Summary
（DPS）从饥饿细胞的DNA结合蛋白起着至关重要的作用打击细菌应力的。本文讨论了净化
Abstract
氧化应激是一个不可避免的副产品的有氧生活。地面代谢分子氧气是必不可少的，但它也需要在许多破坏性反应于生物体的部分。通过Fenton化学降解细胞成分产生自由基相结合的有氧代谢和铁，这是生活的另一种重要的化合物，是足够的。 DNA降解无疑是最具破坏性的过程，涉及细胞内的自由基，DNA修复是远从琐碎。在这篇文章中提出的检测提供了一个定量的测量和可视化技术，分子和酶的作用自由基介导的DNA损伤。
DNA保护法是一种简单，快速和强大的工具， 在体外蛋白质或化学品的防护性能表征。它涉及曝光的DNA的损害性的氧化反应，加入不同浓度的化合物还。作为化合物浓度的函数的DNA损伤的减少或增加，然后可视化，使用凝胶电泳。在这篇文章中，我们展示了保护的DNA检测技术，通过测量DNA结合蛋白的保护性饥饿细胞（DPS）。 DPS是一个小型铁，动用300余种细菌，有力地打击环境压力。在这里，我们提出的的DPS净化协议和评估DNA保护DPS优化实验条件。
Introduction
需氧生物必须不断抗衡，可以破坏它们的DNA，以及其他重要的生物大分子的活性氧。对抗氧化损伤的毒性作用的一个有力的工具是从饥饿细胞的DNA结合蛋白（DPS）。自从被发现于1992年，从饥饿E.大肠杆菌培养1，DPS中已发现300余种细菌和古细菌2。 DPS在固定相的大规模上调使得它表达最高度的拟核相关蛋白的大肠杆菌饥饿条件下3，4的 大肠杆菌 。此外，已被证明的Dps保留在许多不同的应力，包括饥饿，铁浓度高，紫外线照射，热休克，氧化应激5，6细菌的生存能力和DNA完整性。
在结构上，DPS自联营成一个稳定的同源寡聚体复合物的12个单体，W一族组装成一个球形的空壳。 〜4.5 nm的范围内的内部腔体的溶剂可允许通过的小分子7的毛孔的外部访问，和，它可以螯合矿化的金属如铁8。 DPS的保护作用来源于几个生化活动，其中包括非特异性DNA结合，亚铁活动，和铁存储8。
对人体有益的生化活动的DPS，首先需要详细研究其净化。 Dps的净化是一个复杂的过程，Dps的必须不仅从其他蛋白质分离，但也从任何结合的DNA 7。我们已优化的纯化过程中使用许多常用的技术，包括两个离子交换柱和硫酸铵沉淀步骤。几个缓冲区的交流是必要的，高度集中的DPS可以在溶液中沉淀出来低盐条件。一旦DPS蛋白已被纯化，它可能是用于检测直接测量亚铁活性8，DNA-结合的化学计量学9，与铁结合的机制10。纯净DPS也有其他潜在的应用。稳定的中空球状结构的Dps被用作脚手架，用于存储在蛋白质内部空腔11的憎水颗粒，甚至作为一个反应室，以合成新颖的磁性纳米粒子12。
保护能力的DPS调解活性氧自由基造成的损害，可以清楚地直接证明使用DNA保护实验13，14。在这种体外过程中，产生自由基种，铁催化H 2 O 2通过Fenton化学降解。这些自由基直接损伤DNA存在于反应中，可以在高浓度下完全降解。两个关键的DPS活动都可能直接抵消的影响FENT在介导的自由基的产生。 Dps的催化铁的浓度降低通过矿化，在这个过程中消耗的可用过氧化氢。此外，DPS与DNA结合可能屏蔽它身体免受自由基的损害，并凝结成更小的体积与反应表面积少。这两个属性的组合，使得DNA为目的测量保护的Dps活动的适合的保护测定。
的DNA保护分析法是相当灵活的，可用于各种各样的应用程序之外的Dps表征。自由基损伤是一种常见的细胞形式的压力，和许多不同的蛋白质和化学品的使用，抵制它。测定的一般原则，使用作为自由基损伤的标记物的DNA的完整性，可以结合使用几乎任何产生自由基的反应剂或抵消。其中包括，该法已成功地用于确定抗氧化性能K的穿心莲提取物使用在食品行业15，表征尿酸对羟基损害调解16的影响，并获得新的见解毛皮转录调节蛋白17的功能。
尽管在发表的论文中检测的众多用途中，我们发现许多优化和故障排除步骤，这使得第一次不必要的艰苦的过程，许多研究者测定。在这篇文章中，我们提出的协议旨在消除这一屏障，为入境。
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Protocol
1。 DPS表达和纯化
获得高纯度蛋白的DNA保护实验是必不可少的第一步。可以在4至5天的Dps蛋白的分离纯化。
- 变换的蛋白酶缺陷型菌株大肠杆菌大肠杆菌 （如BL21（DE3）pLysS中）已被克隆到其中的Dps的蛋白编码序列的pET载体（如pET17）。
- 连胜转化细胞到的Luria肉汤（LB）琼脂平板，含适当的抗生素（如氨苄青霉素和氯霉素1.1中提供的例子）。过夜孵育板在37°C。
- 从板的单菌落，接种到含有适当抗生素的LB培养基中30毫升。孵育过夜，在37°C，而在200-250转摇晃。
- 物接种到2×1升含有适当抗生素的LB培养基中，用每次10毫升过夜培养。增长在37℃，一边摇晃，外径600
- 在6000×g离心15分钟，通过离心收获细胞。重悬细胞沉淀于7.5ml DEAE缓冲液A（50mM的HEPES-KOH，pH值7.5，100 mM氯化钠，0.1mM的EDTA）每L的诱导的细胞培养。样品在液氮中冷冻并储存在-80℃下，如果需要的话。然后，该过程可能会在水浴中解冻的样品在4℃下继续
- 蛋白酶抑制剂（Calbiochem公司的一套三蛋白酶抑制剂，例如，在每毫升的细胞悬浮液0.167微升）的混合物加入到细胞悬浮液，以防止过度表达的Dps退化。
- 准备使用法国记者无细胞提取物。总理，法国媒体20 ml DEAE缓冲区中（如果采用连续流模型），然后disrup吨样品20 KPSI两次。离心溶胞产物在4℃下以30,000×g离心35分钟以澄清不溶颗粒，并保存上清液。然后将上清液用液氮冷冻并储存在-80℃下，如果需要的话。
- 平衡30毫升DEAE琼脂糖凝胶CL-6B柱用DEAE缓冲液A，使用FPLC。运行缓冲液通过该柱在1-2毫升/分钟的最大压力为0.2MPa以上的背景。无细胞提取物加载到该列，开始收集流通过的OD 280信号一旦开始增加基线以上。用DEAE缓冲柱洗净A直到OD 280值返回到基线，同时不断收集流过。流过，应该包含大部分的DPS蛋白结合的DNA。用100％缓冲液B（50mM的HEPES-KOH，pH为7.5，1M NaCl的0.1mM的EDTA），清洗色谱柱。该洗脱液中包含的Dps-DNA复合物以及其他蛋白质，可以被丢弃。
- 删除广告ditional污染通过硫酸铵沉淀蛋白质。确定汇集流过的体积。慢慢地（10-20分钟）过了一段加到干燥的小颗粒硫酸铵至62％饱和度（390毫克每毫升的溶液），在4℃，同时充分搅拌。搅拌该混合物20-30分钟后，加入硫酸铵的最后部分，以确保完全平衡。 DPS将仍然是可溶的，而杂蛋白溶液中沉淀出来。
- 通过以20000×g离心30分钟除去沉淀的蛋白质在4℃下保存上清液。
- 慢慢地添加一个额外的227毫克每毫升上清液硫酸铵达到94％饱和度，搅拌20-30分钟，以确保完全平衡。 Dps的析出物在这样高的盐的浓度，并且可以在4℃下以20,000 xg离心30分钟，离心收集将沉淀的Dps，可以被丢弃上清液。的颗粒可以保存在-80°C如果德IRED。
- 重悬的DPS含有沉淀再悬浮缓冲（50毫米HEPES-KOH，pH值7.5，氯化钠150毫米，0.1毫米EDTA）。调整样本量为2.5毫升。
- 缓冲液交换，以除去硫酸铵使用的PD-10凝胶过滤柱。 25毫升缓冲液，平衡凝胶床。 Dps的样品2.5ml的应用PD-10柱的顶部，并允许它浸泡英寸的流量通过丢弃。 3.5毫升缓冲液，洗脱，收集DPS。
- 缓冲交换的样品在16000×g离心10分钟，在4℃以除去任何不溶性成分，用6-10毫升稀释缓冲液（50mM的HEPES-KOH，pH值7.5，0.1mM的EDTA）稀释，以确保盐的浓度足够低DPS绑定SP琼脂糖凝胶柱。尤其是浓缩的样品的Dps可能成为溶解后稀释到较低的盐缓冲液，就证明了混浊的液体，但也可以通过添加一个小型的AMOU resolubilizedNT 5 M氯化钠溶液（10-20毫米）。
- 平衡30毫升的SP琼脂糖凝胶快速流动SP缓冲区A柱（50毫米HEPES-KOH，pH值7.5，氯化钠50毫米，0.1毫米EDTA）。运行缓冲液通过该柱为1.5-2毫升/分钟的压力限制为0.3MPa以上背景。将样品到列。与SP缓冲区A直到OD 280跟踪返回到基线进行清洗，并丢弃的流量通过。运行一个150毫升的从0到100％缓冲液B的线性梯度，同时收集2毫升馏分。 DPS将洗脱在锋利的峰值在约50％的B，虽然10％的变化是可能的。
- 运行在15％SDS-PAGE凝胶上的洗脱级分，并通过测量OD 260 / OD 280的比例使用分光光度计检查DNA污染。凝胶应只显示一条带约19 kDa的，OD 260 / OD 280通常是0.7左右。游泳池最纯粹的DPS分数。使用离心式过滤器单元（如的Amicon超滤单元）与切断10K分子量集中的DPS和交换成一个存储缓冲区（50毫米HEPES-KOH，pH值7.5，氯化钠50毫米），。等分试样的纯化的Dps，并冷冻在液氮中储存于-80℃。
2。 DNA保护实验
实验包括对时间敏感的多个步骤，并应定时到第二，以获得可重复性的结果。涉及的许多成分和移液步骤，所以一个移液表（ 见表1）最好是跟踪的步骤和卷。为测定所需的总时间不超过3小时。
- 测量30毫升水放入密封的小瓶，用N 2冲洗的水10分钟（使用两个注射器针头，在流体中，它上面的一个）从溶液中除去氧气。添加硫酸亚铁0.0168克4·7H 2 O的水，获得了2毫米原液。密封的小瓶和冲洗5分钟，然后用氮气混合。解决方案必须清楚，如果检测到任何一丝黄色，准备一个新的铁溶液。
- 100毫米H 2 O 2溶液9.2MH 2 O 2（10.87微升到1毫升水）;保持在冰上，并通过包装在铝箔屏蔽光线。只可使用约1-2小时准备后，由于自发衰变。过氧化氢股票是同样的故障，这可能是部分通过适当的存储（在黑暗中，在4°C）改善。建议定期检查的股票浓度测量外径240。
- 在室温水浴纯化DPS迅速解冻等分，并保持在冰上。离心沉淀物聚集在表顶部的picocentrifuge的在4000×g离心10秒。使用分光光度计（OD 280 = 1.547，显示其浓度为100μM的单体的Dps）离心分离后的浓度测量。
- 使用高浓度的股票12X反应缓冲（1线性DNA稀释M MOPS-KOH，pH为7.0，1M NaCl的）的浓度为100毫微克/微升。使用线性DNA，使定量更容易，但也可以使用质粒DNA，以及。
- 中加入1微升的PCR管的DNA的缓冲液混合物进入。添加足够的水加入到反应，使最终的反应体积的（减去SDS）将12微升。此量应在使用移液表预先计算。添加DPS一个的最终dodecamer浓度为3微米。在室温下孵育15分钟，以允许与DNA结合的Dps。
- 加入足够的2mM的硫酸亚铁溶液，以达到所需的浓度。一个典型的实验中使用的浓度范围从0到1毫米硫酸亚铁。较高的浓度将导致更广泛的DNA降解，但也可能会导致形成的三价铁在反应混合物中析出。快速加入1微升100mM的H 2 O 2溶液（10mM的终浓度），5分钟，在室温下孵育，以允许芬顿介导的降解反应发生。
- 加入0.8微升20％的SDS（十二烷基硫酸钠）。混合，在85°C孵育5分钟，扰乱的DPS-DNA复合物。 SDS的DPS-DNA复合物的稳定性，并防止不必要的凝胶的DNA的变化，提高了易用性量化。一个可选的步骤，是通过过氧化氢催化降解成无毒的产品，使反应停止。在这个协议中所描述的条件，这一步是没有必要的，得到广泛的DNA降解。
- 在冰上孵育1分钟，加样染料，并加载在琼脂糖凝胶上。运行的凝胶，并使用溴化乙锭染色的DNA。电泳后的凝胶应被污染，而不是在电泳前，以防止干扰分布在凝胶中的溴化乙锭的SDS。
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Representative Results
这里描述的Dps的纯化方法是高度可再现性。 Dps的纯化，根据所描述的协议，使用2升的大肠杆菌大肠杆菌文化为出发点，通常会产生2.5毫升含蛋白质浓度在5和12微米之间的DPS 12。较长的诱导时间（4小时）似乎减少这种可变性。蛋白质纯度为99％以上，始终SDS-PAGE凝胶（ 图1）可见一斑。 DNA污染的水平，一直是可以忽略不计，证明通过琼脂糖凝胶染色DNA和OD 260 / OD 280比值。该值可以不同，但值总是在0.9以上，表明DNA的污染水平仍远低于5％。
DNA保护实验的结果的再现性将在很大程度上取决于在执行时。如果所有成分的浓度精确测量（特别是蛋白浓度后离心泵申请样品ifugation），温育时间的结果是一致的，将始终如一地类似于图2中所示的那些。如果条件不太理想的情况下，检测之间的轻微变化将是可见的，虽然DNA的降解，增加铁的浓度整体上升将仍是显而易见的。通过DNA保护实验获得的结果，可以通过使用图像处理软件，如ImageLab量化。 图3显示了在此定量的结果，超过三个实验的平均值。错误横道整体水平高再现性。
图1。 Dps的纯化的中间步骤的SDS-PAGE（1）无细胞提取物进行分析 ，（2）流通过的DEAE琼脂糖凝胶柱（3）DEAE柱洗脱液;（4）的60％的硫酸铵上清命运沉淀;（5）DPS样品后，90％的硫酸铵沉淀和PD-10柱缓冲交换;（6）汇集的纯DPS分数后SP阳离子交换柱（7）蛋白质分子量标记。每个车道上的底部的百分比表示DPS纯度所确定的图像量化软件（ImageQuant TL）。
图2。 DPS-介导的保护DNA免受氧化降解。所有车道线性5 kb的DNA含有100毫微克。 （1）唯一的DNA，（2）DNA用1mM H 2 O 2（3）的DNA用1mM H 2 O 2和166μM 硫酸亚铁（4）至（8）的DNA，3μM的Dps 12，1 mM的H 2 O 2，并增加铁的浓度（μM，166μM，333μM，666μM和1,000μM）由左到右。
图3。作为铁浓度的函数的，未损坏的DNA的级分，平均三次重复的DNA保护实验，误差条表示标准差的平均值。条件：100毫微克，1毫米5 kb的线性DNA H 2 O 2，3μMDPS 12在1×反应缓冲液（83毫米HEPES-KOH pH值为7.0，83 mM氯化钠）。没有蛋白质控制在相同条件下进行，除了与DPS 12 0μM浓度。
表1中。实施例的一个基本的移液表。执行的时间，从左至右的顺序为每个列的移液。每个移液步骤后的培养时间表示在最后一排。成分的池3和第4列中的单元格之间的加号表示，表明应移液管从一个共同的管含有两个成分的DNA和蛋白质。
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Discussion
在这篇文章中所描述的净化过程中的DPS是非常强大的。一直纯度高（> 99％）;没有其他蛋白质出现在可见光波段的SDS-PAGE凝胶。尽管这样，似乎有部分批次纯化DPS核酸酶活性，证明了部分DNA的降解，当孵育浓度非常高的DPS。这可能表明在低浓度高活性的DNA酶的存在，我们无法通过净化除去。然而，这种DNA降解只观察到的浓度通常不用于在体外测定的 ，所以这通常不存在任何问题。
DPS的净化在这篇文章中所提出的协议有几个强项。该蛋白不具有亲和标签，所以没有干扰功能的可能性存在。纯化的蛋白是DNA-free的，所以在体外实验中涉及的DNA结合性质不会受到从可能的污染文物。最后，纯化的Dps实际上不包含铁（<1铁原子/ Dps的dodecamer），，存储在蛋白质内部空腔，通过ferene的方法定量铁18，19。这一特性使得它能够精确地控制里面的DPS腔加载或使用复杂的微反应器的中空DPS没有干扰担心的。
DNA保护法是一种快速和可靠的方法来描述属性的DPS治疗在体外 。该技术提供了一个简单的物理方法证明DPS表达对细胞活力的保护作用。该试剂盒可用于获得Dps的或其他对抗氧化损伤的酶，DNA保护的程度，所提供的定量数据，可以采取几个步骤，以改善其重复性。
试剂的制备是一个重要的阶段，准确concentratioN次测量是必不可少的。最好是使用相同的DNA股票的所有实验，以确保DNA浓度不测量之间波动。在我们的例子中，提取几毫克的质粒DNA用Maxiprep试剂盒（Promega）和消化成线性片段，使用一个单一的切割限制性内切酶。此外，不要重新冻结解冻后的DPS蛋白始终与新鲜的等分反复冻融可能会降低活动。 Dps的等分试样制备的纯化在上面的时间大致相同的体积的实验要求将防止蛋白质的过度浪费。快速离心前的蛋白质浓度测量是至关重要的，否则蛋白质聚集导致高估活性蛋白浓度。最后，费尽几个样品，监测试剂是否如预期（ 例如 DNA，仅与H 2 O 2，DNA的DNA与H 2 O 2和硫酸亚铁 DNA保护实验孵化时间是相当敏感的，所以每一步都应该尽可能准确计时。在做了许多实验，这是最好错开，以确保保持恒定的样本之间的潜伏期的样品。平均多实验有助于消除引入任何错误通过不一致的孵化时间，但总体误差可以减少精确定时。 有几个技巧可以比DPS的蛋白质（或化学品）的DNA保护实验研究优化建议。进行优化的最重要的方面是DNA的数量，自由基产率，被调查的保护作用的幅度之间的比率。直至获得最佳的比率被发现，许多实验使用的Dps表明要么完全被破坏的DNA或没有可见的保护作用的酶。根据我们的经验，聚乙烯的一种有效的方式rform这种优化是选择一个合理的高浓度的蛋白质，选择的DNA量，这将是它没有过度饱和凝胶上清晰可见，并确定具体的H 2 O 2和硫酸亚铁的浓度在所有可用的DNA被破坏。然后，使用硫酸亚铁的浓度值在零和所确定的值的范围内的一系列测量揭示DNA保护的动态范围内。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
威尔弗雷德·哈根，德马蒂诺MICHELA，和Kourosh Honarmand埃布拉希米有益的讨论，我们非常感谢。这项工作是由代尔夫特理工大学的启动资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 | |
| Sodium chloride | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Static incubator | Hettich | INE500 | |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA | |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Syringe needles | BD | 305128 | |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
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