Analyse af målrettet Viral Protein Nanopartikler Leveret til HER2 + tumorer

Summary

Denne artikel beskriver de procedurer for optisk billeddannelse analyse af tumor målrettede nanopartikel, HerDox. Især detaljeret brug af multimode imaging enhed til detektering tumormålretning og vurdere tumor penetration beskrevet her.

Abstract

HER2 + tumor målrettet nanopartikel, HerDox udviser tumor-præferentiel ophobning og tumor-vækst ablation i en dyremodel af HER2 + kræft. HerDox dannes ved ikke-kovalent selvsamling af en tumor målrettet cellepenetration protein med kemoterapimidlet, doxorubicin, via en lille nukleinsyre-linker. En kombination af elektrofilt, intercalation, og oligomeriserende interaktioner letter selvsamling til runde 10-20 nm-partikler. HerDox udviser stabilitet i blod samt i forlænget opbevaring ved forskellige temperaturer. Systemisk levering af HerDox i tumorbærende mus resulterer i tumor-celledød med ingen påviselige skadelige virkninger på ikke-tumorvæv, herunder hjertet og leveren (som undergår markeret skader ved målrettede doxorubicin). HER2 elevation letter målretning til celler, der udtrykker den humane epidermale vækstfaktor receptor, hvorfor tumorer, der udviser forhøjede HER2 niveauer udviser større akkumulering af HerDox sammenlignet med celler expressynge lavere niveauer, både in vitro og in vivo. Fluorescensintensitet billeddannelse kombineret med in situ konfokal og spektralanalyse har tilladt os at kontrollere in vivo tumor målretning og tumorcelle penetration af HerDox efter systemisk levering. Her har vi detalje vores metoder til vurdering tumormålretning via multimode imaging efter systemisk levering.

Introduction

Tumor-målretning af kemoterapi har potentiale til at eliminere cancerceller ved lavere dosis sammenlignet med ikke-målrettede lægemidler, fordi mere af den leverede terapi kan akkumulere til bestemmelsesstedet i stedet distribuere til ikke-tumorvæv. Da sidstnævnte situation ville fortynde ud effekten af ​​lægemidlet og derfor kræver højere doser for at være effektive, tumor-targeting har både terapeutiske og sikkerhedsmæssige fordele i forhold til standard ikke-målrettet behandling.

Målretning kemoterapi ved indkapsling i selvsamlede nanopartikler tillader stoffet at forblive kemisk uændret i modsætning til lægemidler, der er kovalent knyttet til målsøgende molekyler. Som sådan binding har potentiale til at ændre aktiviteten af ​​både lægemidlet og målsøgende molekyle, ikke-kovalent samling tillader lægemiddel potens bevares.

Vi har tidligere vist, at de hidtil ukendte tre-komponent, selv-samlet kompleks, HerDox målretter HER2 + tumorer 1. HerDox er dannet gennem ikke-kovalente interaktioner mellem receptor-bindende celle-penetration protein HerPBK10, og det kemoterapeutiske middel, doxorubicin (Dox), via en lille nukleinsyre-linker. HerPBK10 binder human epidermal vækstfaktor receptor (HER) og udløser receptormedieret endocytose ^2-4, mens endosomale membran penetration opnås gennem inkorporering af adenovirus-afledte Penton basen capsidprotein ^4-6. En positivt ladet domæne på proteinet muliggør nukleinsyrebinding ^{4, 5,} gennem hvilken DNA-interkalerede Dox kan transporteres til målrettet levering. Elektrofile, intercalation, og eventuelt protein oligomeriserende interaktioner lette selvsamling til runde 10-20 nm-partikler, som er stabile i blod og under forlænget opbevaring ved forskellige temperaturer ^1.. Præferentiel målretning til HER2 + tumorceller lettes af det forbedrede ligandaffinitet når HER2 er forhøjet.

Vore tidligere studier har vist, at systemisk levering af HerDox udbytter præferentiel akkumulering i tumorer end ikke-tumorvæv og i sammenligning med irrelevante Dox ^1, og indtrængen i tumorceller in vivo ^7.. Vi har observeret, at HerDox frigiver Dox efter tumorcelle indgang, så Dox akkumulering ind i kernen ^1. Tumor-akkumulation synes at korrelere med receptor-niveau, som relativt lave HER2-udtrykkende tumorer akkumulerer mindre HerDox sammenlignet med dem med relativt højere HER2 niveau ^1. Endvidere vil en effektiv celledød koncentration udviser en omvendt korrelation med HER2 display på tumorcellelinier udtrykker forskellige celleoverflade HER2 niveau ^1. HerDox udviser en terapeutisk og sikkerhedsmæssige fordele i forhold til ikke-målrettede Dox, som tumordrab forekommer på mere end 10 gange lavere dosis sammenlignet med untartet lægemiddel og giver ingen påviselig negativ virkning på hjertet (detekteret ved ekkokardiografi og histologisk farvning) eller leveren (detekteret ved TUNEL plet) væv, i modsætning til målrettede Dox ^1.. Trods sin afledning fra et viralt capsid protein, udviser HerPBK10 ingen påviselig immunogenicitet ved terapeutisk niveau ^2. Betragtninger eksisterende antistoffer mod hele adenovirus kan genkende HerPBK10, er de ude af stand til at forhindre cell binding ^2..

Tumor volumen målt over tid er en standard metode til vurdering af terapeutiske effekt af målrettede lægemidler, og har været ansat til at vurdere den terapeutiske effekt af HerDox. Supplere denne tilgang med in vivo og ex vivo fluorescensintensitet imaging har givet os mulighed for bedre at vurdere målrette effektivitet ^7.. Vi har specifikt integreret i situ konfokal billeddannelse af udskårne tumorer med spektralanalyse af Dox fluorescens at kontrollere, at HerDox ikket kun akkumuleret på tumorer in vivo, men trængte ind tumorceller og leverede Dox ind i cytoplasmaet og kernen ^7.. Spektralanalyse endvidere muligt for os at skelne Dox fluorescens fra autofluorescens ^7..

Her viser vi nærmere vores tilgang til vurdering HerDox in vivo efter systemisk levering, og vigtigst, for at vurdere målretning gennem multimode billeddiagnostiske metoder og analyser.

Protocol

1.. Systemisk levering In vivo

1. Bland nok HerDox med sterilt saltvand at sidestille 0,2 ml af en 0,004 mg / kg dosis af HerDox per injektion til en 6-8 uger gamle nu / nu mus bærende subkutane bilaterale flank xenotransplantattumorer.
2. Træk forsigtigt HerDox blandingen i en 3/10 cc insulinsprøjte udstyret med en 29G nål, undgå bobler.
3. Anæstesi induceres ved kortvarig isofluran eksponering i en induktion kammer udstyret med en gas skylningssystem (Oxygen strømningshastigheder: 0,5-1 l / min, isofluran koncentration: 3-4% (eller lavere).
4. Injicer hele blandingen i halevenen af ​​en bedøvet mus (0,2 ml per injektion). IV injektion kan også udføres i et behersket, ikke-bedøvede mus.
5. Gentag injektioner på den samme mus i seks sekventielle dage, en gang om dagen.

2.. Fluorescensimagografi In vivo

Ophobningen af ​​HerDox fluorescens i tumorer kankunne detekteres senest den sidste dag for injektion (dag 7) ved hjælp af en multimode imager. Nedenstående procedurer indebærer anvendelse af en tilpasset makro-belysning og detektion (figur 1) ^8.

1. Tænd Multimode In vivo Optisk Imager.
2. Vælg en emission båndpasfilter (590 nm ± 30 nm) velegnet til doxorubicin fluorescens detektion.
3. Tænd Argon-Krypton laser og placere en excitation båndpasfilter (488 nm ± 10 nm) på laser optiske vej.
4. Tænd for anæstesi-systemet og derefter placere en mus i bedøve kammer (Oxygen flow: 0,5-1 L / min, isofluran koncentration: 3-4% (eller lavere) er udstyret med en gas skylningssystem.
5. Overfør musen fra bedøve kammer til det billeddannende kammer Multimode In vivo Optical Imager når musen er bedøvet.
6. Placer en næsekeglens over næsen af ​​musen og åbn flowet at administrere kontinuerlig anesthesia under billedet erhvervelse (Oxygen flow: 0,5-1 L / min, isofluran koncentration: 2-3% (eller lavere).
7. Anskaf fluorescens billeder ved hjælp af en eksponeringstid på 5-15 sek.
8. Udføre billedanalyse og behandling, herunder baggrunden rettelse eller kontrast justering.

3.. Fluorescensimagografi Ex vivo

HerDox fluorescens kan afbildes i tumorer og specifikke organer (herunder lever, nyre, milt, hjerte og skeletmuskulatur) høstes fra aflivet mus ved 24 timer efter den sidste (dag 7) injektion af HerDox.

1. Tænd Multimode In vivo Optisk Imager.
2. Vælg en emission båndpasfilter (580 nm ± 20 nm) for Doxorubicin fluorescenspåvisning.
3. Tænd Argon-Krypton laser og placere en excitation båndpasfilter (488 nm ± 10 nm) på laser optiske vej.
4. Sted tumorer og specifikke organer arrangeret på en Petri-skål i imaging kammer of Multimode In vivo optisk Imager.
5. Anskaf fluorescens billeder af væv ved hjælp af en eksponeringstid på 5-15 sek. Et eksempel på initial fluorescens billede erhvervelse er vist i figur 2a. Gentag det samme ved hjælp af en tom Petri-skålen, som vil tjene som Background (figur 2b).
6. Udføre billedanalyse og behandling, herunder baggrunden rettelse eller kontrast justering. Et eksempel på et korrigeret billede er vist i figur 2c, som følge af subtraktion af figur 2b fra figur 2a.

4.. In situ Confocal Imaging af tumorer

In situ konfokal billeddannelse tillader påvisning og analyse af HerDox tumor ophobning på celleniveau.

1. Tænd et Leica SPE konfokal mikroskop.
2. Vælg 488 nm laserlys til excitering af doxorubicin og emission bølgelængder (560-620 nm) for doxorubicinfluorescenspåvisning.
3. Vælg et 40X eller 63X objektiv og slip fordybelse olie på objektive linse.
4. Uddrag friske tumorer fra aflivet mus, der tidligere modtog HerDox og mock-behandlinger, som beskrevet i procedure ^2.
5. Sted tumorer på en Petri-skål på is for at undgå vævsnedbrydning, og derefter overføre tumorer til en Delta-T kammer til konfokal billeddannelse.
6. Anskaf konfokal billeder af tumorerne ved sekventielle fokale dybder (trin size: 1 um, tykkelse: 20 pm). Et eksempel på sekventielt erhvervet billeder langs z-aksen er vist i figur 3, venstre panel.
7. Udfør maksimal intensitet z-projektion af billederne. En maksimal intensitet projektion af z-stacked billeder er vist i figur 3, højre panel.
8. Beregn betyde fluorescensintensiteter af den maksimale intensitet Z -. Projektionsbilleder Mean fluorescensintensiteter af billeder over det samlede synsfelt blev beregned med ImageJ.

5.. Ratiometrisk Spectral Imaging og analyse

Ratiometrisk spektral billedbehandling og analyse giver mulighed for forskelsbehandling mellem Dox fluorescens og autofluorescens.

1. Tænd en laserscanning fluorescens konfokal mikroskop.
2. Erhverve 15 billeder af de HerDox og de ubehandlede tumorer i en specificeret dybde inden for det spektrale område af 510-650 nm, med en trinstørrelse på 10 nm, og excitation ved 488 nm lys med en Leica SPE konfokal mikroskop.
3. Forbered en 100 uM opløsning af doxorubicin.
4. Udfør spektral billeddannelse af 100 uM doxorubicin løsning til at opnå den rene spektrale signatur Dox fluorescens (spektralområde: 510-650 nm, et trin: 10 nm). Typiske resultater af billedet erhvervelse fra spektral billeddannelse og deraf fluorescensspektret plottet som en graf er vist i figur 4.
5. Erhverve autofluorescens spektrale signatur fra et billede cUbe (spektralområde: 510-650 nm, et skridt size: 10 nm) fremstillet ved spektral billeddannelse af ubehandlede tumorer. Typiske resultater af billedet erhvervelse fra spektral billeddannelse og deraf fluorescensspektret plottet som en graf er vist i fig. 5.
6. Generer fire referencepunkter spektrale signaturer (ren autofluorescens, 0.1.doxorubin +0,9. Autofluorescens, 0,2. Doxorubicin +0,8. Autofluorescens, 0.3.doxorubin +0.7. Autofluorescens) ved hjælp af programmet har vi udviklet ^9.. En typisk kurve, der viser fire referencepunkter spektrale signaturer er vist i figur 6.
7. Udfør spektral klassifikation af billederne som defineret reference spektrale signaturer gennem euklidiske afstand foranstaltning ved hjælp af programmet vi tidligere udviklet ^9..
8. Udfør lineær spektral unmixing af disse billeder ved hjælp af en spektral unmixing program (plug-in i ImageJ) udviklede vi ^{7, 10,} til sammenligning med ratiometriske spektrale billedbehandling og analyse. En example at adskille HerDox fluorescens fra autofluorescens ved lineær spektral unmixing er vist i figur 7..

Representative Results

Figur 1 viser in vivo optisk kamera prototype, der blev bygget med henblik på billedet erhvervelse under flere modaliteter, herunder fluorescens intensitet, spektrale, levetid, 2-foton, intra-vital konfokal og bioluminescens billeddannelse. Desuden giver den afkølede høj følsomme kamera og høj effekt laser linjer indarbejdet i dette system med højere kontrast fluorescens billeder i forhold til kommercielle optiske billeddannende systemer ^11, især til in vivo detektion af doxorubicin fluorescens. Derfor dette system var kritisk for anvendelse i den foreliggende undersøgelse at erhverve flere komplementære datapunkter i vurderingen af HerDox in vivo.

Den høje tumor fluorescens er vist i figur 2 er typisk efter systemisk levering af HerDox, og viser dets tumor-præferentiel målretning. Fluorescensen detekteres i skeletmuskulaturen er atypisk og kan resultere tilbagem anomalier i indsprøjtningen procedure (dvs. indsprøjtning for tæt på kroppen). Kvalitativt billedet vist i figur 2a har lav baggrund. Men for at udføre en kvantitativ analyse af de relative væv fluorescensintensiteterne, er det nødvendigt at udføre en baggrund korrektion ved hjælp af en tomme skål, som vist i figur 2b. Dette kan resultere i en "baggrund korrigeret" billede vist i figur 2c, der har en højere baggrund signal ved kanten af billedet i forhold til den oprindelige (figur 2a), fordi baggrundsbilledet (figur 2b) har lavere intensiteter ved kanten af billede. Således, mens baggrunden korrektion kan give et signal stigning på kanten af ​​billedet, dette er et nødvendigt skridt til efterfølgende kvantitativ analyse.

For at opnå en kvantitativ vurdering af HerDox ophobning i tumorer blev konfokal fluorescens billeder opnået på forskellige omdrejningspunktdybder in situ, efterfulgt af maksimal intensitet z-projektion af billederne (figur 3), og erhvervelse af den gennemsnitlige fluorescensintensitet af det projicerede billede. Det resulterende billede indeholder HerDox ophobning oplysninger over de angivne z-dybder på hver pixel, og dermed gennemsnittet af fluorescensintensiteterne medtager HerDox ophobninger i tumorer ved forskellige dybder kvantitativt.

For at skelne HerDox fluorescens fra autofluorescens i tumorer og kvantitativt diskriminere de to med høj specificitet, ratiometrisk spektral billedbehandling og analyse blev udført. De rene spektrale signaturer for doxorubicin og autofluorescens opnået ved spektral billeddannelse er illustreret i figur 4 og 5, hhv. Referencepunkter spektrale signaturer (figur 6) blev også skabt ved at blande forskellige forhold af de rene spektrale signaturer ved hjælp af programmet har vi udviklet ^9.. Hver reference spektrale signatur her repræsenterer relativ fluorescens HerDox akkumuleret i tumorer med hensyn til autofluorescens. De spektrale klassificering billeder (data ikke vist i dette dokument) viste bedre kvantitativ HerDox ophobninger ⁷ i forhold til den spektrale ublandede billede opnås ved anvendelse af de rene reference-spektrale signaturer (figur 7). Figur 4-7 repræsenterer typiske resultater ved udførelse ratiometrisk spektral billeddannelse og analyse.

Fig. 1. In vivo optisk imager. Et optisk imaging system med fluorescensintensitet, spektrale, fluorescenslevetid og intravital konfokal billeddannelse kapaciteter skal anvendes. Den multimode optiske imaging system bruges her er vist, og har været described tidligere ^8.. Billede forsynet med venlig tilladelse fra Springer Science & Business Media BV: Hwang, JY, et al, Mol.. Imaging Biol., 14, 431-42 (2012).

Figur 2. Repræsentative fluorescensintensitets billeder af indre organer og tumorer udvundet fra en mus modtager HerDox. Væv og tumorer blev høstet fra aflivet mus ved 24 timer efter den sidste (dag 7) injektion af HerDox fluorescensintensitet billeder før og efter baggrunden korrektion (b) er repræsenteret ved (a) og (c), hhv. Klik her for at se større figur .

Figur 3. Maksimal intensitet z-projektion af billederne er opnået ved sekventielle z-dybder. De stablede viste billeder til venstre er repræsentative for de konfokale scanninger af tumorvæv opnået ved sekventielle 1 um dybder. Billedet til højre viser opgørelsen af ​​de stablede billederne til venstre.

Figur 4.. Erhvervelse af en ren spektral signatur for doxorubicin. Når billederne af doxorubicin løsning blev opnået ved sekventielle bølgelængder inden 510-650 nm, med en trin-størrelse på 10 nm (til venstre), den rene spektrale signatur for doxorubicin blev opnået ved hjælp af programmet har vi udviklet. Klik her for at se større figur .

Figur 5. Erhvervelse af en ren spektral signatur for autofluorescens. Når billederne af ubehandlet tumor blev opnået ved sekventielle bølgelængder inden 510-650 nm, med en trin-størrelse på 10 nm (til venstre), den rene spektrale signatur for autofluorescens blev opnået ved hjælp af programmet har vi udviklet. Klik her for at se større figur .

load/50396/50396fig6.jpg "/>
Figur 6.. Fire reference-spektrale signaturer for ratiometrisk spektral billeddannelse og analyser. Referenceværdierne spektrale signaturer blev skabt ved at blande de rene spektrale signaturer ved hjælp af programmet har vi udviklet. Den grønne-farvet solid linje repræsenterer ren autofluorescens, den røde farve solid linje repræsenterer 0.1.doxorubin +0,9. Autofluorescens, den blå-farvede solid linje repræsenterer 0,2. doxorubicin +0,8. autofluorescence og cyan-farvede ubrudt linie 0.3.doxorubin +0,7. autofluorescens, hhv. Figur er gengivet fra forfatternes tidligere arbejde: Hwang, JY, et al, PLoS One 7 (4), (2012)...

Figur 7. HerDox fluorescens i vævet før og efter spektral un-blanding. Efter opnåelse af de spektrale signaturer Dox og autofluorescens, the Dox signaler er adskilt ved hjælp af lineær spektrale un-blanding ^12,13. Figuren viser autofluorescence og HerDox blandet billede, inden spektral un-blanding, og det separerede HerDox billedet efter spektral un-blanding.

Discussion

Dox fluorescens kan påvises in vivo ved hjælp af multimode imager når tumorer er subkutan. Men den terapeutisk effektive dosis af HerDox (0,004 mg / kg) er under detektionsgrænsen efter en enkelt dosis. I modsætning hertil, efter 7 daglige injektioner (1x/day i 7 dage) tumor ophobning og tilbageholdelse af partiklen er tilstrækkelig til at muliggøre visualisering af Dox fluorescens.

Det er kritisk, når man arbejder med Dox eller enhver anden fluorofor til in vivo billeddannelse, der rent teknik anvendes. Drypper på ydersiden af ​​musens bør undgås, da imager vil detektere fluorescens på ydersiden af ​​huden uden at diskriminere hvorvidt Dox er eksternt eller internt. Ligeledes kan Dox forurening på handskerne efterlade fluorescerende mærker på ydersiden af ​​musen under håndtering af dyr, hvorved fejlagtig fluorescens detektion.

I multimode optiske system, enlaserstråle anvendes til excitation af HerDox. Laserstrålen har typisk en gaussisk profil. Derfor, for ensartet excitation af eksemplarer af interesse, er optiske diffusorer udnyttet. Ikke desto mindre diffust laserlys lidt bevarer en gaussisk stråle profil. Således for ideal kvantitativ analyse, skal baggrunden korrektion udføres. De før-korrigerede og baggrundsbilleder typisk har en dybde på 16 bits. Derfor, før baggrunden korrektion udføres, bør billedet dybde omdannes til 32 bit for at undgå uønskede fejl fra billedet dybde uoverensstemmelse mellem resulterende og input billeder.

I købet af et baggrundsbillede blev en sort papir (Artagain) tidligere sat på en imaging plade for at forhindre belysning refleksioner, før du udfører fluorescens billeddannelse. Men da kameraet er meget følsomt, var lav baggrund signaler fra black-papir registreres af kameraet. Derfor baggrundensignaler, vist i figur 2 kom fra sort papir snarere end fra en tom Petri-skål.

En høj koncentration af doxorubicin opløsning blev anvendt til at opnå rene spektrale signaturer med høj nøjagtighed. Vi yderligere undersøgt spektrale resolutioner, hvor systemet er i stand til at detektere nok fluorescens fra prøven til at producere pålidelige spektrale signaturer. Som følge heraf blev den spektrale opløsning indstillet til 10 nm. Her fandt vi, at mikroskopet under indstillingen af ​​højere spektrale opløsninger (<10 nm) ikke kunne påvise tilstrækkelig fluorescens til opnåelse pålidelige spektrale signaturer. Med de rene spektrale signaturer, kunne vi generere flere ratiometrisk spektrale signaturer (figur 6). Navnlig kunne vi kvantitativt skelne HerDox fluorescens signaler fra autofluorescens af de respektive ratiometrisk spektrale signaturer ^7. Den spektrale ublandet billede taget med den rene spektrale signaturs (figur 7) var lig med det klassificerede billede af de to reference-spektrale signaturer (blå:. 0.2.Dox +0,8 Autofl og Grøn:.. Autofl). Sammenlagt ratiometriske konfokal / spektral billeddannelse forudsat flere kvantitative oplysninger om HerDox akkumulation i tumorceller in situ med høj opløsning, og dermed kontrollere dets anvendelighed i analysen af nanopartikler leveret til HER2 + tumorer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B