Summary
Vi rapporterar en effektiv och enkel metod för att isolera embryon i tidiga stadier av utveckling från
Abstract
I blommande växter, utvecklar embryot inuti en närande vävnad - endospermen - omgiven av moderns frö integuments (eller fröskal). Som en följd av detta, är isoleringen av växtembryon i tidiga skeden (1 cell till klotformiga stadiet) utmanande tekniskt på grund av deras relativa otillgänglighet. Effektiv manuell dissektion i tidiga skeden är starkt försämras av den lilla storleken av unga Arabidopsis frön och vidhäftning av embryot till de omgivande vävnaderna. Här beskriver vi en metod som möjliggör en effektiv isolering av unga Arabidopsis embryon, vilket ger upp till 40 embryon i 1 h till 4 h, beroende på nedströms tillämpning. Embryon släpps in i isolering buffert genom något krossning 250-750 frön med en plast mortelstöt i ett Eppendorf-rör. Ett glas microcapillary anslutning till antingen en standard laboratorium pipett (via en gummislang) eller en hydrauliskt styrd microinjector används för att samla in embryon från dropparna platsd på en multi-väl glida på ett inverterat ljusmikroskop. De tekniska kunskaper som krävs är enkla och lätta att överföra, och den grundläggande installationen inte kräver dyr utrustning. Insamlade embryon är lämpliga för en mängd olika efterföljande tillämpningar såsom RT-PCR, RNA-sekvensering, DNA-analyser metylering, fluorescens in situ hybridisering (FISH), immunfärgning, och reporter analyser gen.
Introduction
Embryot av blommande växter är omgiven av frövitan, en närande vävnad som härrör från en andra befruktning händelse. Både embryo och frövitan är omgivna av flera cellager av fröskalet. Kollektivt dessa vävnader bildar ett frö, som utvecklas inuti frukten. Således är vävnads-och cell-specifika analyser av Arabidopsis embryon kraftigt nedsatt på grund av sin otillgänglighet. Ändå embryon vid de sena-klotformiga eller senare stadier är relativt väl lämpade för manuell dissektion med fina volfram nålar under stereomikroskop, eller genom ett lätt tryck på fröet med pincett för att utvinna dem. Sådana tekniker har framgångsrikt använts för transcriptome eller epigenomet analyser profilering såsom microarray hybridisering, bisulfit sekvensering, eller RNA-sekvensering (t.ex. 1-3). Däremot studier av embryon vid zygot till tidigt klotformiga stadium förblir tekniskt utmanande. Hittills endast ett fåtal studier har reported transkriptom analyser på unga embryon med hjälp av antingen laser-capture microdissection (LCM) i embryonala vävnader från fasta utsäde avsnitt 4 eller manuell utvinning av enskilda embryon från inom frön med fina verktyg 5. Dock är LCM utrustningen inte är allmänt tillgänglig och manuell embryo utvinning i tidiga skeden är tidskrävande och kräver utmärkta dissektion färdigheter som inte är lätt överförbara. Förutom heltäckande genomanalyser, in situ analyser genuttryck är också svåra att utföra på unga, hel-mount embryon av Arabidopsis. Till viss del kan unga embryon släppas på objektglas med ett lätt tryck på fröna och används för analyser reporter gen eller protein upptäckt genom immunfärgning (t.ex. se 6,7). Denna teknik, dock inte tillåter hög genomströmning embryo isolering, vilket hindrar kvantitativa analyser.
Därför har vi utvecklat en effektiv och snabb protokollför tidiga embryot isolering från Arabidopsis frön som är enkel att installera, lätt att överföra, och lämpar sig för en mängd olika tillämpningar i efterföljande led. Den grundläggande principen är att försiktigt krossa frön - dissekeras från unga siliques i ett Eppendorf-rör med en plast mortelstöt i en lämplig isolering buffert. Fröet extraktet placeras i droppar på en med flera brunnar rutschbana och screenas med avseende på närvaro av frisatta embryon vid det önskade stadiet med ett inverterat mikroskop. Embryon samlas in med hjälp av ett glas microcapillary bifogas en microinjector eller en standard laboratorium pipett. För molekylära tillämpningar, är embryon tvättas två gånger genom upprepad utsättning droppar av ny isolering buffert innan du överför dem till destinationen buffert i en minimal volym. För cytologiska applikationer (reporter analyser, immunfärgning, fisk), kan tvättningsstegen utelämnas.
Metoden erbjuder flera fördelar: (i) den ger 25-40 embryon i ~ 45 min för cytologisk apptioner eller i 3-4 tim för molekylära ansökningar (inklusive tvättningsstegen), (ii) det tillåter isolering av specifika embryonala stadier, (III) är det lätt att överföra till andra personer och laboratorier på grund av dess enkla installation, (iv) det kräver prisvärd utrustning för den grundläggande installationen som är mottaglig för uppgraderingar, och (v) att det var framgångsrikt använts för olika nedströms applikationer såsom RNA-sekvensering 8, gen-specifika DNA-metylering analys 9, analyser reporter (10 och Raissig et al., i prep.) och fisk (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux opublicerade, se Figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfarandet sammanfattas i flödesschemat som visas i figur 1. Den mikrokapillärer och den instrumentella konfiguration visas i figur 2 och figur 3, och typiska stegen i embryo isolering visas i Figur 4.
Ett. Material och Buffer Förberedelse
1,1 Silikonisering av glas mikrokapillärer
- Placera mikrokapillärer i en 15 ml Falcon rör med ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) och vänd flera gånger.
- Avlägsna lösningen, placera Falcon röret med kapillärer i en aluminiumfolie och baka dem under 3 timmar vid 60 ° C. Förvara vid rumstemperatur.
1.2 Skaffa ~ 50-100 ìm diameter microcapillary tips
- Drag 1 mm diameter glaskapillärer antingen manuellt över en Bunsen-brännare eller genom att använda ett kommersiellt avdragare (vertikal glödtråd avdragare eller mikropipett avdragare).
- Använd en diamant-spets penna eller blad för att skära spetsen av drog kapillär att skapa den önskade öppningen. Välj den bästa-formade kapillärer under ett stereomikroskop. Öppningen bör vara 50 till 100 ^ m (Figur 2).
1,3 Slide förberedelse
- Siliconize rena diabilder genom att täcka samtliga brunnar med Sigmacote (~ 1 ml / slide) för 5 minuter, ta bort. Grädda 3 tim i aluminiumfolie. Förvara vid rumstemperatur.
- Tvätta med flera brunnar glas mikroskopiska objektglasen i 10 min i 10% SDS, 2 x 2 min i nukleasfritt vatten (autoklaveras DEPC-DDH 2 O), 2 min i 70% etanol, 2 min i 100% etanol, luft- torka. Alla steg görs i autoklaverade Coplinburkar. Diabilder kan återanvändas flera gånger ge grundlig rengöring mellan varje användning.
- Precis före embryo isolering sprids ~ 0,5 | il av 10 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) med en pipett över hela ytan av varje brunn och lufttorka.
1.4 Mikroskop och kapillär installation
<ol>1,5 Buffertar
Tabell 1 listar isolering och destination buffertar beroende på de efterföljande ansökningarna.
- Förbered ~ 1 ml isolering buffert per prov nytt före varje användning och förvara den på is.
- Förbered destinationsbufferten i ett 0,5 ml Eppendorf-låg-bindande rör på is (molekylära tillämpningar) eller på ett objektglas (cytologiska tillämpningar) i en fuktig kammare.
2. Seed Dissection och Embryo Extraction
2.1 Synkronisering av fröutveckling
- Emasculate blommor och hålla dem två dagar i odlingskammaren samtidigt undvika kontakt av de exponerade pistiller med andra blommor, sedan pollinera dem (t.ex. 11).
- Testa utvecklingsstadium under dina tillväxtbetingelser genom mikroskopisk undersökning av clearade frön. Med våra odlingsbetingelser (16 timmar ljus vid 21 ° C, 8 timmar mörker vid 18 ° C och 70% luftfuktighet) frön samlas 2,5 dagar efter pollinering (DAP) gav huvudsakligen 2-4 cellembryon och frön samlas 3,5-4 DAP gav globulärt embryon.
2.2 Utsäde Dissection och spricka
- Avlägsna sEEDS 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) under ett stereomikroskop med pincett och nålar insulin.
- Sänk fröna i 20 ^ isolering buffert i ett 2 ml rundbottnad Eppendorf-rör placerades på is.
- Försiktigt krossa fröna med en plast mortelstöt (pre-rengörs med 10% SDS, sköljdes med DEPC-DDH 2 O och tvättades med 70% etanol) för att frigöra embryona tills utsäde utdraget är grumlig. Kraften för att tillämpa är som skall fastställas av varje användare vid försök.
- Skölj mortelstöten med 300 ul av isoleringsbuffert att tvätta mortelstöten och späda provet.
- Spin-ner extraktet vid 5000 xg under 5 sek. Försiktigt resuspendera pelleterat extraktet genom att pipettera upp-och-ned 2-3 gånger.
- Filtrera extraktet med ett 30 um nylonnät (monterad på röradaptrar, t.ex. från PartecCelltricks). Skölj mesh med ytterligare 200 pl isolering buffert.
Tre. Embryo Isolering
3,1 Slide förberedelse
- <li> Placera en ren, BSA-belagda och silikoniserad flera bra bild på scenen av den inverterade mikroskop, suspendera filtrerade fröextrakt genom att pipettera försiktigt upp och ned och pipettera 2 droppar av 40-50 pl fröextrakt in 1 eller 2 brunnar . Screening endast en eller två droppar på en gång förhindrar avdunstning av provet.
- Placera 50 ^ färsk isolering buffert (1 st tvätta droppe) i en brunn på en annan bild framställd som tidigare. Behåll denna bild i en täckt, fuktig kammare för att förhindra avdunstning.
3.2 Skärm, städa, samla
- Skärm dropparna av utsäde extrakt för embryon vid önskad scen med 10x förstoring målet. Vid behov, bekräfta scenen med 20x förstoring. De embryon sjunker oftast till botten av bilden.
- Manuellt ta bort skräp runt embryot med en volfram nål, en insulin nål eller liknande utrustning.
- Flytta glaskapillär nära embryot med mikromanipulator, take upp embryot med så lite lösning som möjligt.
- Samla flera embryon (t.ex. alla en droppe) och släppa dem i 1: a tvätta droppe (molekylär applikation) eller destination buffert (cytologiska tillämpningar). Varje samla rundan bör hållas inom 5-10 minuter och embryon skall samlas i en minimal volym (den totala volymen av alla samla rundor ska vara <5 ^).
- Upprepa screening och samlingen tills den önskade mängden embryon samlas i 1 st tvätta droppe (centralt, om möjligt, för att underlätta minne).
- Minnas alla embryon på en gång från tvätta släpp (om skräp förs över, ta bort dem med en nål innan minne).
- Släpp embryon till en 2: a tvätta droppe 50 pl. Upprepa 3.2.6.
- Släpp embryona i destinationsbufferten. Överföringen ska omfatta endast en kontakt, och inte nedsänkning av kapillären dricks.
- Byt ut microcapilLary för nästa prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår Embrvoisolering förfarande (figur 1) medger isolering av upp till 40 embryon i 4 timmar om tvättar utförs, t.ex. för molekylära tillämpningar, eller i mindre än en timme om tvättar utelämnas, t.ex. för cytologiska applikationer. Figur 2 visar högt och lågt kvalitet microcapillary tips och Figur 3 visar installationen av embryot isolering maskinen. Figur 4 visar processen Embrvoisolering på inverterat mikroskop.
Vi tillämpade framgångsrikt vårt förfarande för olika tillämpningar publicerats i flera nya artiklar. Metoden utvecklades ursprungligen för att analysera föräldrarnas bidrag till den tidiga embryonala transcriptome. Hybrid embryon som genereras genom korsningar mellan två olika Arabidopsis anslutningar (Landsberg erecta (L ER) och Columbia (Col-0)) isolerades vid 2-4 cellstadiet. Totalt RNA extraherades, cDNAbiblioteken framställdes med linjär förstärkning och sekvenseras på en solid plattform. De allel-specifika transcriptomes genererades utifrån SNP-analys 8. För att styra våra embryonala cDNA-bibliotek innan sekvensering vi förstärkt embryo-specifika transkript, wuschel-homeobox 2, 8 och 9 (WOX2, WOX8, WOX9) och ACTIN 11 (13,14, Figur 5A).
Dessutom har denna metod använts för att isolera unga embryon att analysera embryonala DNA-metylering mönster på specifika loci i genomet. Embryon isolerades och tvättades i 1 x TE-buffert. Småskalig bisulfit sekvensering utfördes såsom beskrivits 9,15.
På liknande sätt har embryo isolering visat sig vara mycket användbara vid analyser rapportgenprodukter med låg embryonalt uttryck och där maternal fröskalet blandar ihop detektering eller maskeras av reporter expression i vävnader som omger embryot (endosperm, fröskal). Embryon carr ying reportern transgenen är färgade (ß-glukuronidas, GUS) eller analyseras direkt (grön eller röd fluorescerande protein, GFP, RFP) efter isolering. Ett exempel ges i fig. 5B för embryon som uttrycker en GUS-reportergen under kontroll av den MEDEA promotom (p MEA) 10. Den relativt lätthet med vilken många embryon kan isoleras möjliggör också för kvantitativa analyser (t.ex. antalet embryon som färgats i olika genetisk bakgrund, Raissig, Grossniklaus et al. Under utarbetande).
Slutligen tillämpade vi framgångsrikt Fluorescent in situ hybridisering (FISH) och immunfärgning tekniker för att studera den nukleära arkitekturen i isolerade embryon inbäddade i akrylamid kuddar på diabilder. Ett exempel på FISH använda prober mot centromeren upprepningar och nukleolära organisera regioner visas i figur 5C.
1 "fo: innehåll-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "/>
Figur 1. Flödesschema av embryot isoleringsproceduren Protokollet är uppdelat i tre delar: 1 - Material förberedelse, 2 - Seed dissektion, 3 - Embrvoisolering..
Figur 2. Microcapillary tips. A. Högkvalitativa microcapillary tips med en smidig öppning av cirka 100 nm. B. Låg kvalitet microcapillary tips med bredare öppning och oregelbunden kontur (dessa tips är acceptabla för cytologiska tillämpningar). Skala bar: 2 mm.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
Figur 3. Ställ in av embryot isolering mikroskop. A. och B. Screening utförs på objektglas under ett inverterat mikroskop. Embryon samlas in med hjälp av ett glas microcapillary fast på en mikromanipulator att exakt kontrollera sin position (se även figur 4) och ansluts till antingen en microinjector (A) eller standard laboratorium pipett (B). A. Glaset microcapillary är kopplad till en hydrauliskt styrd microinjector (t.ex. Eppendorf Cell Tram Vario) för en exakt kontroll under embryosamlings B. Glaset mikrokapillär är fäst till en standard P-200 pipett via en gummi böjlig slang. Embryo insamling och frisättning styrs genom att vrida kalibrering hjulet av pipetten. Cut-end pipettspetsar används som kontakter och korsningar är förseglade med parafilm. Den microcapillary är fixerad på mikromanipulator via polystyrensegment, Falcon rör och tejp.
Figur 4. Embrvoisolering process. A. A 2-4 cell embryo (pil) identifierades i fröextrakt (screening droppe) och är omgiven av skräp (fröskal fragment). B. Den omgivande skräp togs bort manuellt med en nål. C. Den glaskapillär flyttades precis bredvid embryot (pilen). D. Embryot samlades och är nu inuti kapillären (pil). E. Flera embryon i sista droppen efter tvättar. Skala = 50 | im.
F igure 5. Nedströms tillämpningar av Embrvoisolering A. analys av genuttryck:. PCR-amplifiering av WOX9, WOX2, WOX8 och ACTIN11 13,14 på cDNA-bibliotek (genereras som beskrivits 8) 2-4 cellembryon tvättas 1x gånger (1st lane) och genomisk . DNA (2nd lane) B. Reporter analys: En 8-cells embryo isolerats från växter som bär ap MEA :: GUS konstruktionen färgas på en bild i en vanlig GUS färgningslösning (återgivet från Raissig et al, 2011 efter tillstånd från. Plant Cell, ASPB copyright). C. Fluorescent In-situ hybridisering (FISH): en 8-cells embryo hybridiserades med prober mot centromera upprepningar (röd) och 45S rDNA upprepningar (grön) före indirekt immunodetection 16. Tvåfärgad FISK bilder täcktes med DAPI motfärgning och DIC bilder (DM6000B epifluorescensmikroskop, Leica, Tyskland).
| Tillämpning | Isolering buffert | Destination buffert |
| RNA-extraktion (t.ex. för förstärkning och transkriptomik) | 1x First-Strand-buffert (Invitrogen), 1 mM DTT, 4% RNAseOUT | RNA-extraktionsbuffert |
| DNA-extraktion (t.ex. för bisulfite sekvensering) | 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) | DNA-extraktionsbuffert eller 1x TE-buffert |
| GFP reporter analys | 1 M glycin i 0,5 x MS 1 | 1 M glycin i 0,5 x MS |
| GUS reporter analys | färgningsbuffert 2 utan X-Gluc (substrat) | färgningsbuffert med X-Gluc (substrat) |
| FISK & Immunofärgning | 100 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS) | aktiverad Acryl: Bisacryl mix (33:3) på en Superfrost Plus slide-polymeriseras i 30 min |
Tabell 1. Isolering och destination buffertar för olika tillämpningar i efterföljande led. De buffertar kan anpassas till specifika experimentella krav. 1 Murashig & Skoog-medium. 2 ex Jefferson et al., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utvecklade ett protokoll embryo isolering som är snabb, effektiv, och kan lätt överföras till andra laboratorier.
Den utrustning som beskrivs här består av ett inverterat mikroskop, en mikromanipulator, glas mikrokapillärer, en vertikal glödtråd avdragare och en microinjector (Figur 3A). Upplägget liknar det som beskrivits för enstaka djur cellisolering för transkriptomik analyser 17. Vi har också framgångsrikt arbetat med en mer grundläggande inställning där glas mikrokapillärer var manuellt sträckt över en låga (och skär med en diamant-blad) och drivs via en standard laboratorium pipett (Pipetman P-200) i stället för en microinjector (Figur 3B). I det fallet microcapillary fästes till pipetten via en gummislang. 10 il filterspetsar användes för att göra de korsningar, som var lindade med parafilm för att göra dem lufttäta. Den kapillära - innehas av pipettspetsen - fastställdes på micromanipulator armen med polystyrensegment och tejp (Figur 3B). Denna grundläggande inställning visade sig vara effektiv och tillförlitlig 8. Ändå var en av de största svårigheterna bibehållandet av luft-tight junctions mellan mikrokapillär och pipetten, speciellt vid byte av kapillären. Verifiera och justera trycket i kapillären - att säkerställa en finjusteras embryosamlingsgrupp i en minimal volym - kan vara tidskrävande att använda denna grundläggande inställning. Den förbättrade installation med en hydrauliskt styrd mikromanipulator och en vertikal glödtråd avdragare är en avsevärd förbättring och sparar tid.
De färdigheter som krävs för en framgångsrik tillämpning av denna metod är lätt överföras. Fem användare i vårt laboratorium lärde framgångsrikt metoden i en relativt kort tid. Vissa förenklingar av protokollet är möjliga beroende på användarens lätthet i manipulation. Till exempel är det möjligt att hoppa över stegen 2.2.5 och 2.2.6 medandissekera endast 5 siliques (istället för 15) och rengöring embryot omgivningen grundligt från skräp med en volfram nål (detta förfarande tillämpats 8). Synkronisering av utsäde utveckling genom kastrering och fördröjd pollinering är fakultativa men rekommenderas att öka antalet embryon på samma utvecklingsstadium, särskilt i tidiga skeden. Dessutom kan embryot isolering påskyndas om tvättsteg utelämnas, t.ex. för cytologiska applikationer. Dessutom är slide siliconization (steg 1.3.2) inte nödvändigt för användare som arbetar snabbt, är sådana att embryon som fastnar på glasytan över tiden inte ett problem.
Vare filtrering eller manuell rengöring appliceras, är det oerhört viktigt att undvika överföring av vävnad skräp som skapar smittorisker för nedströms RNA eller applikationer DNA. Denna fråga togs upp nyligen i en transkriptom profilering studie med en annan metod för Embrvoisolering18. I motsats till merparten Embrvoisolering Protokollet som beskrivs här, författarna dissekerade Arabidopsis embryon manuellt inifrån enskilda frön med fina nålar, en långdragen process som kräver goda dissektion färdigheter. Detta förfarande krävs tydligen 2 eller fler tvättar för att undvika överföring av eventuella förorenande celler från omgivande frövävnad, en situation som kan uppstå när du använder denna metod tanke på den lilla storleken av embryona, svårigheterna att få tillgång till dem med dissektion nålar, och vidhäftningsförmåga av omgivande celler. Däremot gör vårt förfarande (i) utspädning av embryon-extruderade från frön vid krossning-och omgivande skräp i en stor volym (500 l) före embryosamlingen, (ii) den visuella urvalet av embryon saknar lim, förorenande skräp, och (iii) utspädning av möjliga RNA förorening-läcker från spruckna celler-by tvättningsstegen. Även om det är möjligt att använda endast ett tvättsteg omembryon verkar mycket ren och samlas i mindre än 5 ^ 8, en andra tvätt steg rekommenderas, särskilt för nybörjare som kan samla in embryon i flera omgångar (dvs. med tillsats volym). Embryon skall samlas in så lite lösning som möjligt, så att den maximala utspädningen av potentiella föroreningar i varje tvätt steg. Varje samla rundan bör hållas kort (inom 5-10 min) för att tillåta maximal återhämtning efter utsläpp i tvätt droppe (längre närvaro i kapillären tenderar att minska återvinningsgraden). Vidare bör överföringen av de insamlade embryon till extraktionsmediet (efter tvätt stegen) innebär endast en kontakt med öppnandet av mikrokapillär spetsen och inte nedsänkning i spetsen, eftersom detta kan lika gärna överföra skräp fastnar på mikrokapillär väggen ovanför öppningen. Slutligen bör den kapillära ändras mellan varje ny fröextrakt.
Vår protokoll möjliggör för flera nedgångartream program genom att bara använda en lämplig isolering buffert som bevarar molekylära integriteten av RNA, DNA, kromatin, enzym eller fluorescerande reporter. Vi isolerade framgångsrikt embryon i RNA-skyddande isolering buffert för RNA-extraktion och transkriptomik analyser 8, 1x TE-buffert för analyser DNA-metylering 9, buffrad 100 mM fosfat saltlösning (PBS) för fisk och immunfärgning (Jaenisch, Grossniklaus och Baroux, opublicerat, figur 5C), och färgning lösning utan substrat för GUS reporter analyser 19 (figur 5B). Ansökan mest känsliga för isolering villkor / embryo kvalitet är RNA verkligen extraktion och amplifiering. Mängden extraherat RNA från isolerade embryon var ganska låg. Från ~ 30 embryon vid 2-4 cellstadiet (alltså 60-120 celler totalt) beräknas ett belopp på ~ 1 ng av totalt RNA baserade på både Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) och Qubit (Invitrogen) mätningar. Following RNA-extraktion, RNA kvalitet kontrolleras på ett Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies). Emellertid är den låga mängden RNA extraherat inte alltid tillräcklig för att ge en tillförlitlig profil. Därför måste ytterligare tester göras på förstärkta materialet (cDNA) (t.ex. PCR detektera låga uttryckt embryo-specifika gener och / eller en Bioanalyzer profil).
Slutligen är förmågan att isolera embryon genom visuella kriterier i våra protokoll en stor tillgång. Embryon från samma silique (Arabidopsis frukt) inte utvecklas synkront. Således arbetar på hela silique extrakt (t.ex. för RT-PCR-analyser eller kvantitativa analyser reporter) inte tillåta en perfekt korrelation med en given utvecklingsstadiet. Isolera embryon vid en specifik utvecklingsstadium löser detta problem. Dessutom presenteras ett liknande problem när man arbetar med heterozygot mutanter där siliques innehåller olika embryo genotyper. Isolera embryon baserade på visuella kriterier till distinguish t.ex. vildtyp från mutant embryo fenotyper kan korrelera nedströms analyser med genotyp. Vi har gjort detta framgångsrikt för att analysera DNA-metylering vid specifika loci i olika genotyper 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Tal Nawy och Martin Bayer för deras råd om Embrvoisolering. MTR, VG, UG och CB utarbetat utrustningen Embrvoisolering. MTR, VG och CB utvecklade protokollet Embrvoisolering. MTR, VG och CB etablerade protokoll, isolerade embryon, och genererade embryo cDNA, som utförs VG PCR, MTR GUS färgning, JJ FISH experiment. MTR, VG, CG och UG skrev manus. Detta arbete har finansierats av University of Zürich, en gemenskap av Roche Research Foundation (till MTR), och bidrag från den schweiziska National Foundation (till UG och CB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
