Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren

doi: 10.3791/50396 Published: June 18, 2013

Summary

Dit artikel beschrijft de procedures voor optische beeldvorming analyse van de tumor-gerichte nanodeeltjes, HerDox. In het bijzonder wordt gebruik van de gedetailleerde multimode beeldvormingsinrichting voor het detecteren en beoordelen van tumor targeting tumorpenetratie beschreven.

Abstract

De HER2 + tumor-gerichte nanodeeltjes, HerDox, vertoont tumor-preferentiële accumulatie en tumor-groei van ablatie in een diermodel van HER2 + kanker. HerDox wordt gevormd door niet-covalente zelfassemblage van een tumor gerichte cel penetratieproteïne het chemotherapeutische middel, doxorubicine, via een kleine nucleïnezuur linker. Een combinatie van elektrofiele, intercalatie, en oligomerization interacties vergemakkelijken zelf-assemblage in ronde 10-20 nm deeltjes. HerDox vertoont stabiliteit in bloed en bij langdurige opslag bij verschillende temperaturen. Systemische levering van HerDox in tumordragende muizen resulteert in tumor celdood zonder waarneembare nadelige effecten op niet-tumorweefsel, waaronder het hart en de lever (die gekenmerkt schade door ongerichte doxorubicine ondergaan). HER2 hoogte vergemakkelijkt richten naar cellen die de humane epidermale groeifactor receptor, waardoor tumoren HER2 tonen verhoogde niveaus vertonen grotere accumulatie van HerDox opzichte cellen expreszing lagere niveaus, zowel in vitro als in vivo. Fluorescentie-intensiteit imaging gecombineerd met in situ confocale en spectrale analyse heeft ons toegestaan ​​om te controleren in vivo tumor targeting en tumorcel penetratie van HerDox na systemische toediening. Hier detail we onze methoden voor de beoordeling tumor targeting via multimode beeldvorming na systemische toediening.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tumor targeting van chemotherapie heeft het potentieel om kankercellen te elimineren bij lagere dosering in vergelijking met getargete drugs omdat meer van de afgegeven therapie kan ophopen op de plaats van bestemming verspreiden naar niet-tumorweefsel. Zoals de laatste situatie zou verwateren uit de werkzaamheid van het geneesmiddel en dus een hogere dosering nodig om effectief te zijn, tumor targeting heeft zowel therapeutische en veiligheid voordelen ten opzichte van standaard niet-gerichte behandeling.

Targeting chemotherapie door inkapseling in zelfassemblerende nanodeeltjes kan het geneesmiddel blijft chemisch gemodificeerd met medicijnen die covalent zijn gekoppeld aan richtmoleculen. Als zodanig koppeling heeft het potentieel om de activiteit van zowel het geneesmiddel en het doel richtend molecuul veranderen, niet-covalente samenstel kan geneesmiddelsterkte te bewaren.

We hebben eerder aangetoond dat de nieuwe drie-component, zelf-geassembleerde complex, HerDox, richt HER2 + tumoren 1. HerDox wordt gevormd door niet-covalente interacties tussen de receptor-bindende cell-penetratie eiwit, HerPBK10, en het chemotherapeutische middel, doxorubicine (Dox), via een kleine nucleïnezuur linker. HerPBK10 bindt de humane epidermale groeifactor receptor (HER) en veroorzaakt receptor-gemedieerde endocytose 2-4, terwijl endosomale membraan penetratie wordt bereikt door incorporatie van het adenovirus-afgeleide penton base capside-eiwit 4-6. Een positief geladen domein op het eiwit kan nucleïnezuurbindende 4, 5, waardoor DNA-geïntercaleerde Dox worden vervoerd gerichte toediening. Elektrofiele, intercalatie, en eventueel eiwit oligomerization interacties vergemakkelijken zelf-assemblage in ronde 10-20 nm deeltjes die stabiel zijn in het bloed en onder langdurige opslag bij verschillende temperaturen 1. Preferentiële richten naar HER2 + tumorcellen wordt vergemakkelijkt door de verhoogde affiniteit ligand als HER2 wordt verhoogd.

Onze vorige studies hebben aangetoond dat systemische toediening van HerDox opbrengsten preferentiële accumulatie in tumoren via niet-tumorweefsel en in vergelijking met ongerichte Dox 1 en penetratie in tumorcellen in vivo 7. We hebben geconstateerd dat HerDox releases Dox na tumorcel binnenkomst, waardoor Dox accumulatie in de kern 1. Tumor-accumulatie lijkt te correleren met receptor-niveau, zoals relatief lage HER2-expressie tumoren accumuleren minder HerDox vergelijking met die met relatief hogere HER2 niveaus 1. Daarnaast draagt ​​de celdood concentratie vertoont een omgekeerde correlatie met HER2 weergave op tumor cellijnen verschillen celoppervlak HER2 niveau 1. HerDox vertoont een therapeutische en veiligheid voordeel ten opzichte van ongerichte Dox, zoals tumor doden optreedt bij meer dan 10-maal lagere dosis in vergelijking met de untarrichte drug en levert geen waarneembare nadelige invloed op het hart (gedetecteerd met echocardiografie en histologische kleuring) of lever (gedetecteerd door TUNEL kleuring) weefsel, in tegenstelling tot irrelevante Dox 1. Ondanks de afleiding van een viraal capside-eiwit, HerPBK10 vertoont geen waarneembare immunogeniciteit bij therapeutische niveaus 2. Dat reeds bestaande antilichamen tegen gehele adenovirus herkent HerPBK10, zij geen celbinding 2 voorkomen.

Tumorvolume gemeten over de tijd is een standaard methode voor het beoordelen van de therapeutische werkzaamheid van gerichte therapieën, en is gebruikt voor de beoordeling van de therapeutische werkzaamheid van HerDox. Aanvulling van deze aanpak met de in vivo en ex vivo fluorescentie-intensiteit beeldvorming heeft ons toegestaan ​​om beter te beoordelen richten efficiency 7. We hebben specifiek geïntegreerd in situ confocale beeldvorming van weggesneden tumoren met spectrale analyse van Dox fluorescentie om dat HerDox niet controlerent alleen opgebouwd op tumoren in vivo maar doorgedrongen in tumorcellen en geleverd Dox in het cytoplasma en de kern 7. Spectrale analyse bovendien konden we Dox fluorescentie onderscheiden van autofluorescence 7.

Hier laten we zien meer in detail onze aanpak voor de beoordeling van HerDox in vivo na systemische toediening, en het belangrijkst, voor het beoordelen van targeting via multimode beeldvormende methoden en analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Systemische Levering In vivo

  1. Meng genoeg HerDox met een steriele zoutoplossing tot 0,2 ml van een mg / kg dosis HerDox per injectie 0.004 voor een 6-8 week oude nu / nu muizen lager subcutane bilaterale flank xenograft tumoren gelijk.
  2. Zuig de HerDox mengsel in een 3/10 cc insuline injectiespuit voorzien van een 29G naald, het vermijden van luchtbellen.
  3. Anesthesie wordt geïnduceerd door korte isofluraan blootstelling in een inductie kamer uitgerust met een gas opvangsysteem; (Oxygen debieten: 0,5-1 L / min, isofluraan concentratie: 3-4% (of lager).
  4. Injecteer de gehele mengsel in de staart ader van een verdoofde muis (0,2 ml per injectie). IV injectie kan ook worden uitgevoerd in een beheerste, verdoofde muis.
  5. Herhaal de injecties op dezelfde muis voor zes opeenvolgende dagen, eenmaal per dag.

2. Fluorescentie Imaging In vivo

De accumulatie van HerDox fluorescentie in tumors kunnenworden aantoonbaar is met de laatste dag van de injectie (dag 7) met behulp van een multimode imager. De onderstaande procedures gebruik impliceren van een aangepaste macro-belichting en detectie (figuur 1) 8.

  1. Zet de Multimode In vivo Optical Imager.
  2. Selecteer een emissie banddoorlaatfilter (590 nm ± 30 nm) geschikt voor doxorubicine fluorescentie detectie.
  3. Schakel Argon-Krypton laser en plaats een excitatie banddoorlaatfilter (488 nm ± 10 nm) op de laser optische pad.
  4. Zet de anesthesie-systeem en plaats dan een muis in de verlamming kamer (Oxygen debieten: 0,5-1 L / min, isofluraan concentratie: 3-4% (of lager) uitgerust met een gas opvangsysteem;.
  5. Breng de muis uit de verlamming kamer naar de beeldvorming kamer van de Multimode In vivo optische Imager wanneer de muis is verdoofd.
  6. Plaats een neuskegel over de neus van de muis en open de stroom naar continue anesthe beherensia tijdens beeldacquisitie (Oxygen debieten: 0,5-1 L / min, isofluraan concentratie: 2-3% (of lager).
  7. Acquire fluorescentie beelden met behulp van een belichtingstijd van 5-15 sec.
  8. Voer beeldanalyse en-verwerking, waaronder achtergrond correctie of aanpassing van het contrast.

3. Fluorescentie Imaging Ex vivo

HerDox fluorescentie kan worden afgebeeld in tumoren en specifieke organen (zoals de lever, nieren, milt, hart en skeletspier) geoogst uit gedode muizen op 24 uur na de laatste (dag 7) injectie van HerDox.

  1. Zet de Multimode In vivo Optical Imager.
  2. Selecteer een emissie banddoorlaatfilter (580 nm ± 20 nm) voor doxorubicine fluorescentie detectie.
  3. Schakel Argon-Krypton laser en plaats een excitatie banddoorlaatfilter (488 nm ± 10 nm) op de laser optische pad.
  4. Plaats tumoren en specifieke organen aangebracht op een Petri-schaal in de beeldvorming kamer of de Multimode In vivo Optical Imager.
  5. Acquire fluorescentie beelden van weefsels met behulp van een belichtingstijd van 5-15 sec. Een voorbeeld van een initiële fluorescentie beeldacquisitie wordt getoond in figuur 2a. Herhaal hetzelfde met behulp van een lege Petri-schaal, die zal dienen als de achtergrond (Figuur 2b).
  6. Voer beeldanalyse en-verwerking, waaronder achtergrond correctie of aanpassing van het contrast. Een voorbeeld van een gecorrigeerde beeld wordt getoond in figuur 2c, als gevolg van aftrekken van fig. 2b van fig. 2a.

4. In situ confocale beeldvorming van tumoren

In situ confocale beeldvorming maakt detectie en analyse van HerDox tumorophoping op celniveau.

  1. Schakel een Leica SPE confocale microscoop.
  2. Selecteer 488 nm laserlicht voor excitatie van doxorubicine en emissie golflengten (560-620 nm) voor doxorubicinefluorescentiedetectie.
  3. Selecteer een 40X of 63X objectief en druppel immersie olie op het objectief.
  4. Extract verse tumoren van muizen geëuthanaseerd die eerder HerDox en mock behandelingen ontvangen zoals beschreven in procedure 2.
  5. Plaats tumoren op een Petri-schaal op het ijs om weefsel degradatie te voorkomen, en vervolgens over de tumoren een Delta T kamer voor confocale beeldvorming.
  6. Acquire confocale beelden van de tumoren op sequentiële focale diepte (stapgrootte: 1 micrometer, dikte: 20 pm). Een voorbeeld van opeenvolgend verkregen beelden langs de z-as is weergegeven in fig. 3, linker paneel.
  7. Voer maximale intensiteit z-projectie van de beelden. Een maximum intensiteitsprojectie van z-gestapelde beelden wordt getoond in figuur 3, rechter paneel.
  8. Vastgesteld en de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de maximale intensiteit Z -. Projectie beelden gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de beelden die over de overall gezichtsveld werden berekenend behulp ImageJ.

5. Ratiometrische spectral imaging en Analyse

Ratiometrische spectrale beeldvorming en analyse maakt onderscheid tussen Dox fluorescentie en autofluorescentie.

  1. Macht op een laser scanning fluorescentie confocale microscoop.
  2. Acquire 15 beelden van de HerDox-behandelde en onbehandelde tumoren op een bepaalde diepte in het spectrale bereik van 510-650 nm, met een stapgrootte van 10 nm, en excitatie bij 488 nm licht met behulp van een Leica SPE confocale microscoop.
  3. Bereid een 100 pM oplossing van doxorubicine.
  4. Spectrale beeldvorming van de 100 uM doxorubicine oplossing uit te voeren om de zuivere spectrale signatuur van Dox fluorescentie (spectraal bereik: 510-650 nm, een stapgrootte: 10 nm) te verkrijgen. Typische resultaten van de beeldvorming van spectrale beeldvorming en resulterende fluorescentie spectrum uitgezet in een grafiek worden weergegeven in figuur 4.
  5. Het verwerven van de autofluorescentie spectrale signatuur van een afbeelding cube (spectraal bereik: 510-650 nm, een stapgrootte: 10 nm) verkregen door spectrale beeldvorming van onbehandelde tumoren. Typische resultaten van de beeldvorming van spectrale beeldvorming en resulterende fluorescentie spectrum uitgezet als een grafiek getoond in figuur 5.
  6. Genereer vier verwijzing spectrale signatuur (pure autofluorescence, 0.1.doxorubin 0,9. Autofluorescence, 0.2. Doxorubicine 0,8. Autofluorescence, 0.3.doxorubin 0,7. Autofluorescentie) met behulp van het programma dat we ontwikkelden 9. Een kenmerkende curve die vier referentie spectrale signaturen wordt getoond in figuur 6.
  7. Voer spectrale classificatie van de beelden zoals gedefinieerd door de verwijzing spectrale signaturen door Euclidische afstand meten met behulp van het programma dat we eerder ontwikkelde 9.
  8. Voer lineaire spectrale ontmenging van die beelden met een spectrale ontmenging programma (plug-in in ImageJ) ontwikkelden wij 7, 10, ter vergelijking met de ratiometrische spectrale beeldvorming en analyse. Example scheiden HerDox fluorescentie van autofluorescentie van lineaire spectrale ontmenging wordt getoond in figuur 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuur 1 toont de in vivo optische imager prototype, dat is gebouwd voor het doel van de beeldvorming onder meerdere modaliteiten, zoals fluorescentie-intensiteit, spectrale, levensduur, 2-foton, intra-vitale confocale en bioluminescentie. Bovendien, de gekoelde zeer gevoelige camera en een hoog vermogen laserlijnen opgenomen in dit systeem levert een hoger contrast fluorescentiebeelden versus commercieel optische beeldvormingssystemen 11, met name voor de in vivo detectie van fluorescentie doxorubicine. Vandaar dit systeem was kritisch voor gebruik in de onderhavige studie om meerdere aanvullende gegevens verwerven de beoordeling van HerDox in vivo.

De hoge tumor fluorescentie figuur 2 is gebruikelijk na systemische toediening van HerDox en indicatie van de tumor-preferentiële targeting. De fluorescentie gedetecteerd in de skeletspier is atypisch en kunnen weer leidenm anomalieën in de injectieprocedure (dwz injecteren te dicht bij het ​​lichaam). Kwalitatief het in figuur 2a getoonde beeld een lage achtergrond. Echter, een kwantitatieve analyse van de relatieve fluorescentie intensiteiten weefsel voeren, is het noodzakelijk om een achtergrondcorrectie met een lege schaal, zoals in figuur 2b voeren. Dit kan resulteren in een "achtergrond gecorrigeerde" beeld getoond in figuur 2c een hogere achtergrondsignaal aan de rand van de afbeelding ten opzichte van de oorspronkelijke (figuur 2a), omdat de achtergrondafbeelding (figuur 2b) een lagere intensiteit aan de rand van de afbeelding. Dus, terwijl achtergrondcorrectie kan een signaal sterker aan de rand van het beeld opleveren, is dit een noodzakelijke stap voor daaropvolgende kwantitatieve analyse.

Om een ​​kwantitatieve beoordeling van HerDox accumulatie in tumoren te verkrijgen, werden confocale fluorescentie beelden verkregen op verschillende brandpuntendiepten in situ gevolgd door maximale intensiteit z-projectie van de beelden (figuur 3), en de verwerving van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het geprojecteerde beeld. Het resulterende beeld bevat HerDox accumulatie gegevens via aangegeven z-diepte bij elke pixel en dus het gemiddelde van de fluorescentie-intensiteiten grofweg HerDox ophopingen in tumoren op verschillende diepten kwantitatief.

Om HerDox fluorescentie onderscheiden van autofluorescentie in tumoren en kwantitatief onderscheid de twee met een hoge specificiteit, ratiometrisch spectrale beeldvorming en analyse werd uitgevoerd. De zuivere spectrale signaturen voor doxorubicine en autofluorescentie verkregen spectrale beeldvorming geïllustreerd in figuren 4 en 5 respectievelijk. Reference spectrale signaturen (figuur 6) werden door mengen van verschillende verhoudingen van de zuivere spectrale signaturen met het programma zijn 9. Elke Reference spectrale signatuur vertegenwoordigt hier de relatieve fluorescentie van HerDox opgestapeld in tumoren met betrekking tot autofluorescentie. De spectrale classificatie beelden (gegevens niet in dit document weergegeven) toonden betere kwantitatieve HerDox voorkomens 7 vergeleken met de spectrale ongemengde beeld verkregen door de zuivere referentie spectrale signaturen (Figuur 7). Figuren 4-7 vertegenwoordigen typische bevindingen bij het ​​uitvoeren ratiometric spectrale beeldvorming en analyse.

Figuur 1
Figuur 1. In vivo optische imager. Een optische imaging-systeem met fluorescentie-intensiteit, spectrale, fluorescentielevensduur en intravitale confocale imaging-mogelijkheden moeten worden gebruikt. De multimode optische imaging systeem hier gebruikt wordt getoond, en is described. eerder 8. Afbeelding mits met toestemming van Springer Science & Business Media BV: Hwang, JY, et al., Mol.. Imaging Biol., 14, 431-42 (2012).

Figuur 2
Figuur 2. Vertegenwoordiger fluorescentie-intensiteit beelden van de interne organen en tumoren gewonnen uit een muis ontvangen HerDox. Weefsels en tumoren werden geoogst uit muizen geëuthanaseerd op 24 uur na de laatste (Dag 7) injectie van HerDox Fluorescentie intensiteit beelden voor en na achtergrond correctie (b) worden voorgesteld door (a) en (c), respectievelijk. Klik hier op foto voor vergroting achterhalen .


Figuur 3. Maximale intensiteit z-projectie van de beelden verkregen bij opeenvolgende z-diepte. De gestapelde foto hiernaast representatief zijn voor de confocale scans van tumorweefsel verkregen met opeenvolgende 1 urn diepte. De afbeelding aan de rechterkant toont de samenstelling van de gestapelde foto's aan de linkerkant.

Figuur 4
Figuur 4. Verwerving van een zuivere spectrale handtekening voor doxorubicine. Nadat de beelden van doxorubicine oplossing werd verkregen met opeenvolgende golflengten binnen 510-650 nm, met een stapgrootte van 10 nm (links), de zuivere spectrale signatuur voor doxorubicine werd verkregen met behulp van het programma dat we ontwikkelden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5
Figuur 5. Verwerving van een zuivere spectrale handtekening voor autofluorescentie. Na de beelden van de onbehandelde tumor werden verkregen bij opeenvolgende golflengten binnen 510-650 nm, met een stap-grootte van 10 nm (links), de zuivere spectrale handtekening voor autofluorescentie werd verkregen met behulp van het programma dat we ontwikkelden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

load/50396/50396fig6.jpg "/>
Figuur 6. Vier verwijzing spectrale handtekeningen voor ratiometrische spectrale beeldvorming en analyse. De verwijzing spectrale signaturen zijn gemaakt door het mengen van de zuivere spectrale signatuur met het programma dat we ontwikkelden. De groengekleurde lijn vertegenwoordigt pure autofluorescentie, de rood-gekleurde lijn vertegenwoordigt 0.1.doxorubin 0,9. Autofluorescentie, de blauw gekleurde lijn vertegenwoordigt 0.2. doxorubicine 0,8. autofluorescentie, en de cyaan-kleurige vaste lijn 0.3.doxorubin 0,7. autofluorescence, respectievelijk. Figuur is overgenomen uit de auteurs 'eerdere werk: Hwang, JY, et al., PLoS One 7 (4), (2012)...

Figuur 7
Figuur 7. HerDox fluorescentie in weefsel voor en na spectrale ontmengingtechnieken. Na het behalen van de spectrale signatuur van Dox en autofluorescence, the Dox signalen worden gescheiden door het gebruik van lineaire spectrale ontmengingtechnieken 12,13. De figuur toont de autofluorescentie en HerDox beeld gemengd voordat spectrale de afbeelding gescheiden HerDox na spectrale ontmengingtechnieken ontmengingtechnieken en.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dox fluorescentie kan worden detecteerbaar in vivo met behulp van de multimode imager wanneer tumoren zijn onderhuids. De therapeutisch effectieve dosis van HerDox (0.004 mg / kg) onder de detectiegrens na een enkele dosis. Daarentegen na 7 dagelijkse injecties (1x/day gedurende 7 dagen), de tumor accumulatie en retentie van het deeltje is voldoende om visualisatie van Dox fluorescentie mogelijk.

Het is essentieel bij het ​​werken met Dox of andere fluorofoor in vivo beeldvorming die schone techniek wordt gebruikt. Druppels op de buitenkant van de muis moeten worden vermeden, aangezien de imager de fluorescentie op de buitenkant van de huid detecteren, zonder onderscheid of het Dox extern of intern. Evenzo kunnen Dox besmetting op de handschoenen fluorescerende sporen op de buitenkant van de muis tijdens dierlijke behandeling, waardoor foutieve fluorescentiedetectie veroorzaken.

In het multimode optische systeem, eenlaserstraal wordt gebruikt voor excitatie van HerDox. De laserstraal heeft typisch een Gaussisch profiel. Vandaar dat voor een uniforme excitatie van specimens van belang zijn, zijn optische diffusers benut. Toch is de verstrooide laserlicht enigszins behoudt een Gaussische bundel profiel. Dus, voor ideale kwantitatieve analyse, achtergrond correctie moet worden uitgevoerd. De vóór-gecorrigeerde en achtergrondafbeeldingen hebben meestal een diepte van 16 bits. Daarom, voordat de achtergrond correctie wordt uitgevoerd, de afbeelding diepte moet worden omgezet naar 32 bits om ongewenste fouten uit de afbeelding diepte discrepantie tussen de resultante en input beelden te voorkomen.

Bij de overname van een achtergrondafbeelding van, werd een zwart papier (Artagain) eerder op een beeldvormende plaat om verlichting reflecties te voorkomen voordat fluorescentie beeldvorming. Aangezien de camera is zeer gevoelig, lage achtergrond signalen van de zwart-papier werd gedetecteerd door de camera. Daarom is de achtergrondsignalen getoond in figuur 2 afkomstig van het zwarte papier in plaats van een lege petrischaal.

Een hoge concentratie van doxorubicine oplossing werd gebruikt om pure spectrale signaturen te verkrijgen met hoge nauwkeurigheid. We spectrale resoluties waarbij het systeem is voor het opsporen genoeg fluorescentie van het monster tot betrouwbare spectrale signatuur produceren verder onderzocht. Als resultaat werd de spectrale resolutie afgestemd 10 nm. Hier vonden we dat de microscoop onder de instelling van hogere spectrale resolutie (<10 nm) voldoende fluorescentie om betrouwbare spectrale signatuur opleveren niet konden ontdekken. Met de pure spectrale signatuur, konden we een aantal ratiometrische spectrale signatuur (figuur 6) te genereren. In het bijzonder, kunnen we kwantitatief onderscheiden HerDox fluorescentie signalen van autofluorescentie door de respectieve ratiometrische spectrale signatuur 7. De spectrale ongemengde beeld verkregen met de zuivere spectrale signatuurs (Figuur 7) was vergelijkbaar met de geclassificeerde afbeelding van de twee referentie-spectrale signatuur (blauw:. 0.2.Dox 0,8 Autofl en Groen:.. Autofl). Totaal de ratiometrische confocale / spectrale beeldvorming ontvangen meer kwantitatieve informatie over HerDox accumulatie in tumorcellen in situ met hoge resolutie, waardoor verificatie zijn nut bij de analyse van de nanodeeltjes die aan HER2 + tumors.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur, Daniel Farkas, is voorzitter van Spectral Molecular Imaging. De overige auteurs hebben geen concurrerende belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan LKM-K van de National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 en R01CA140995). Dr Medina-Kauwe bedankt C. Rey, M. M-Kauwe en D. Revetto voor blijvende steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope Leica SPE
In Vivo Optical Imager Spectral Molecular Imaging Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week Charles River Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository 0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle BD 309301
Delta T chamber Bioptechs 04200417B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7, (3), 335-352 (2012).
  2. Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  3. Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23, (2), 367-377 (2006).
  4. Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 81753-81761 (2001).
  5. Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 8795-8803 (2001).
  6. Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13, (10), 821-836 (2006).
  7. Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7, (4), e34463 (2012).
  8. Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16, (6), 066007 (2011).
  10. Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. Biomedical Optical Imaging. Oxford University Press. New York. (2009).
  11. Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
  12. Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4, (2), e4418 (2009).
  13. Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95245-95265 (2005).
Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).More

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter