Design av en Biaxial mekanisk belastning Bioreaktor för Tissue Engineering
Summary
Vi konstruerade en ny mekanisk belastning bioreaktor som kan ansöka enaxlig eller tvåaxlig mekaniska påfrestningar till ett brosk biokompositmaterial före transplantation till en ledbrosk defekt.
Abstract
Vi konstruerade en belastning som är kapabel att tillämpa enaxlig eller tvåaxlig mekanisk påfrestning till en vävnadsteknisk biokompositer tillverkade för transplantation. Medan anordningen primärt fungerar som en bioreaktor som härmar de nativa mekaniska påkänningar, är det också utrustad med en lastcell för att tillhandahålla kraft feedback eller mekanisk provning av konstruktionerna. Enheten ämnen konstruerade brosk konstruktioner till biaxial mekanisk belastning med stor precision av laddningsdos (amplitud och frekvens) och är kompakt nog att få plats i en vanlig vävnadsodling inkubator. Den laddar prover direkt i en vävnadsodlingsplatta, och multipla plattan storlekar är kompatibla med systemet. Apparaten har konstruerats med hjälp av komponenter tillverkade för styrd laser applikationer. Bi-axiell belastning åstadkommes genom två ortogonala etapper. Stegen har en 50 mm rörelseområde och drivs självständigt av stegmotorn ställdon, som styrs aven sluten slinga stegmotor driver som presenterar mikro-stepping kapacitet, vilket gör steg som är mindre än 50 nm. En polysulfon loading formbordet är kopplad till den bi-axiella rörlig plattform. Förflyttning av stegen styrs av nog-labs Advanced Positioning Technology (APT) programvara. Stegmotorn drivrutinen används med programvara för att justera belastningen parametrar för frekvensen och amplituden hos både skjuvning och tryck oberoende och samtidigt. Positionsfeedback tillhandahålls av linjära optiska pulsgivare som har en dubbelriktad repeterbarhet på 0,1 m och en upplösning på 20 nm, översätta till en lägesnoggrannheten mindre än 3 mikrometer över hela 50 mm rörelse. Dessa givare ger den nödvändiga lägesåterkoppling till drivelektronik för att säkerställa sann nanopositioning kapacitet. För att tillhandahålla den kraft återkoppling att detektera kontakt och utvärdera lastning svar fungerar en precision miniatyr lastcell placerad mellan lastningen plattan och moving plattform. Lastcellen har hög noggrannhet på 0,15% till 0,25% av full skala.
Introduction
Vi har utformat en belastning bioreaktor som är i stånd att tillämpa enaxlig eller tvåaxlig mekanisk påfrestning till en vävnadsteknisk biokompositer tillverkade för transplantation. Denna enhet är i första hand avsedd som en bioreaktor för engineered ersättare för ledbrosk, det kan också användas för andra bärande vävnader i människokroppen. Vår motivation i denna bioreaktor designen kommer från Drachman och Sokoloff 1, som gjorde banbrytande observation av onormal bildandet av ledbrosk i förlamade kycklingembryon grund avsaknad av rörelse. Likaså är motion viktigt för utvecklingen av normala muskler och ben. I linje med detta koncept, har många forskargrupper undersökt hur olika typer av fysiska stimuli under odling in vitro modulerar de biokemiska och mekaniska egenskaper hos cell-biomaterial biokompositer och vävnadsdelar vävnad 2-7. Begreppet funktionell vävnadsteknikinvolverar in vitro-användning av mekaniska stimuli för att förbättra de funktionella egenskaperna hos vävnader, det vill säga de mekaniska egenskaper som gör att vävnaden för att motstå den förväntade in vivo påfrestningar 8,9. Talrika studier rapporterar användningen mekanisk belastning i form av skjuvning och tryck för att stimulera iscensatte brosk konstruktioner för artikulära lederna. Mauck et al. 10 tyder på att mekanisk belastning ensam kan inducera kondrogenes av mesenkymala stamceller även i frånvaro av tillväxtfaktorer som anses avgörande. Tillämpning av intermittent mekanisk belastning såsom kompression eller skjuvning under vävnadsodling har visats modulera brosk-och benbildning, men den optimala dosimetri för lastning varierar med cell och egenskaper vävnad 11.
Den viktigaste funktionen av ledbrosk är förmågan att motstå kompressionskrafter och skjuvkrafter inomleden, därför måste det ha hög tryckhållfasthet och skjuvmodulerna. Bristen på fungerande mekanisk hållfasthet och fysiologiska ultrastrukturen i engineered brosk har resulterat i fördelningen på neo-brosk in vivo och den misslyckade strategier broskcellstransplantationer i lederna. Även kompression och skjuvning har ofta visat att modulera och förbättra mekanisk hållfasthet Biokompositer ledbrosk, är en kombination tillvägagångssätt sällsynt 6,12-15. Wartella och Wayne 16 utformat en bioreaktor som gällde spänning och kompression för att producera meniskbrosk ersättare. Waldman et al. 15 utformat en anordning för att tillämpa kompression och skjuvning till kondrocyter odlade i ett poröst Kalciumpolyfosfat substrat. Bian et al. 17 visade mekaniska egenskaper matchande nativt brosk med in vitro odling av vuxna canine kondrocyter i geler och tillämpning av biaxiell mechanical belastning (komprimerande deformerande lastning och glidande kontakt lastning).
Den biaxiala mekanisk belastning bioreaktor designades ursprungligen av Danielle Chu i vårt laboratorium med det övergripande målet att inducera morfologiska anpassningar i vävnadsteknisk brosk konstruerar resulterar i högre tryck-och skjuvmodulerna än idag finns 18. Vi tror att denna forskning kommer att öka betydligt vår bredare förståelse för hur mechanotransduction kan moduleras till ingenjör kliniskt relevanta vävnaderna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utformat en belastning som är kapabel att tillämpa enaxlig eller tvåaxlig mekanisk påfrestning för vävnadstekniska konstruktioner tillverkade för transplantation. Anordningen kan användas som en bioreaktor för odling in vitro av konstruerade biokompositer eller som en testanordning för att beskriva de mekaniska egenskaperna hos den naturliga vävnaden eller efter andra behandlingar före. Enheten försökspersoner engineered vävnad konstruktioner till biaxiell mekanisk belastning med stor prec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Office of Research and Development, RR & D service, US Department of Veterans Affairs, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 och försvarsdepartementet W81XWH-10-1-0643.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Bilgen, B., et al. Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
