метод имеет ряд преимуществ: (I) он дает 25-40 эмбрионов в ~ 45 мин для цитологического приложенияликаций или через 3-4 часа для молекулярной приложений (в том числе этапов промывки), (II) она позволяет выделение специфических эмбриональных стадиях, (III) это легко передаваться другим лицам и лабораторий благодаря простоте установки, (IV) она требуется доступное по цене оборудование для базовые настройки, которые поддается модернизации, и (V) он был успешно использован для различных последовательных применений, таких как РНК последовательности 8, ген-специфических ДНК-анализа метилирования 9, репортер анализы (10 и Raissig соавт., в стадии подготовки.) и рыба (J. Jaenisch, У. Grossniklaus, С. Baroux неопубликованные, см. рисунок 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедура приведены в последовательности операций, показанной на рисунке 1. Микрокапиллярам и инструментальная настройки показаны на рисунках 2 и 3, и типичные шаги эмбриона изоляции показаны на рисунке 4.
1. Материал и подготовки буфера
1.1 Покрытие силиконом стекла микрокапиллярам
- Поместите микрокапиллярам в 15 мл трубки сокола с ~ 5 мл Sigmacote (Sigma) и перевернуть несколько раз.
- Снимите решение, поместите трубки сокола содержащие капилляры в алюминиевую фольгу и запечь их в течение 3 часов при 60 ° C. Хранить при комнатной температуре.
1.2 получаем ~ 50-100 мкм диаметром микрокапиллярных советы
- Извлеките 1 мм в диаметре стеклянных капилляров либо вручную на газовой горелки или при использовании коммерческих съемник (вертикальные нити или съемник микропипетки съемник).
- Использование алмазовКончик пера или лезвие, чтобы отрезать кончик вытащил капиллярной для создания нужного открытия. Выберите лучшие формы капилляров под Стерео микроскоп. Открытие должно быть 50-100 мкм (рис. 2).
1,3 по подготовке слайдов
- Силиконизированная чистой слайды, охватывающих все скважины с Sigmacote (~ 1 мл / слайд) в течение 5 мин, удалить. Выпекать 3 часа в алюминиевую фольгу. Хранить при комнатной температуре.
- Вымойте мульти-и микроскопические стеклянные слайды в течение 10 мин в 10% SDS, 2 х 2 мин в нуклеазы без воды (автоклаве DEPC-Ddh 2 O), 2 мин в 70% этаноле, 2 мин в 100% этаноле, воздушно- высохнуть. Все шаги сделаны в автоклаве банки Коплин. Слайды могут быть повторно использован многократно предоставление тщательной очистки между каждым использованием.
- Непосредственно перед эмбрион распространения изоляции ~ 0,5 мкл 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) с помощью пипетки на всю поверхность каждой лунки и воздушно-сухой.
1,4 микроскоп и капиллярной установке
<OL>1,5 буферов
В таблице 1 перечислены выделения и назначения буферов в зависимости от последующих применений.
- Подготовьте ~ 1 мл буфера на изоляцию попробовать только что перед использованием и держать его на льду.
- Подготовить буфер назначения в 0,5 мл Eppendorf низкого связывания пробирку на льду (молекулярная приложений) или на предметное стекло микроскопа (цитологические приложений) во влажной камере.
2. Вскрытие семян и эмбрионов Добыча
2.1 Синхронизация развития семеноводства
- Выхолостить цветы и держать их 2 дня в ростовой камере, избегая контакта подвергается пестики с другими цветами, то опыляют их (например, 11).
- Проверьте стадии развития на определенных условиях роста микроскопическое исследование очищен семена. С нашими условиями роста (16 ч света при 21 ° С, 8 ч темноты при 18 ° С и влажности 70%) семян, собранных 2,5 дней после опыления (DAP) получают главным образом 2-4 клетки эмбрионов и семян, собранных 3,5 - 4 DAP дали шаровых эмбрионов.
2.2 Вскрытие Семени и разрыв
- Снимите сГКПЗ от 10-15 стручки (~ 2,5 DAP) под стереомикроскопом пинцетом и инсулина игл.
- Погружают семена в 20 мкл буфера для изоляции в 2 мл с круглым дном пробирку Эппендорфа помещают на лед.
- Осторожно раздавить семена с пластиковой пестиком (предварительно очищенный с 10% SDS, промывают DEPC-DDH 2 O и промывали 70% этанолом), чтобы освободить эмбрионов, пока экстракт семян не дождь. Применять силу должна быть определена любым пользователем на судебное разбирательство.
- Промыть пестиком с 300 мкл буфера изоляции мыть пестиком и разбавленный образец.
- Замедление вращения экстракта при 5000 мкг в течение 5 сек. Аккуратно ресуспендируйте гранулированные экстракта с помощью пипетки вверх-вниз 2-3 раза.
- Фильтр экстракта с 30 мкм нейлоновая сетка (устанавливается на трубу адаптеров, например, от PartecCelltricks). Промойте сетку с дополнительным буфером 200 мкл изоляции.
3. Эмбрион Изоляция
3,1 по подготовке слайдов
- <литий> Поместите чистую BSA покрытием и силиконизированный мульти-и слайд на предметный столик инверсионного микроскопа, ресуспендируют отфильтрованный экстракт семян с помощью пипетки осторожно вверх и вниз и пипеткой 2 капли 40-50 мкл экстракта семян в 1 или 2 скважины . Скрининг только 1 или 2 капли в то время, предотвращает испарение образца.
- Место 50 мкл свежего буфера изоляции (1-й стирки капли) в лунке другой слайд полученного, как и раньше. Держите этот слайд в покрытом влажной камере для предотвращения испарения.
3.2 экран, очистить, собирать
- Экран капли экстракта семян для эмбрионов на нужную сцену с 10-кратного увеличения объектива. При необходимости уточнения стадии с 20-кратным увеличением. Эмбрионы обычно опускаются на дно слайдов.
- Вручную удалите мусор вокруг эмбриона с вольфрамовой иглы, инсулин иглы или подобного оборудования.
- Переместить стеклянного капилляра вблизи зародыша использованием микроманипулятор, тAKE до эмбриона с минимальным решением, как это возможно.
- Собрать несколько эмбрионов (например, все одной капли) и отпустить их в 1-й мыть падение (молекулярная приложения) или в буфер назначения (цитологические приложений). Каждый круглый сбора должна быть в пределах 5-10 мин и эмбрионы должны быть собраны в минимальном объеме (общий объем всех сбор раунда должно быть <5 мкл).
- Повторите скрининга и коллекции, пока желаемое количество эмбрионов не будет собран в 1 капле мыть й (в центре, если это возможно, для облегчения воспоминаний).
- Вспомнить все эмбрионы сразу от мытья каплю (если мусор переносятся, удалите их с помощью иглы, прежде чем воспоминание).
- Отпустите эмбрионов в 2-й мыть капли 50 мкл. Повторите 3.2.6.
- Отпустите эмбрионов в буфер назначения. Передача должна включать только контакт, а не погружения капилляра чаевые.
- Замените microcapilЛари для следующего образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наши процедуры выделения эмбрионов (рис. 1) позволяет выделить до 40 эмбрионов в 4 часа, если моет выполняются, например, для молекулярной приложений или менее чем за час, если моет опущены, например, для цитологического приложений. Рисунок 2 показывает высокие и низкие Качество микрокапиллярных советы и рисунке 3 показана настройке автомата изоляции эмбриона. Рисунок 4 показывает процесс эмбриона изоляции на инвертированный микроскоп.
Мы успешно применяются наши процедуры для различных приложений, опубликованных в ряде недавних статей. Этот метод был первоначально разработан для анализа родительского вклада в раннем эмбриональном транскриптома. Гибридные эмбрионы генерируется через скрещивания двух разных присоединениях Arabidopsis (Ландсберг Erecta (L ER) и Колумбии (Col-0)) выделяют на 2-4 клеточной стадии. Суммарную РНК экстрагировали, кДНКбиблиотеки были получены с использованием линейного усиления и секвенировали на твердой платформе. Аллель-специфической transcriptomes были получены на основе анализа SNP 8. Чтобы контролировать свой эмбриональный библиотек кДНК перед секвенированием мы усиливается эмбрион конкретных транскриптов, WUSCHEL-гомеобоксные 2, 8 и 9 (WOX2, WOX8, WOX9) и АКТИНА 11 (13,14, 5А).
Кроме того, этот метод был использован для выделения молодых эмбрионов для анализа эмбриональных ДНК-метилирования в определенных локусов в геноме. Эмбрионы ют и промывают в 1 × TE-буфера. Мелкомасштабные бисульфит секвенирование проводили, как описано 9,15.
Аналогичным образом, эмбрион изоляции оказалось весьма полезным в анализах ген-репортер с низким эмбриональной экспрессии, и где материнский семенной оболочки смешивает обнаружения или маскируется репортер выражение в тканях, окружающих эмбрион (эндосперма, семенной оболочки). Эмбрионы Карр инь репортер трансгенов запятнанные (SS-глюкуронидазой; GUS) или непосредственно проанализированы (зеленый или красный Флуоресцентные белки; GFP, RFP) после изоляции. Пример приведен на фигуре 5В для эмбрионов, экспрессирующих ген GUS репортер под контролем промотора MEDEA (р MEA) 10. Относительно легкости, с которой многие эмбрионы могут быть выделены также учитывает количественный анализ (например, количество эмбрионов окрашивали в различные генетические фоны, Raissig, Grossniklaus соавт. В стадии подготовки).
Наконец, мы успешно применяются люминесцентные в гибридизация (FISH) и иммунных методов для изучения ядерной архитектуры в изолированных эмбрионов встроенные в акриламида накладки на слайдах. Пример FISH с использованием зондов, против центромеры повторов и ядрышек организации областей показано на фиг.5С.
1 "FO: Content-ширина =" 5 дюймов "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Блок-схема процедуры изоляции эмбриона протокол разделен на три части: 1 - Подготовка материала, 2 - Семенной рассечение, 3 - Эмбрион изоляции..
Рисунок 2. Микрокапиллярных советы. А. Высококачественные микрокапиллярных советов с гладкой открытие около 100 мкм. В. Низкое качество микрокапиллярных советы с широким открытием и нерегулярные контура (эти советы являются приемлемыми для цитологического приложений только). Шкала бар: 2 мм.
ghres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Настройка микроскопа изоляции эмбриона. А. и Б. Скрининг проводится под микроскопом с помощью инвертированного микроскопа. Эмбрионы собирали с использованием стекла микрокапиллярных закреплен на микроманипулятор точно регулировать его положение (см. также фиг.4) и подключен либо к микроинъектор (А) или стандартной лабораторной пипетки (B). А. стекло микрокапиллярных связан с гидравлическим управлением микроинъектор (например, Eppendorf сотовых трамваи Vario) для точного управления во время эмбрионов B. стекло микрокапиллярных прикреплен к стандартному P-200 пипетки через резиновую трубку гибкости. Сбор эмбрионов и высвобождение контролируется путем поворота колеса калибровки пипетки. Cut-конца наконечники используются в качестве разъемов и стыков запечатаны парафином. Миcrocapillary закреплена на микроманипулятор через полистирольных блоков, сокола трубки и ленты.
Рисунок 4. Эмбрион процесс изоляции. А. 2-4 эмбриона (стрелка) был выявлен в экстракт семян (скрининг капли) и окружен мусора (фрагментов семенных коробочек). B. окружающих мусор был удален вручную с помощью иглы. C. стеклянный капилляр был перемещен рядом эмбриона (стрелка). D. эмбриона были собраны и в настоящее время внутри капилляра (стрелка). E. Несколько эмбрионов в последней каплей после стирок. = 50 мкм.
Фа igure 5. Последующих применений эмбриона изоляции А. анализа экспрессии генов:. ПЦР-амплификации WOX9, WOX2, WOX8 и ACTIN11 на 13,14 библиотек кДНК (получали, как описано 8) от 2-4 эмбрионов клетки промывали 1x раз (1-й переулок) и на геномной . ДНК (2-й переулок) B. Репортер анализа: 8-элементная эмбриона выделяют из растений проведении AP MEA :: GUS конструкции окрашивают на слайде в стандартном решении окрашивания GUS (воспроизведен из Raissig и др., 2011 г., после разрешения. Plant Cell, ASPB авторских прав). C. Люминесцентные in-situ гибридизация (FISH): 8-элементная эмбриона гибридизовали с зондами против центромерным повторов (красный), и 45S рДНК повторов (зеленый) до косвенного иммунодетекции 16. Двухцветных изображений рыб с наложенным на него контрастного DAPI и DIC изображений (DM6000B эпифлуоресцентной микроскопом, Leica, Германия).
| Применение | Выделение буфера | Буфер назначения |
| Выделение РНК (например, для усиления и транскриптомика) | 1x первой цепи буфере (Invitrogen), 1 мМ DTT, 4% RNAseOUT | РНК-буфера для экстракции |
| Выделение ДНК (например, для секвенирования бисульфита) | 100 мМ Трис, 10 мМ ЭДТА, рН 8 (TE) | Выделение ДНК или 1x буфер ТЕ буфере |
| GFP репортер анализа | 1 М глицина в 0.5x MS 1 | 1 М глицина в 0.5x MS |
| GUS Репортер анализа | окрашивания буфера 2 без X-Gluc (подложка) | окрашивания буфер с X-Gluc (подложка) |
| FISH & Иммуноокрашивание | 100 мМ фосфатно-солевой буфер (PBS) | активирован акрила Bisacryl смеси (33:3) на Superfrost Plus слайд-полимеризуется в течение 30 мин |
Таблица 1. Выделение и назначение буфера для различных последующих применений. Буферы могут быть адаптированы для конкретных экспериментальных требований. 1 Murashig и Скуга. 2, например Jefferson и соавт., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали протокол эмбриона изоляции, которая является быстрым, эффективным, и может быть легко переведены в другие лаборатории.
Оборудование, описанное здесь состоит из инвертированного микроскопа, микроманипулятор, стекло микрокапиллярам, вертикальная нить съемник и микроинъектор (рис. 3А). Установка аналогична той, которая описана для одного изоляторе животных для анализа транскриптомика 17. Мы также успешно работает с более базовые настройки, где стекла были вручную микрокапиллярам натянутой на пламени (и вырезать с алмазным лезвием) и управляется с помощью стандартной лабораторной пипетки (Pipetman P-200) вместо микроинъектор (рис. 3В). В этом случае микрокапиллярных был присоединен к пипетке через резиновую трубку. 10 мкл filtertips были использованы для изготовления узлов, которые были завернуты парафином, чтобы сделать их герметично. Капиллярной - находящиеся в собственности кончиком пипетки - было зафиксировано на микрomanipulator рука с использованием полистирольных блоков и лентой (рис. 3В). Это базовые настройки оказались эффективными и надежными 8. Тем не менее, одна из основных трудностей было поддержание герметичных соединений между микрокапиллярных и пипетку, особенно при изменении капилляра. Проверка и регулировка давления в капиллярной - обеспечить доработаны эмбрионов в минимальном объеме - может занять много времени с помощью этой базовой настройки. Улучшенная установка с гидравлическим управлением микроманипулятор и вертикальный съемника нить представляет собой значительное улучшение и экономит время.
Навыки, необходимые для успешного применения этого метода легко переносятся. Пять пользователей в нашей лаборатории успешно узнал метод в относительно короткое время. Некоторые упрощения протокола возможны в зависимости от простоты использования в манипуляции. Например, можно пропустить шаги 2.2.5 и 2.2.6 прирассекает только 5 стручки (вместо 15) и очистка эмбрион окрестности тщательно от мусора с вольфрамовой иглой (эта процедура была применена в 8). Синхронизация развития семян путем кастрации и задержки опыление является факультативным, но рекомендуется увеличить количество эмбрионов в то же стадии развития, особенно на ранних стадиях. Кроме того, изоляция эмбриона можно ускорить, если стиральная шага отсутствуют, например, для цитологического приложений. Кроме того, слайд силицирование (шаг 1.3.2) не является необходимой для пользователей, работающих быстро, так, что эмбрионы которые прилипают к поверхности стекла в течение долгого времени не является проблемой.
Будь фильтрования или ручная очистка применяется, крайне важно, чтобы избежать переноса ткани мусор, который создает потенциального загрязнения вниз по течению РНК или ДНК приложений. Этот вопрос был поднят в последнее время в исследовании транскриптома профилирования с помощью другого метода эмбриона изоляции18. В отличие от основной протокол изоляции эмбриона описанный здесь, авторы расчлененный Arabidopsis вручную из эмбрионов в рамках отдельных семян с использованием тонких игл, длительной процедурой, требующей отличные навыки вскрытия. Эта процедура по-видимому требуется два или несколькими промывками, чтобы избежать переноса возможных загрязняющих клетки от окружающей ткани семени, ситуация, вероятно, возникающих при использовании этого метода, учитывая небольшой размер эмбрионов, трудности в обращении с ними рассечение иглы и адгезивность окружающих клеток. С другой стороны, наша процедура позволяет (я) разбавление эмбрионов экструзии из семян при дроблении и окружающий мусор в большом объеме (500 мкл) до получения эмбрионов, (II) визуальное выделение эмбрионов лишенный клей, загрязняя мусора, и (III) разбавление возможно РНК загрязнений утечки из разорванных клетки-на стадии промывки. Хотя можно использовать только одну стадию промывки, еслиэмбриона появляются очень чистый и собираются в менее 5 мкл 8, второй стадии промывки рекомендуется, особенно для начинающих пользователей, которые могут собирать эмбрионов в нескольких раундах (т.е. с добавкой объема). Эмбрионы должны быть собраны в качестве лишь решение возможно, что позволяет максимальное разведение потенциальных загрязнителей в каждой стадии промывки. Каждый раунд сбора должны быть короткими (в течение 5-10 мин) для обеспечения максимального восстановления после освобождения в мытье каплю (больше присутствие в капиллярной ведет к снижению скорости восстановления). Кроме того, передача собранных эмбрионов в экстракционную среду (после промывания) должны только включать контакт с открытием микрокапиллярных наконечник, а не погружение наконечника, так как это могло бы также передавать мусор прилипание на стене над микрокапиллярных отверстие. Наконец, капиллярная трубка должна быть изменена между каждым новым экстракт семени.
Наш протокол позволяет в течение нескольких паденийTream приложений, просто используя соответствующий буфер изоляции, которые сохраняют молекулярную целостность РНК, ДНК, хроматин, фермента или флуоресцентные репортер. Мы успешно изолированы эмбрионов в РНК-защитная изоляция буфер для экстракции РНК и транскриптомика анализов 8, 1x TE-буфера для анализа метилирования ДНК 9, 100 мМ фосфатным буферным раствором (PBS) для рыб и иммунное (Jaenisch, Grossniklaus и Baroux, неопубликованные, рис 5C), и окрашивание раствор без подложки для GUS-репортера анализы (19 фиг.5В). Применение наиболее чувствительны к условиям изоляции / качество эмбриона, конечно, выделения РНК и амплификации. Количества извлеченной РНК из изолированных зародышей была довольно низкой. Из ~ 30 эмбрионов на 2-4 клеточной стадии (таким образом 60-120 клеток в общей сложности) мы оценили количество ~ 1 нг общей РНК на основе как Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) и кубит (Invitrogen) измерений. Followiнг экстракции РНК, РНК качества была проверена на 6000 Agilent РНК Pico Chip (Agilent Technologies). Однако небольшое количество РНК, экстрагированной не всегда достаточно для получения надежной профиль. Таким образом, дальнейшие испытания должно быть сделано на усиленный материал (ДНК) (например, ПЦР обнаружения низкого четко, эмбрион-специфических генов и / или профиль Bioanalyzer).
Наконец, способность изолировать эмбрионов путем визуальных критериев в нашем протоколе, является огромным преимуществом. Эмбрионы из одного стручка (Arabidopsis фрукты) не развиваются синхронно. Таким образом, работая на целых стручка экстракты (например, для ОТ-ПЦР анализа или количественных анализов репортер) не позволяет место полная корреляция с заданной стадии развития. Изолирующие эмбрионов на стадии развития конкретных решает эту проблему. Кроме того, аналогичные проблемы представляет при работе с гетерозиготными мутантами, где стручки содержат различных генотипов эмбриона. Изоляция эмбрионов на основе визуальных критериев Distinguish например дикого типа от мутантные фенотипы эмбриона позволяет корреляции ниже анализов с генотипом. Мы сделали это успешно для анализа метилирования ДНК в определенных локусов в различных генотипов 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Таль Nawy и Мартин Bayer за их советы на эмбрион изоляции. MTR В.Г., UG и ЦБ разработали оборудование эмбриона изоляции. MTR В.Г., ЦБ разработал протокол эмбриона изоляции. MTR В.Г., ЦБ установил протокол, изолированных зародышей и эмбрионов сгенерированный кДНК, В. Г. исполнил ПЦР, MTR окрашивания GUS, JJ FISH экспериментов. MTR В.Г., CG и UG написал рукописи. Эта работа финансировалась в университете Цюриха, в Братстве Roche Research Foundation (для MTR) и гранты от Швейцарского национального фонда (в UG и ЦБ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
