Summary
חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS) ממלא תפקיד מכריע במאבק נגד לחץ חיידקים. מאמר זה עוסק בטיהור
Abstract
סטרס חמצונים הוא תוצר לוואי בלתי נמנע של חיים אירוביים. חמצן מולקולרי הוא חיוני לחילוף חומרים יבשתיים, אבל זה גם לוקח חלק במספר רב של תגובות מזיקות בתוך אורגניזמים חיים. שילוב של חילוף חומרים אירוביים וברזל, שהוא תרכובת חיונית אחרת לכל חיים, זה מספיק כדי לייצר רדיקלים דרך הכימיה פנטון ולבזות מרכיבים תאיים. השפלה ה-DNA היא לטעון את התהליך המזיק ביותר מעורב רדיקלים תאיים, כתיקון DNA הוא רחוק מלהיות טריוויאלי. Assay שהוצג במאמר זה מציע שיטה כמותית למדידה ולהמחיש את ההשפעה של מולקולות ואנזימים בניזק לדנ"א רדיקלי בתיווך.
Assay הגנת ה-DNA הוא כלי פשוט, מהיר, וחזק לאפיון במבחנה של מאפייני ההגנה של חלבונים או חומרים כימיים. זה כרוך בחשיפת DNA לתגובת חמצון מזיקה והוספת ריכוזים שונים של המתחם של עניין. הצמצום או הגדלה של נזק לדנ"א כפונקציה של ריכוז תרכובת אז דמיין באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. במאמר זה אנו מדגימים את הטכניקה של assay הגנת ה-DNA על ידי מדידת התכונות המגנות של חלבון ה-DNA המחייב מהתאים מורעבים (DPS). DPS הוא מיני פריטין כי הוא מנוצל על ידי יותר מ -300 מיני חיידקים כדי להילחם בעוצמה גורמי לחץ סביבתי. כאן אנו מציגים פרוטוקול טיהור DPS ואת התנאים האופטימליים להערכת assay הגנת ה-DNA על ידי DPS.
Introduction
יצורים אירוביים כל הזמן צריכים להתמודד עם מיני חמצן תגובתי שיכול לגרום נזק DNA שלהם, כמו גם מולקולות ביולוגיות חיוניות אחרות. כלי רב עוצמה אחד כדי לנטרל את ההשפעות הרעילות של נזק חמצוני הוא חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS). מאז גילויו בשנת 1992 מא 'המורעבת coli תרבות 1, DPS זוהה יותר מ -300 מינים של חיידקים ו2 archaebacteria. upregulation המסיבי של DPS בשלב נייח הופך אותו לחלבון nucleoid הקשורים הגבוהה ביותר בא לידי ביטוי של א ' coli בתנאים רעב 3, 4. בנוסף, DPS הוכח גם לשמר יכולת קיום חיידקים ויושרה DNA במהלך רבים לחצים שונים, כולל הרעבה, ריכוז ברזל גבוה, חשיפה לאור UV, הלם חום, וסטרס חמצוני 5, 6.
מבחינה מבנית, DPS עצמי מקורבים לקומפלקס הומו-oligomeric יציב של 12 מונומרים, Which להרכיב לתוך קליפה חלולה כדורית. החלל הפנימי ~ 4.5 ננומטר הרחב נגיש לחוץ הממס דרך נקבוביות המאפשרים מעבר של מולקולות קטנות 7, והוא יכול לעקל מתכות mineralized כגון ברזל 8. ההשפעה המגנה של DPS נובעת ממספר הפעילויות ביוכימיות, הכוללות לא ספציפי DNA 1 מחייב, פעילות ferroxidase, ואחסון ברזל 8.
מחקר מפורט של פעילויות ביוכימיות המיטיבות של DPS דורש הטיהור הראשון שלה. טיהור DPS היא הליך מורכב, שיש להפריד DPS לא רק מחלבונים אחרים, אלא גם מכל ה-DNA מאוגד 7. תהליך הטיהור האופטימלי שלנו משתמש בטכניקות נפוצות רבות, בהיקף של שתי עמודות החלפת יונים וצעד ממטרים אמוניום סולפט. חילופי חיץ כמה יש צורך, כעקורים מרוכזים מאוד יכולים לזרז את הפתרון בתנאי מלח נמוך. ברגע שהחלבון DPS כבר מטוהר, זה עשוי להיות מיושם למבחנים שמודדים ישירות את פעילותה ferroxidase 8, stoichiometry-DNA מחייב 9, ומנגנונים של ברזל מחייב 10. DPS המטוהר יש גם יישומים פוטנציאליים אחרים. המבנה הכדורי החלול היציב של DPS שימש כפיגומים לאחסון חלקיקים הידרופובי בתוך חלל החלבון 11 ואפילו כתא תגובה לסנתז חלקיקים מגנטיים רומן 12.
היכולת המגנה של DPS לתווך נזק עקב מיני חמצן תגובתי יכולה להיות ברורה וישירה הפגינה באמצעות assay-DNA הגנת 13, 14. בהליך זה במבחנה, מינים רדיקליים מיוצרים כאשר הברזל מזרז השפלה H 2 O 2 דרך הכימיה פנטון. רדיקלים אלו באופן ישיר לפגוע בהווה DNA בתגובה ויכולים להשפיל אותו לחלוטין בריכוזים גבוהים. שתי פעילויות מרכזיות עשויות DPS הן במישרין לנטרל את ההשפעות של Fentייצור רדיקלי בתיווך. DPS מוריד את ריכוז ברזל קטליטי באמצעות מינרליזציה, צורך את חמצן זמין בתהליך. בנוסף, ל-DNA מחייב DPS פוטנציאלי עלול להגן עליו מפני נזק פיזי קיצוני ומתעבה אותו לתוך נפח קטן יותר עם שטח פנים פחות תגובתי. שילוב של שני מאפיינים אלה הופך את הגנת ה-DNA assay גם מתאים לצורך מדידת פעילות DPS מגן.
Assay הגנת ה-DNA הוא צדדי למדי ויכול לשמש למגוון רחב של יישומים מעבר לאפיון DPS. ניזק של רדיקלים הוא צורה נפוצה של מתח בתאים, וחלבונים רבים ושונים וכימיקלים המשמשים כדי לנטרל אותו. העיקרון הכללי של assay, תוך שימוש בשלמות הדנ"א כסמן לנזק של רדיקלים, ניתן להשתמש בו בשילוב עם כמעט כל תגובה קיצונית לייצור או סוכן מנטרל. בין יתר, assay כבר השתמש בהצלחה כדי לקבוע תכונות אנטי חמצונישל ק תמצית paniculata לשימוש בתעשיית מזון 15, כדי לאפיין את ההשפעות של חומצת שתן בגישור נזק הידרוקסיל 16, ולהשיג תובנות חדשות על תפקודם של חלבוני רגולטור 17 תעתיק פרווה.
למרות שימושים רבים של assay במסמכים שפורסמו, מצאנו כי אופטימיזציה רבות וצעדים לפתרון בעיות נדרשו, מה שהופך את הקמת assay בפעם הראשונה תהליך מייגע שלא לצורך לחוקרים רבים. הפרוטוקול אנו מציגים במאמר זה מטרתו להסיר את המכשול הזה לכניסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ביטוי וטיהור DPS
קבלת חלבון של טוהר גבוה היא צעד ראשון חיוני לassay-DNA הגנה. טיהור של חלבון DPS יכולה להתבצע ב4 עד 5 ימים.
- להפוך זן פרוטאז לקוי של א ' coli (כגון BL21 (DE3) pLysS) עם וקטור PET (כגון pET17) שלתוכו רצף חלבון קידוד DPS כבר משובט.
- פס הפך את תאים לצלחות מרק לוריא (LB) אגר המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (כמו אמפיצילין וchloramphenicol לדוגמות שסופקו ב1.1). דגירה צלחות הלילה בשעה 37 ° C.
- לחסן מושבה אחת מהצלחת לתוך 30 מ"ל של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד ב 200-250 סל"ד.
- לחסן 2 מדיום LB L 1 X המכיל אנטיביוטיקה מתאימה עם 10 כל אחד מתרבות לילה מ"ל. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, ואילו רועד, לקוטר 600
- קציר תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 6000 במשך 15 דקות. Resuspend את כדורי התא ב7.5 מ"ל של חיץ DEAE (50 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 100 מ"מ NaCl, 0.1 מ"מ EDTA) לכל ליטר של תרבית תאים מושרה. דוגמאות ניתן להקפיא בחנקן נוזלי ומאוחסנות ב -80 ° C, אם תרצה בכך. ההליך לאחר מכן ניתן להמשיך על ידי הפשרת הדגימות באמבט מים ב 4 ° C.
- הוסף תערובת של מעכבי פרוטאז (כגון מעכבי פרוטאז Calbiochem סט שלישי, ב0.167 μl לכל מ"ל של השעיה תא) להשעית התא כדי למנוע השפלה של DPS overexpressed.
- להכין תמצית תא ללא שימוש בעיתונות צרפתית. ראש העיתונות הצרפתית עם 20 מ"ל DEAE מאגר (אם משתמש במודל זרימה רציפה), ואז disrupלא מדגם פעמיים ב 20 KPSI. צנטריפוגה XG lysate ב30,000 עבור 35 דקות ב 4 ° C כדי להבהיר חלקיקים מסיסים, ולשמור את supernatant. Supernatant אז יכול להיות קפוא באמצעות חנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 ° C, אם תרצה בכך.
- לאזן עמודת 30 מיליליטר DEAE Sepharose CL-6B עם DEAE הצפת, באמצעות FPLC. הפעל חיץ דרך העמודה ב1-2 מ"ל / דקה עם לחץ מקסימאלי של 0.2 מגפ"ס על רקע. טען את תמצית תא ללא על הטור, ומתחיל לאסוף את הזרימה דרך פעם אחת את אות OD 280 מתחילה לעלות מעל קו בסיס. לשטוף את העמודה עם DEAE הצפת ערך OD עד 280 חוזר לנקודת התחלה, תוך איסוף הזרימה דרך ברציפות. זרימה דרך אמור להכיל את רוב חלבון DPS, ללא תשלום מ-DNA המאוגד. לשטוף את העמודה עם 100% הצפת B (50 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 1 M NaCl, 0.1 mM EDTA). eluate זה מכיל מתחמי DPS-DNA כמו גם חלבונים אחרים, ויכול להיות מושלך.
- הסר את המודעהditional מזהם חלבונים באמצעות ממטרים אמוניום סולפט. לקבוע את עוצמת הקול של נקווה זרימת הדרך. לאט לאט (על פני תקופה של 10-20 דקות) להוסיף אמוניום סולפט קטן תבואה היבשה לרוויה 62% (390 מ"ג לכל מ"ל של תמיסה) ב 4 ° C תוך ערבוב טוב. מערבבים את התערובת במשך 20-30 דקות נוספות לאחר הוספת החלק האחרון של אמוניום סולפט כדי להבטיח איזון מלא. DPS יישאר מסיס, ואילו חלבונים מזהמים יהיו לזרז את הפתרון.
- הסר חלבונים זרזו ידי צנטריפוגה XG ב 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C ולשמור את supernatant.
- לאט לאט להוסיף אמוניום סולפט 227 מ"ג נוסף לכל מ"ל של supernatant להגיע 94% רוויה ומערבבים במשך 20-30 דקות על מנת להבטיח איזון מלא. DPS משקעים בריכוז מלח גבוה וזה יכול להיות שנאסף על ידי צנטריפוגה XG ב 20,000 עבור 30 דקות ב 4 ° C. DPS יהיה בגלולה; יכול להיות מושלך supernatant. ניתן לאחסן את גלולה ב -80 מעלות צלזיוס אם desired.
- Resuspend גלולה המכילה-DPS במאגר resuspension (50 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 0.1 mM EDTA). התאם את נפח הדגימה של 2.5 מ"ל.
- חיץ חילופי להסיר אמוניום סולפט באמצעות עמודת סינון PD-10 ג'ל. לאזן מיטת ג'ל עם 25 הצפת resuspension מ"ל. החל מ"ל של 2.5 מדגם DPS לחלק העליון של PD-10 העמודה ולאפשר לו לספוג פנימה מחק את הזרימה דרכו. לאסוף DPS על ידי משחררי עם 3.5 הצפת resuspension מ"ל.
- צנטריפוגה מדגם-החליף חיץ XG 16,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את כל רכיבים מסיסים, ולדלל אותו עם 6-10 חיץ דילול מ"ל (50 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 0.1 mM EDTA) על מנת להבטיח כי ריכוז המלח הוא נמוך מספיק בשביל DPS להיקשר לעמודת Sepharose SP. דגימות במיוחד מרוכזות של DPS עשויות להיות פחות מסיסה על דילול לתוך מאגר התחתון מלח, כפי שמעיד עננות של הנוזל, אך ניתן resolubilized לחלוטין על ידי התוספת של amou קטןNT של פתרון 5 M NaCl (10-20 מ"מ נוסף).
- לאזן עמודת 30 מיליליטר SP Sepharose מהירה זרימה עם SP המאגר (50 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 מ"מ NaCl, 0.1 mM EDTA). הפעל חיץ דרך העמודה ב1.5-2 מ"ל / דקה עם מגבלת לחץ של 0.3 MPa על רקע. טען את המדגם על העמודה. לשטוף עם SP מאגר עד שחוזר קורט 280 OD לנקודת התחלה, וזורקים את הזרימה דרך. הפעל שיפוע ליניארית 150 מ"ל מ -0 ל -100 ב 'הצפת%, תוך איסוף שברים 2 מ"ל. DPS יהיה elute בשיא חד בסביבות 50% ב ', אם כי ב -10% הווריאציה אפשרית.
- הפעל את השברים elution על 15% ג'ל-SDS, ולבדוק אם יש זיהום הדנ"א על ידי מדידת יחס 280 260 / OD OD באמצעות ספקטרופוטומטר. ג'ל רק צריך להראות להקה אחת סביב 19 kDa, ו260 / 280 קוטר חיצוני קוטר חיצוני הוא בדרך כלל סביב 0.7. הברכה שברי DPS הטהור ביותר. השתמש ביחידת מסנן צנטריפוגלי (כגון יחידת סינון Ultra Amicon) עם10K משקל מולקולרי החתך כדי לרכז את העקורים ולהחליף אותו למאגר אחסון (50 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 מ"מ NaCl). Aliquot העקורים המטוהרים, ולהקפיא בחנקן נוזלי לאחסון ב -80 ° C.
2. Assay הגנת ה-DNA
Assay כרוך שלבים רגישים לזמן מרובים וצריך להיות מתוזמן לשנייה כדי להשיג תוצאות לשחזור. מרכיבים רבים וצעדי pipetting מעורבים, ולכן שולחן pipetting (ראה טבלה 1) רצוי לעקוב אחר צעדים ואמצעי אחסון. הזמן הכולל הנדרשים עבור assay הוא לא יותר משעה 3.
- מדוד 30 מ"ל מים לתוך בקבוקון אטום; לשטוף את המים עם N 2 במשך 10 דקות (באמצעות מזרק שתי מחטים, אחד בנוזל, אחד מעליו) כדי להסיר את החמצן מפתרון. הוסף 0.0168 4 • 2 O 7H גרם FeSO למים כדי להשיג פתרון מניית 2 מ"מ. לאטום את הבקבוקון ולשטוף עם חנקן במשך 5 דקות נוספות, ואז לערבב. הפתרון חייב להיותברור, אם כל רמז לצהוב הוא לגילוי, להכין פתרון ברזל חדש.
- הפוך 100 מ"מ פתרון H 2 O 2 (10.87 μl של 9.2MH 2 O 2 לתוך מים 1 מ"ל); לשמור על קרח ומוגן מפני אור על ידי עטיפה בנייר אלומיניום. השתמש אך ורק לכ 1-2 שעות לאחר הכנה בשל דעיכה ספונטנית. מניית מי חמצן היא באופן דומה בכפוף להתמוטטות, שעשויים להשתפר באופן חלקי על ידי אחסון נאות (בחושך, על 4 מעלות צלזיוס). בדיקות תקופתיות של ריכוז המניות על ידי מדידת 240 OD מומלצות.
- הפשירי aliquot של מטוהר DPS במהירות באמבט מים בטמפרטורת חדר, ולשמור על קרח. צנטריפוגה במשך 10 שניות ב 4000 XG בpicocentrifuge בראש טבלה למצרפי משקע. למדוד את הריכוז לאחר centrifuging באמצעות ספקטרופוטומטר (OD 280 = 1.547 מציין ריכוז של 100 DPS מונומר מיקרומטר).
- לדלל DNA ליניארי מ- ריכוז גבוה מניות באמצעות מאגר התגובה 12x (1M-מגבים KOH pH 7.0, 1 M NaCl) בריכוז של 100 ng / μl. ה-DNA לינארי משמש כדי להפוך את הכימות קל יותר, אבל פלסמיד דנ"א עשוי לשמש גם כן.
- פיפטה μl 1 של תערובת ה-DNA החיץ לתוך צינור ה-PCR. הוסף מספיק מים לתגובה, כך שנפח התגובה הסופי (מינוס SDS) יהיה 12 μl. סכום זה צריך להיות מחושב מראש באמצעות טבלת pipetting. הוסף DPS לריכוז dodecamer סופי של 3 מיקרומטר. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, כדי לאפשר לעקורים להיקשר ל-DNA.
- הוסף מספיק פתרון 2 מ"מ FeSO 4 כדי להגיע לריכוז הרצוי. ניסוי טיפוסי משתמש במגוון של ריכוזים מ -0 עד 1 מ"מ FeSO 4. ריכוזים גבוהים יותר יגרמו לפירוק ה-DNA נרחב יותר, אלא גם עשויים להוביל להיווצרות של הברזל שוקע בתערובת התגובה. להוסיף במהירות של 1 μl פתרון 100 מ"מ H 2 O 2 (לריכוז סופי 10 מ"מ), ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות על מנת לאפשר לפנטוןתגובה בתיווך השפלה להתקיים.
- הוסף 0.8 μl של 20% SDS (נתרן גופרתי dodecyl). לערבב ולדגור על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לשבש את מתחמי DPS-DNA. SDS מערער מורכב DPS-DNA ומונע משמרות ג'ל לא רצויות עבור ה-DNA, אשר משפרת את הקלות של כימות. צעד אופציונלי הוא לעצור את התגובה על ידי מי חמצן catalytically המשפיל למוצרים שאינם רעילים. לתנאים שתוארו בפרוטוקול זה, בשלב זה אין צורך להשיג מגוון רחב של השפלה ה-DNA.
- לדגור על קרח במשך דקות 1, להוסיף טעינת צבע, ולטעון על ג'ל agarose. הרץ את הג'ל, וכתם לדנ"א באמצעות ethidium ברומיד. ג'ל צריך להיות לאחר אלקטרופורזה מוכתמת ולא לפני אלקטרופורזה, כדי למנוע SDS מלהתערב בחלוקת רומיד ethidium בג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תהליך הטיהור לעקורים שתוארו כאן הוא מאוד לשחזור. DPS טיהור על פי הפרוטוקול המתואר, באמצעות 2 ליטר של א ' תרבות coli כנקודת התחלה, בדרך כלל תניב 2.5 מ"ל של חלבון המכיל 12 DPS בריכוזים שבין 5 ו -12 מיקרומטר. זמני אינדוקציה ארוכים יותר (4 שעות) נראים להפחית השונות הזאת. טוהר חלבון הוא באופן עקבי מעל 99%, כפי שמעיד על ידי-SDS ג'ל (איור 1). רמת זיהום ה-DNA היא זניחה באופן עקבי, כפי שמעיד הן על ידי ג'ל agarose מוכתם עבור ה-DNA ואת יחס OD 260 / OD 280. ערך זה יכול להשתנות, אבל הם אף פעם לא ערכים מעל 0.9, מצביעים על כך שרמות זיהום הדנ"א להישאר הרבה מתחת ל -5%.
שחזור של התוצאות של assay הגנת ה-DNA יהיה תלוי במידה רבה על הוצאה להורג. אם הריכוזים של כל המרכיבים נמדדים בדיוק (במיוחד את ריכוז החלבון שלאחר centrifugation), ופעמים לדגירת דגימות עולות בקנה אחד, באופן עקבי את התוצאות יהיו דומות לאלה שמוצג באיור 2. אם תנאים פחות אידיאליים, השתנות קטין בין מבחני יהיו גלויות, למרות עלייה כללית בשפלת DNA עם ריכוז ברזל הגדלת עדיין תהיה נראית לעין. ניתן לכמת את התוצאות שהושגו באמצעות assay הגנת ה-DNA על ידי השימוש בתוכנת עיבוד תמונה כגון ImageLab. איור 3 מציג את התוצאה של כימות זה, בממוצע לכל שלושה מבחני. הברים השגיאה מצביעים על הרמה הגבוהה הכללית של שחזור מתקבלת.
איור 1. צעדי ביניים של טיהור DPS, נותחו על ידי-SDS (1) תמצית ללא תא;. (2) זרימה דרכו של טור Sepharose DEAE; (3) eluate של עמודת DEAE; (4) supernatant של סול אמוניום 60% ממטרים גורל; (5) DPS מדגם לאחר 90% אמוניום סולפט הממטרים וחילופי חיץ על ידי PD-10 עמודה; (6) נקווה שברים טהורים DPS לאחר עמודת Sepharose sp; (7) סמני משקל מולקולריים חלבון. האחוזים בחלק התחתון של כל מסלול לציין טוהר DPS כפי שנקבעו על ידי תוכנת כימות תמונה (ImageQuant TL).
איור 2. הגנת DPS בתיווך של ה-DNA מן השפלה חמצוני. כל הנתיבים מכילה 100 ng של DNA ליניארי 5 קילו. (1) ה-DNA בלבד; (2) ה-DNA עם 1 מ"מ H 2 O 2, (3) ה-DNA עם 1 מ"מ H 2 O 2 ו 166 מיקרומטר FeSO 4; (4) עד (8) ה-DNA עם 3 DPS 12 מיקרומטר, 1 מ"מ H 2 O 2, וריכוז ברזל הגדלת (0 מיקרומטר, 166 מיקרומטר, 333 מיקרומטר, 666 מיקרומטר ו -1,000 מיקרומטר) משמאל לימין.
איור 3. חלק של ה-DNA ניזוק כפונקציה של ריכוז ברזל, בממוצע לכל שלוש חזרות של assay הגנת ה-DNA. ברים שגיאה מציינים את סטיית התקן של הממוצע. תנאים: 100 ng של DNA ליניארי 5 קילו, 1 מ"מ H 2 O 2, 3 DPS 12 מיקרומטר במאגר תגובת 1 X (83 מ"מ HEPES-KOH pH 7.0, 83 מ"מ NaCl). אין שליטת החלבון בוצעה באמצעות אותם התנאים, אלא בריכוז של 0 DPS 12 מיקרומטר.
טבלת מס '1. דוגמה לשולחן pipetting בסיסית. בצע pipetting עבור כל עמודה בכל פעם, לפי סדר משמאל לימין. זמן הדגירה לאחר כל צעד pipetting מצוייניםבשורה האחרונה. איגום של מרכיבים מצויינים באמצעות סימן החיבור בין תאים בעמודות 3 ו -4, המציין את ה-DNA והחלבונים צריכים להיות pipetted מצינור אחד משותף המכיל את שני המרכיבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תהליך הטיהור של העקורים כפי שתואר במאמר זה הוא מאוד חזק. טוהר היה גבוה באופן עקבי (> 99%); אין חלבונים אחרים מופיעים בג'לי-SDS כמו להקות נראות לעין. למרות זאת, נראות כמה קבוצות של DPS המטוהר יש פעילות nuclease, כפי שמעידים השפלה DNA חלקית כאשר טופחו עם ריכוזים גבוהים מאוד של DPS. זה עשוי להעיד על הנוכחות של DNases מאוד פעיל בריכוז נמוך שלא הצליחו להסיר באמצעות טיהור. עם זאת, ה-DNA השפלה זו נצפתה רק בריכוזים שאינם משמשים בדרך כלל למבחני חוץ גופית, כך שזה בדרך כלל לא מהווה בעיה.
יש פרוטוקול טיהור DPS כפי שהוצג במאמר זה כמה נקודות חזקות. החלבון לא חייב להיות זיקה מתויג, כך שאין אפשרות להתערב בפונקציה קיימת. החלבון מטוהר הוא נטול ה-DNA, כך במבחני חוץ גופית הכולל מאפיינים ה-DNA מחייבים לא יסבלומממצאי זיהום אפשריים. לבסוף, DPS המטוהר מכיל כמעט שום ברזל (<1 אטומי ברזל / dodecamer DPS) מאוחסן בתוך חלל החלבון, באמצעות שיטת ferene של ברזל כימות 18, 19. תכונה זו מאפשרת לשלוט בדיוק מה שנטען בתוך חלל DPS או להשתמש בDPS חלול מורכב כמייקר כור ללא דאגות לגבי הפרעה.
Assay הגנת ה-DNA הוא דרך מהירה ואמינה כדי לאפיין את התכונות הטיפוליות של DPS במבחנה. הטכניקה מציעה שיטה פשוטה כדי להדגים את ההשפעה המגנה של ביטוי DPS על כדאיות סלולרית מבחינה פיזית. Assay יכול לשמש כדי לקבל נתונים כמותיים על מידה המסוימת של הגנת ה-DNA המסופקת על ידי DPS או אנזימים אחרים הפועלים כנגד נזק חמצוני, וניתן לקחת כמה צעדים כדי לשפר את שחזור שלה.
הכנה מגיב היא שלב חשוב, כמו concentratio מדויקמדידות n הן חיוניות. הדרך הטובה ביותר הוא להשתמש באותה מניית DNA לכל הניסויים כדי להבטיח שריכוז ה-DNA לא משתנה בין מדידות. במקרה שלנו הוציאו כמה מיליגרם של ה-DNA פלסמיד באמצעות ערכת Maxiprep (Promega) ומתעכלים לרסיסים ליניארי באמצעות אנזים הגבלה יחידה חותך. בנוסף, לא refreeze חלבון DPS לאחר ההפשרה; תמיד לעבוד עם aliquot טריות כמו הקפאה והפשרה חוזרת ונשנית עשויים להוריד את הפעילות. הכנת DPS aliquots בזמן הטיהור בערך באותו הנפח כמו הניסוי דורש ימנע בזבוז יתר של חלבון. מהירות centrifuging החלבון לפני מדידת הריכוז הוא חיוני, שכן אחרת אגרגטים חלבון יובילו לoverestimations של ריכוז חלבון פעיל. לבסוף, מקדיש כמה דגימות כדי לפקח אם החומרים הכימיים פועלים כמו ה-DNA למשל (הצפויה לבדו, ה-DNA עם H 2 O 2, ה-DNA עם H 2 O 2 ו FeSO Assay הגנת ה-DNA הוא די רגיש לפעמי דגירה, ולכן כל צעד צריך להיות מתוזמן בצורה מדויקת ככל האפשר. כאשר עושים ניסויים רבים, מומלץ ללהתנודד דגימות כדי לוודא שתקופות דגירה תישאר קבועה בין דגימות. ממוצעים של מעל ניסויים מרובים מסייע בהסרת כל שגיאות הציגו דרך פעמים דגירה לא עקביות, אבל השגיאה הכללית יכולה להיות מופחת על ידי תזמון מדויק. ניתן להציע כמה טיפים לאופטימיזציה של חוקרי assay הגנת ה-DNA לחלבונים (או כימיקלים) אחרים מאשר DPS. ההיבט החשוב ביותר הוא לייעל את היחס בין כמות DNA, קצב ייצור רדיקלי, וסדר הגודל של ההשפעה המגנה שנחקרת. עד יחס אופטימלי נמצא, מבחני רבים באמצעות DPS הראו גם הרס מוחלט של ה-DNA או ללא השפעה המגנה נראית של האנזים. מניסיוננו, דרך יעילה לPErform אופטימיזציה זו היא לבחור ריכוז גבוה למדי של חלבון, לבחור כמות ה-DNA שיהיה גלויים לעין בג'ל בלי oversaturating את זה, ולקבוע ריכוזים ספציפיים של H 2 O 2 וFeSO 4 שבכל הדנ"א זמין הוא נהרס. לאחר מכן, סדרה של מדידות באמצעות מגוון של FeSO 4 ריכוזים בין אפס והשווי שנקבע תגלה טווח דינמי של הגנת ה-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה למיקלה דה מרטינו, וילפרד ר 'הייגן, וKourosh Honarmand אברהימי לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק מימון מאוניברסיטת דלפט לטכנולוגיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 | |
| Sodium chloride | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Static incubator | Hettich | INE500 | |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA | |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Syringe needles | BD | 305128 | |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
- Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
- Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
- Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
- Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
- Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
- Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
- Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
- Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
- Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).
- Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
- Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).
- Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
- Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
- Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
- Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
- Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).
