Summary
この記事の詳細腫瘍標的ナノ粒子、HerDoxの光学イメージング解析のための手続き。特に、ターゲティングおよび腫瘍浸透性を評価する腫瘍を検出するためのマルチモードの撮像装置の詳細な使用がここで記載されている。
Abstract
HER2 +腫瘍標的ナノ粒子、HerDoxは、HER2 +癌の動物モデルにおいて腫瘍優先的な蓄積および腫瘍増殖アブレーションを示す。 HerDoxは、小さな核酸リンカーを介して、化学療法剤、ドキソルビシン、腫瘍標的細胞透過タンパク質の非共有結合性の自己集合によって形成される。求電子性、インターカレーション、及びオリゴマーの相互作用の組み合わせは、ラウンド10〜20 nmの粒子に自己組織化を促進する。 HerDoxは異なる温度で血液中と同様、拡張ストレージに安定性を示す。心臓と肝臓（非標的ドキソルビシンによってマークされた被害を受けている）を含む非腫瘍組織には検出副作用、腫瘍細胞死における担癌マウス結果のHerDoxの全身送達。 HER2上昇が上昇したHER2のレベルを表示する腫瘍細胞の発現と比較して、よりHerDox蓄積を示すため、ヒト上皮成長因子受容体を発現する細胞を標的容易インビトロおよびインビボの両方で 、より低いレベルを歌う。 現場共焦点とスペクトル解析にと組み合わせる蛍光強度イメージングは、私たちが標的生体内腫瘍と全身送達後HerDoxの腫瘍細胞の浸透に確認することができました。全身送達後のマルチモードイメージングを介して標的の腫瘍を評価するためここでは詳細私たちの方法を。
Introduction
腫瘍ターゲティング化学療法の、配信療法のよりは、その目的の宛先に蓄積ではなく、非腫瘍組織に配布することができるので、関連性の低い薬に比べ低用量でがん細胞を排除する可能性を秘めている。後者の状況は、薬物の有効性を希釈し、より高い用量が効果的であることが必要となるので、腫瘍標的は、標準的な非標的治療上の両方の治療と安全性の利点があります。
自己組織化ナノ粒子にカプセル化することにより化学療法を標的とする薬剤が化学的に共有結合する分子を標的にリンクされている薬とは対照的に変更されていないままにすることができます。などの結合は、薬物および標的分子の両方の活性を変化させる可能性を有し、非共有結合アセンブリは、薬物の効力を保持することができる。
我々は以前に新規な三成分、自己組織化錯体、HerDoxは、HER2 +腫瘍を標的とすることが示されている
我々の以前の研究では、非腫瘍組織上および非標的Doxを1、およびin vivo 7 中の腫瘍細胞への浸透と比較して、腫瘍におけるHerDox利回り優遇蓄積のその全身送達を示している。我々は核1にDoxの蓄積を可能にし、腫瘍細胞侵入後HerDoxリリースDoxのことを観察した。腫瘍蓄積は比較的低HER2発現腫瘍は比較的高いHER2レベル1のものに比べてより少ないHerDox蓄積として、受容体レベルと相関することが表示されます。また、効果的な細胞死濃度が異なる細胞表面のHER2のレベル1を発現する腫瘍細胞株に対するHER2ディスプレイと逆相関を示す。腫瘍殺害解凍に比べて10倍も低い用量で発生するとHerDoxは、非標的ドックス以上の治療と安全優位性を発揮geted薬とは関連性の低いDoxの1とは対照的に、心臓（心エコー検査および組織学的染色によって検出された）や肝臓（染色TUNELによって検出された）組織には検出可能な悪影響をもたらしません。ウイルスキャプシドタンパク質からの派生にもかかわらず、HerPBK10は治療レベル2での検出可能な免疫原性を示さない。全体アデノウイルスに既存の抗体がHerPBK10を認識することができる一方で、彼らは、2細胞結合を防止することができない。
経時的に測定した腫瘍体積は、標的治療の治療効果を評価するための標準的な方法であり、HerDoxの治療効果を評価するために採用されている。 生体とex vivoでの蛍光強度イメージングでこのアプローチを補完する、私たちはより良い効率7をターゲットに評価することができました。我々は、特にそのHerDoxないことを確認しないようにDoxを蛍光のスペクトル分析で切り出した腫瘍の in situ共焦点イメージングに統合されているtは唯一のin vivoで腫瘍に蓄積されますが、細胞質と核の7への腫瘍細胞と配信ドキシサイクリンに浸透。スペクトル解析はさらに自家7からDoxの蛍光を区別することができました。
ここでは、全身送達後にin vivoで HerDoxを評価するための、より詳細に我々のアプローチを実証し、そして最も重要なのは、評価するためのマルチモードイメージング法と分析を通してターゲティング。
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Protocol
1。 生体内で全身送達
- 6-8週齢NU / NUマウスベアリング皮下二国間のフランク異種移植腫瘍に対する注射当たりHerDoxの0.004 mg / kgで投与量の0.2ミリリットルを同一視するように滅菌生理食塩水で十分にHerDox混ぜる。
- 優しく泡を避けて、29G針を装着し3/10 ccのインスリン注射器にHerDox混合物を描画します。
- 0.5〜1リットル/分、イソフルラン濃度：3〜4％（又は低い）麻酔ガスを掃気システム（酸素流量を備えた誘導室にイソフルラン短時間の曝露によって誘導される。
- 麻酔マウス（注射当たり0.2 ml）を尾静脈内に混合物全体を注入。 IV注入はまた、拘束、無麻酔マウスで行うことができる。
- 1日1回、6以上の連続日間同じマウスに注射を繰り返します。
2。 インビボ蛍光イメージング
腫瘍におけるHerDox蛍光の蓄積ができマルチイメージャを用いた注射の最終日（7日）によって検出される。以下の手順は、カスタマイズされたマクロ照明および検出システム（ 図1）8の使用を伴う。
- 生体内光学イメージャでマルチモードをオンにします。
- ドキソルビシン蛍光検出に適した排出バンドパスフィルタ（590nmの±30 nm）を選択します。
- アルゴンクリプトンレーザーをオンにして、レーザー光路の励起バンドパスフィルタ（488nmの±10 nm）を配置します。
- 麻酔システムの電源を入れた後、麻酔（酸素流量にマウスを置き：0.5 L /分、イソフルラン濃度：3〜4％（以下）ガス掃気システムを装備。
- 麻酔からマウスが麻酔である生体内光学イメージャでマルチモードの撮影室にマウスを移す。
- マウスの鼻の上のノーズコーンを置き、連続anestheを管理する流れを開く画像取得時にSIA（酸素流量：0.5〜L /分、イソフルラン濃度：2〜3％（以下）。
- 5-15秒の露光時間を用いて蛍光画像を取得。
- バックグラウンド補正、コントラスト調整などの画像解析処理を行う。
3。蛍光イメージングエクスビボ
HerDox蛍光はHerDoxの最終（第7日）注射後24時間後に安楽死させたマウスから採取した腫瘍と特定の臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、骨格筋を含む）で撮像することができます。
- 生体内光学イメージャでマルチモードをオンにします。
- ドキソルビシン蛍光検出用の放射帯域通過フィルタ（580nmの±20 nm）を選択します。
- アルゴンクリプトンレーザーをオンにして、レーザー光路の励起バンドパスフィルタ（488nmの±10 nm）を配置します。
- 場所の腫瘍および特定の臓器は、イメージングチャンバーOにペトリ皿上に配置されfの生体光学イメージャでマルチ。
- 5-15秒の露光時間を使用して組織の蛍光画像を取得。初期蛍光画像取得の一例を図2aに示されている。背景（図2b）となる空のペトリ皿を使用して同じように繰り返します。
- バックグラウンド補正、コントラスト調整などの画像解析処理を行う。補正された画像の例を図2aから図2bの減算に起因する、 図2cに示されている。
（4）腫瘍の in situ共焦点イメージング
現場共焦点イメージングで細胞レベルでHerDox腫瘍蓄積の検出と分析を可能にします。
- ライカSPE共焦点顕微鏡をオンにします。
- ドキソルビシンためのドキソルビシン及び発光波長（560から620 nm）での励起のために488nmのレーザ光を選択蛍光検出。
- 対物レンズ上の40Xまたは63X客観アンドドロップイマージョンオイルを選択します。
- 手順2で説明したように以前にHerDoxとモックの治療を受けた安楽死させたマウスからの新鮮な腫瘍を抽出します。
- 氷の上でペトリ皿の上に置いて腫瘍は組織の劣化を避けるために、次に共焦点イメージングのためのデルタT室に腫瘍を転送します。
- シーケンシャル焦点深度（1ミクロン、厚さ：20μmのステップサイズ）で腫瘍の共焦点画像を取得する。 z軸に沿って順次取得された画像の例を図3、左側のパネルに示されている。
- 最大強度画像のz投影を実行します。 z軸積層画像の最大強度の投影は、図3、右のパネルに示されている。
- 最大強度Zの蛍光強度を意味計算- 。投影画像をビューの全体のフィールドの上に画像の蛍光強度の平均値を計算したImageJのを使用します。d。
5。レシオメトリックスペクトルイメージングと解析
レシオメトリックスペクトルイメージングと分析Doxを蛍光と自家蛍光の判別を可能にします。
- 蛍光共焦点レーザ走査型顕微鏡の電源をオンにします。
- ステップ10nmのサイズ、およびライカSPE共焦点顕微鏡を用いて488 nmの光で励起で、510から650ナノメートルのスペクトル範囲内で指定された深さでHerDox処理と未処理の腫瘍の15の画像を取得する。
- ドキソルビシン100μMのソリューションを準備します。
- Doxを蛍光（：510から650 nmであり、ステップサイズ：10 nmのスペクトル範囲）の純粋なスペクトルの署名を取得するために100μMのドキソルビシンソリューションの分光イメージングを実行します。グラフは、図4に示すように、得られた分光イメージング蛍光スペクトルからの画像取得の典型的な結果をプロットした。
- 画像Cからの自家蛍光スペクトルの署名を取得未処理の腫瘍の分光イメージングによって得られたUBE（10 nmのスペクトル範囲：510から650 nmであり、ステップサイズ）。グラフは、図5に示すように、得られた分光イメージング蛍光スペクトルからの画像取得の典型的な結果をプロットした。
- 我々は9を開発したプログラムを使用して、4つの基準スペクトルシグネチャを（純粋自家蛍光、0.1.doxorubin +0.9。自家、0.2。ドキソルビシン+0.8。自家、0.3.doxorubin +0.7。自家蛍光）を生成します。 4つの基準スペクトル特性を示す典型的な曲線を図6に示す。
- 我々は以前に9を開発したプログラムを使用したユークリッド距離尺度を通して基準スペクトルシグネチャで定義されている画像のスペクトル分類を実行します。
- レシオメトリックスペクトルイメージングと解析との比較のために、我々は7を開発したスペクトルアンミキシングプログラム（ImageJの中でプラグイン）、10を使用して、それらの画像の線形スペクトルアンミキシングを行います。電子線形スペクトルアンミキシングすることにより自家蛍光からHerDox蛍光を分離するXAMPLEは、 図7に示されている。
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Representative Results
図1は、蛍光強度、スペクトル、寿命、2光子内、重要な焦点、および生物発光イメージングを含む複数のモダリティ、下の画像の取得を目的として建設された生体内光学イメージャプロトタイプに示しています。さらに、このシステムに組み込まれた冷却された高感度カメラと高出力レーザー線は、特にドキソルビシン蛍光のインビボでの検出のための商業的な結像光学系11に比べて高いコントラスト蛍光画像を生成する。したがって、このシステムは、 インビボで HerDoxの評価に複数の相補的なデータポイントを取得するために、本 研究で使用するために重要でした。
図2に示すように、高い腫瘍蛍光HerDoxの全身送達後に典型的な、その腫瘍優先的ターゲティングを示す。骨格筋で検出された蛍光が非定型で、あちこちになることがあり注射手続きにおけるmの異常（ つまり体に近すぎる注入）。定性的には、 図2aに示す画像は、低いバックグラウンドを有する。 図2bに示すように、しかし、相対的な組織の蛍光強度の定量分析を行うためには、空の皿を使用してバックグラウンド補正を行う必要がある。これは、背景画像（図2b）はの端に低い強度を有するため（図2a）と比較して、元の画像のエッジでより高いバックグラウンド信号を有する図2cに示すように"バックグラウンド補正された"画像になることが画像。バックグラウンド補正は、画像のエッジの信号増加をもたらすことができつつ、これは後続の定量分析のために必要な工程である。
腫瘍におけるHerDox蓄積の定量的評価を得るために、共焦点蛍光画像は、異なる焦点で得られたin situで深さは最大強度画像のz突起（ 図3）、及び投影像の平均蛍光強度を取得した。得られた画像が表示された画素毎のz深オーバーHerDox蓄積情報が含まれているので、蛍光強度の平均を定量異なる深さでの腫瘍の全体的なHerDox蓄積を反映している。
腫瘍において自家蛍光の蛍光HerDoxを区別して定量的に高い特異性を持つ2つを区別するため、レシオメトリックスペクトルイメージングおよび分析を行った。ドキソルビシンおよび分光イメージングにより得られた自家蛍光のための純粋なスペクトル特性をそれぞれ、 図4および図5に示されている。基準スペクトルシグネチャ（ 図6）は、また、我々は9を開発したプログラムを使用して純粋なスペクトルシグネチャの異なる比率を混合することによって作成された。各refereスペクトル署名NCEここ自家に関して腫瘍に蓄積HerDoxの相対的な蛍光を表しています。スペクトル分類画像は（データはこの論文に示されていなかった）純粋な基準スペクトルシグネチャを（ 図7）を使用して得られたスペクトル混合されていない画像に比べて7よりよい定量HerDoxの蓄積が認められた。レシオメトリックスペクトルイメージングを行う際に4-7の図は、典型的な調査結果を表すと分析。
図1 生体光学イメージャで 。蛍光強度、スペクトル、蛍光寿命および生体内共焦点撮像機能を備えた撮像光学系を使用しなければならない。ここで使用されるマルチモード光撮像システムが示されており、describとされている以前ED 8。スプリンガー科学＆ビジネスメディアBVからの親切な許可を得て提供された画像：黄、JY ら 、 モル。イメージングBIOL。、14、431から42（2012）。
図2。 HerDoxを受けるマウスから抽出された臓器や腫瘍の代表的な蛍光強度画像 。組織および腫瘍は前HerDox蛍光強度画像の最終（7日目）注入した後、（b）は（a）と（c）は 、それぞれで表されるバックグラウンド補正後の24時間で安楽死させたマウスから回収した。 拡大表示するにはここをクリック図 。
図3。シーケンシャルz軸の深さで得られる画像の最大強度は、z突起 。左図のような積み重ねの画像は、順次1μmの深さで得られた腫瘍組織の共焦点スキャンの代表的なものである。右の画像は、左に積み重ねられたイメージのコンパイルを示しています。
図4。ドキソルビシンのための純粋なスペクトルの署名の取得 。ドキソルビシン溶液の画像が10nmのステップサイズ（左）、ドキソルビシンが得られた純粋なスペクトルシグネチャを使用して、510から650ナノメートル以内に順次波長で得られた後に私たちが開発したプログラムを使用して。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5。自家蛍光のための純粋なスペクトルの署名の取得 。未処理の腫瘍の画像を10nm（左）のステップサイズで、510から650 nmの範囲内のシーケンシャルの波長で得られた後に、自家蛍光のための純粋なスペクトルの署名は、我々が開発したプログラムを使用して得られた。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図6。レシオメトリックスペクトルイメージングおよび分析のための4つの基準スペクトルシグネチャ 。基準スペクトルシグネチャは、私たちが開発したプログラムを使用して純粋なスペクトルシグネチャを混合することによって作成された。緑色の実線は、純粋な自己蛍光を表し、赤色の実線は0.1.doxorubin +0.9を表しています。自家蛍光、青色の実線は0.2を表します。ドキソルビシン+0.8。自家蛍光、シアン色の実線0.3.doxorubin +0.7。自家蛍光、それぞれ。黄、JY ら、PLoSのワン7（4）、（2012）：図は、著者らの以前の研究から再生されます。
図7。スペクトルアンミキシングの前と後の組織におけるHerDox蛍光 。ドキシサイクリンと自家蛍光のスペクトルシグネチャを取得した後、目のDoxを電子信号が線形スペクトル非混合12,13を用いて分離される。図は、スペクトル非混合と非混合スペクトル後に分離HerDox画像前自家蛍光とHerDox混合画像を示しています。
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Discussion
腫瘍は皮下あるときDoxの蛍光はマルチイメージャを用いたin vivoで検出することができます。しかし、HerDoxの治療有効用量（0.004 mg / kg体重）を単回投与した後、検出しきい値を下回っている。対照的に、7毎日注射（7日間1x/day）の後、粒子の蓄積および腫瘍保持はDoxの蛍光の可視化を可能にするのに十分である。
ドキシサイクリンまたはクリーン技術が使用されていることをin vivoイメージングするための任意の他の蛍光体を取り扱う際には重要である。イメージャはドキシサイクリンは、外部または内部にあるかどうかを区別することなく、皮膚の外側に蛍光を検出し、マウスの外側のしずくは、避けるべきである。同様に、手袋にDoxの汚染が誤蛍光検出を引き起こし、動物の取り扱い中にマウスの外側に蛍光マークを残すことができます。
マルチモード光システムにおいて、レーザビームはHerDoxの励起に利用される。レーザビームは、典型的にはガウシアンプロファイルを有する。したがって、関心のある検体の均一な励起のために、光拡散体が利用される。それにもかかわらず、拡散されたレーザ光は多少ガウシアンビームプロファイルを保存する。従って、理想的な定量分析のため、バックグラウンド補正を行わなければならない。修正前と背景画像は、一般的に16ビットの深さを持っている。バックグラウンド補正を行う前に、したがって、画像の深さが得られると、入力画像間の深さの不一致から不要なエラーを回避するために32ビットに変換されるべきである。
背景画像の取得、黒い紙（Artagain）に予め蛍光イメージングを実行する前に、照明の反射を防止するために、イメージングプレート上に置かれた。カメラは非常に敏感であるのでしかし、黒紙から低いバックグラウンド信号は、カメラによって検出した。したがって、背景図2に示されている信号は、黒い紙からではなく、空のペトリ皿から来ました。
ドキソルビシン溶液の高濃度を高精度に純粋なスペクトル特性を得るために用いた。我々はさらに、システムの信頼性スペクトルシグニチャを生成するために十分な試料からの蛍光を検出することができるれるスペクトル分解能を調べた。結果として、スペクトル分解能を10nmに同調した。ここでは、より高いスペクトル解像度（<10 nm）での設定の下で顕微鏡は信頼性の高いスペクトルシグネチャを生成するために十分な蛍光を検出することができなかったことがわかった。純粋なスペクトルの署名により、我々はいくつかのレシオメトリックスペクトルシグネチャ（ 図6）を生成することができます。特に、我々は、定量的に、それぞれのレシオメトリックスペクトルシグネチャ7で自家蛍光からHerDox蛍光信号を区別することができます。純粋なスペクトルの署名を用いて得られたスペクトル非混合画像（。：Autofl 0.2.Dox +0.8と緑：青。Autofl。）■（ 図7）は、2つの基準スペクトルシグネチャによって分類画像に類似していた。要するに、レシオメトリックスペクトル/共焦点イメージングは、このようにHER2 +腫瘍に配 信ナノ粒子の分析でその有用性を検証し、高解像度で、その場で腫瘍細胞におけるHerDox蓄積に関するより定量的な情報を提供した。
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Disclosures
著者、ダニエルFarkasのは、スペクトル分子イメージングの会長である。残りの著者は全く競合する利害関係はありません。
Acknowledgments
この作品は、健康/国立がん研究所の国立研究所（R01CA129822とR01CA140995）からLKM-Kへの補助金によって賄われていた。継続的なサポートのためにメディナ-Kauweのおかげでレイ、M. M-KauweとD. Revetto博士。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
References
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