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Bioengineering

Gezielte Analyse von viralen Proteins Nanopartikel HER2 + Tumoren Lieferung

doi: 10.3791/50396 Published: June 18, 2013

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren für die optische Bildgebung Analyse der Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox. Insbesondere wird eine detaillierte Verwendung der Multimode-Bildaufnahmevorrichtung zum Erfassen Tumor-Targeting und Bewertung Tumorpenetration beschrieben.

Abstract

Der HER2 + Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox weist Tumor-und Tumor-Akkumulation bevorzugte Wachstum Ablation in einem Tiermodell der HER2 + Krebs. HerDox durch nichtkovalente Selbstorganisation eines Tumors Zielzelle Penetrationsprotein mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin ausgebildet ist, über eine kleine Nukleinsäure Linker. Eine Kombination von elektrophilen, Einlagerung und Oligomerisierung Interaktionen erleichtern self-assembly in runde 10-20 nm großen Partikeln. HerDox aufweist Stabilität im Blut sowie einer längeren Lagerung bei verschiedenen Temperaturen. Systemische Abgabe HerDox in tumortragenden Mäusen zur Tumor-Zelltod ohne feststellbare nachteilige Auswirkungen auf Nicht-Tumor-Gewebe, einschließlich des Herzens und der Leber (der unterziehen gekennzeichnet Schäden durch ungezielte Doxorubicin). HER2 Höhe erleichtert Targeting von Zellen, die den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor, damit Tumoren Anzeige erhöhten HER2 Ebenen größere Ansammlung von HerDox weisen im Vergleich zu Zellen, Expressionsingen unteren Ebenen, sowohl in vitro als auch in vivo. Fluoreszenzintensität Bildgebung mit in situ konfokalen und Spektralanalyse kombiniert hat uns erlaubt, in vivo Tumor-Targeting und Tumorzelle Eindringen von HerDox nach systemischer Lieferung überprüfen. Hier haben wir ausführlich unsere Methoden zur Beurteilung der Tumor-Targeting über Multimode-Bildgebung nach systemischer Lieferung.

Introduction

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Tumor-Targeting der Chemotherapie hat das Potenzial, Krebszellen zu niedrigeren Dosis im Vergleich zu beseitigen ungezielte Drogen, weil mehrere gelieferte Therapie am Bestimmungsort anstatt zu verteilen, um Nicht-Tumorgewebe ansammeln können. Da dieser Situation verdünnen sich die Wirksamkeit des Arzneimittels und somit höhere Dosen wirksam zu sein, hat Tumor-Targeting sowohl therapeutische als auch sicherheitstechnische Vorteile gegenüber herkömmlichen nicht-zielgerichtete Behandlung.

Targeting Chemotherapie durch Verkapselung in selbstorganisierte Nanopartikel ermöglicht das Medikament zu bleiben chemisch im Gegensatz zu Medikamenten, die kovalent an Targeting-Moleküle gebunden sind unverändert. Als solche Verbindung hat das Potential, die Aktivität von sowohl dem Wirkstoff und dem Zielmolekül zu ändern; nichtkovalente Anordnung ermöglicht Arzneistoffwirksamkeit beibehalten werden.

Wir haben bereits gezeigt, dass das neue Drei-Komponenten, self-assembled komplex, HerDox, HER2 + Tumoren zielt 1. HerDox durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den Rezeptor-Bindungs-Zelle Penetrationsprotein, HerPBK10 und des chemotherapeutischen Mittels gebildet, Doxorubicin (DOX), über eine kleine Nukleinsäure Linker. HerPBK10 bindet den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (HER) und löst Rezeptor-vermittelte Endozytose 2-4, während endosomalen Membran Penetration durch Einbau des Adenovirus-abgeleiteten Pentonbasis Kapsidprotein 4-6 erreicht wird. Eine positiv geladene Domäne des Proteins ermöglicht Nukleinsäurebindung 4, 5, durch die DNA-interkalierten Dox zum gezielten Transport transportiert werden können. Elektrophile, Einlagerung und möglicherweise Protein-Interaktionen erleichtern Oligomerisierung Selbstorganisation zu rund 10-20 nm großen Partikeln, die stabil sind in Blut und unter längerer Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen 1. Bevorzugte Targeting HER2 + Tumorzellen durch die erhöhte Ligandenaffinität erleichtert, wenn HER2 erhöht ist.

Unsere bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass die systemische Verabreichung von HerDox Ausbeuten bevorzugte Anreicherung in Tumoren über Nicht-Tumorgewebe und im Vergleich zu Dox 1 und Eindringen in Tumorzellen ungezielte in vivo 7. Wir haben beobachtet, dass HerDox Veröffentlichungen Dox nach Tumorzelle Eintrag, so dass Dox Akkumulation in den Zellkern ein. Tumor-Akkumulation erscheint mit Rezeptor korrelieren, als relativ gering HER2-positive Tumoren anreichern weniger HerDox Vergleich zu denen mit vergleichsweise höheren HER2 Stufen 1. Darüber hinaus zeigt die effektive Konzentration Zelltod eine inverse Korrelation mit HER2 Anzeige auf Tumor-Zelllinien unterschiedlicher Zelloberfläche HER2-Stufen 1. HerDox zeigt eine therapeutische Sicherheit und Vorteil gegenüber ungezielte Dox, wie Tumorabtötung tritt bei über 10-mal niedriger Dosis im Vergleich zum entpackengeted Wirkstoff und zeigt keine nachweisbare negative Wirkung auf Herz (nachgewiesen durch Echokardiographie und histologische Färbung) oder Leber (nachgewiesen durch TUNEL-Färbung) Gewebe, im Gegensatz zu ungezielte Dox 1. Trotz seiner Herkunft aus einer Virushülle Protein weist HerPBK10 keine nachweisbare Immunogenität im therapeutischen Bereich 2. Während bereits vorhandenen Antikörper zu ganzen Adenovirus HerPBK10 erkennen können, sind sie nicht in der Lage Zellbindung 2 zu verhindern.

Tumorvolumen über die Zeit gemessen wird, eine Standard-Methode zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit einer Therapie erfolgen und ist für die Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit von HerDox eingesetzt. Ergänzend diesen Ansatz mit in vivo und ex vivo Fluoreszenz Bildgebung hat uns erlaubt, besser zu beurteilen Targeting Effizienz 7. Wir haben insbesondere in situ konfokale Abbildung entfernten Tumoren mit Spektralanalyse Dox Fluoreszenz integriert, dass keine Verifizierung HerDoxt nur bei Tumoren in vivo angesammelt aber drang in Tumorzellen und geliefert Dox in das Zytoplasma und Zellkern 7. Spektralanalyse ermöglichte es uns, weiterhin Dox Fluoreszenz von Autofluoreszenz 7 unterscheiden.

Hier zeigen wir näher unser Ansatz für die Beurteilung HerDox in vivo nach systemischer Lieferung, und vor allem für die Beurteilung durch Targeting Multimode bildgebende Verfahren und Analysen.

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Protocol

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1. Systemische Lieferung In vivo

  1. Mischen genug mit steriler Kochsalzlösung HerDox bis 0,2 ml einer 0,004 mg / kg Dosis HerDox pro Injektion eine 6-8 Wochen alten nu / nu-Maus, die subkutan bilateral Flanke Xenograft gleichzusetzen.
  2. Vorsichtig ziehen die HerDox Mischung in eine 3/10 cc Insulinspritze mit einer 29G Nadel ausgestattet Blasenbildung vermeiden.
  3. 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 3-4% (oder weniger) Anästhesie wird durch kurze Exposition Isofluran in einer Induktion Kammer mit einem Gas Spülsystem (Oxygen Flussraten ausgestattet induziert.
  4. Injizieren Sie die gesamte Mischung in die Schwanzvene einer narkotisierten Maus (0,2 ml pro Injektion). IV Injektion kann auch in einer zurückhaltenden, narkotisierten Maus durchgeführt werden.
  5. Wiederholen Injektionen am selben Maus für sechs aufeinander folgenden Tagen, einmal pro Tag.

2. Fluorescence Imaging in vivo

Die Anhäufung von HerDox Fluoreszenz in Tumorenwerden bis zum letzten Tag der Injektion (Tag 7) mit einem Multimode-Imager nachweisbar. Die folgenden Verfahren beinhalten die Verwendung eines kundenspezifischen Makro-Beleuchtung und Detektion (Abbildung 1) 8.

  1. Schalten Sie den Multimode Optical In vivo Imager.
  2. Wählen Sie eine Emission Bandpassfilter (590 nm ± 30 nm) für Doxorubicin Fluoreszenz-Detektion geeignet.
  3. Schalten Sie Argon-Krypton-Laser und platzieren Sie eine Anregung Bandpassfilter (488 nm ± 10 nm) bei der Laser-Strahlengang.
  4. Schalten Sie den Anästhesie-System und legen Sie dann eine Maus in die betäubende Kammer (Oxygen Flussraten: 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 3-4% (oder weniger) mit einem Gas-Spülung ausgestattet.
  5. Übertragen Sie die Maus aus der betäubende Kammer zur Bildgebung Kammer des Multimode Optical In-vivo-Imager, wenn die Maus narkotisiert ist.
  6. Legen Sie eine nosecone über die Nase der Maus und öffnen Sie den Durchfluss auf kontinuierliche Narkosemitteln verwaltensia während der Bildaufnahme (Oxygen Flussraten: 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 2-3% (oder weniger).
  7. Erwerben Fluoreszenz-Aufnahmen mit einer Belichtungszeit von 5-15 sec.
  8. Führen Bildanalyse und-verarbeitung einschließlich Hintergrund Korrektur oder Kontrast.

3. Ex vivo Fluoreszenz-Imaging

HerDox Fluoreszenz in Tumoren und bestimmte Organe abgebildet werden (einschließlich der Leber, Niere, Milz, Herz-und Skelettmuskel) von eingeschläfert Mäuse nach 24 Stunden geerntet nach der letzten (Tag 7) Injektion von HerDox.

  1. Schalten Sie den Multimode Optical In vivo Imager.
  2. Wählen einer Emission Bandpassfilter (580 nm ± 20 nm) für Doxorubicin Fluoreszenzdetektion.
  3. Schalten Sie Argon-Krypton-Laser und platzieren Sie eine Anregung Bandpassfilter (488 nm ± 10 nm) bei der Laser-Strahlengang.
  4. Platz Tumoren und bestimmten Organen auf einer Petri-Schale in die Kammer o imaging angeordnetf die Multimode Optical In vivo Imager.
  5. Erwerben Fluoreszenz-Aufnahmen von Geweben mit einer Belichtungszeit von 5-15 sec. Ein Beispiel für anfängliche Fluoreszenz Bildaufnahme ist in Abbildung 2a dargestellt. Wiederholen Sie das gleiche mit einem leeren Petrischale, die als Hintergrund (Abbildung 2b) dienen wird.
  6. Führen Bildanalyse und-verarbeitung einschließlich Hintergrund Korrektur oder Kontrast. Ein Beispiel für eine korrigierte Bild wird in 2c dargestellt, aus der Subtraktion von 2b aus Figur 2a.

4. In situ konfokale Bildgebung von Tumoren

In situ konfokale Abbildung ermöglicht die Erfassung und Analyse von HerDox Tumorakkumulation auf zellulärer Ebene.

  1. Schalten Sie eine Leica SPE konfokalen Mikroskop.
  2. Wählen Sie 488 nm Laserlicht zur Anregung von Doxorubicin und Emissions-Wellenlängen (560-620 nm) für DoxorubicinFluoreszenzdetektion.
  3. Wählen Sie einen 40X oder 63X objektiv und Tropfen Immersionsöl auf dem Objektiv.
  4. Auszug frisch Tumoren von Mäusen, die eingeschläfert zuvor empfangenen HerDox und Mock Behandlungen wie in Verfahren 2 beschrieben.
  5. Platz Tumoren auf einer Petrischale auf Eis zu vermeiden Gewebeabbau und übertragen dann die Tumoren zu einem Delta T Kammer für die konfokale Bildgebung.
  6. Erwerben konfokale Bilder der Tumoren bei sequentiellen Fokustiefen (Schrittweite: 1 um, Dicke: 20 um). Ein Beispiel nacheinander aufgenommenen Bildern entlang der z-Achse ist in Fig. 3 linken Seite gezeigt.
  7. Führen maximale Intensität z-Projektion der Bilder. Ein Maximum Intensity Projection der z-gestapelten Bilder ist in Fig. 3, rechte Tafel gezeigt.
  8. Berechnung der mittleren Fluoreszenzintensitäten der maximalen Intensität Z -. Projektion Bilder Mittlere Fluoreszenzintensitäten der Bilder über das gesamte Sichtfeld wurden berechnetd mit ImageJ.

5. Ratiometric Spectral Imaging and Analysis

Ratiometric spektralen Bildgebung und Analyse ermöglicht Diskriminierung zwischen Dox Fluoreszenz und Autofluoreszenz.

  1. Leistung auf einem Laser-Scanning-Fluoreszenz-konfokalen Mikroskop.
  2. Erwerben 15 Bilder der HerDox-behandelten und unbehandelten Tumoren in einer bestimmten Tiefe im Spektralbereich von 510-650 nm, mit einer Schrittweite von 10 nm und Anregung bei 488 nm Licht unter Verwendung eines Leica SPE konfokalen Mikroskop.
  3. Bereiten Sie eine 100 uM Lösung von Doxorubicin.
  4. Führen spektralen Bildgebung des 100 pM Doxorubicin-Lösung, um das reine spektrale Signatur von Dox Fluoreszenz (Spektralbereich: 510-650 nm, ein Schritt Größe: 10 nm) zu erhalten. Typische Ergebnisse der Bildaufnahme von Spectral Imaging und die daraus resultierende Fluoreszenzspektrum aufgetragen als ein Graph in Abbildung 4 dargestellt.
  5. Erwerben Sie die Autofluoreszenz spektrale Signatur von einem Bild cube (Spektralbereich: 510-650 nm, ein Schritt: 10 nm) von Spectral Imaging von unbehandelten Tumoren erhalten. Typische Ergebnisse der Bildaufnahme von Spectral Imaging und die daraus resultierende Fluoreszenzspektrum aufgetragen als ein Graph in Abbildung 5 dargestellt.
  6. Generieren vier Referenz spektralen Signaturen (reine Autofluoreszenz 0.1.doxorubin +0.9. Autofluoreszenz, 0.2. Doxorubicin +0.8. Autofluoreszenz 0.3.doxorubin +0.7. Autofluoreszenz) mit dem Programm, das wir entwickelt 9. Eine typische Kurve vier Referenz spektralen Signaturen ist in Abbildung 6 dargestellt.
  7. Führen spektrale Klassifizierung der Bilder durch den Verweis spektralen Signaturen durch Euklidische Distanzmaß mit dem Programm, das wir zuvor entwickelten 9 definiert.
  8. Die lineare Entmischung dieser Bilder durch die Verwendung eines Entmischung Programm (Plug-in in ImageJ) entwickelten wir 7, 10, zum Vergleich mit der ratiometrischen Spectral Imaging und Analyse. Ein example der Trennung HerDox Fluoreszenz von Autofluoreszenz durch lineare Entmischung ist in Abbildung 7 dargestellt.

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Representative Results

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Abbildung 1 zeigt die in vivo optische Scanner-Prototyp, der für die Zwecke der Bildaufnahme unter mehreren Modalitäten, einschließlich Fluoreszenz-Intensität, spektrale, Lebensdauer, 2-Photonen-, intra-vital konfokalen und Biolumineszenz-Bildgebung gebaut wurde. Darüber hinaus liefert die gekühlte hochempfindliche Kamera und Hochleistungslaser Linien in diesem System eingebaut höheren Kontrast Fluoreszenzbilder Vergleich zu kommerziellen optischen Abbildungssystemen 11, insbesondere für die in-vivo-Nachweis von Doxorubicin Fluoreszenz. Daher war dieses System kritisch für die Verwendung in der vorliegenden Studie, mehrere komplementäre Datenpunkte in der Beurteilung der HerDox in vivo zu erwerben.

Die hohe Tumor Fluoreszenz in Abbildung 2 dargestellt ist typisch nach systemischer Lieferung HerDox und unverbindlich seiner Tumor-Targeting Vorzugspreis. Die Fluoreszenz im Skelettmuskel nachgewiesen ist atypisch und kann fro führenm Anomalien in der Injektion (dh Injektion zu nah am Körper). Qualitativ hat das Bild in Abbildung 2a gezeigt niedrig Hintergrund. Um jedoch eine quantitative Analyse der relativen Fluoreszenzintensität Gewebe durchzuführen, ist es notwendig, einen Hintergrund-Korrektur unter Verwendung einer leeren Schale, wie in 2b gezeigt durchzuführen. Dies kann in einem "Hintergrund korrigiert" Bild in Bild 2c gezeigt, die einen höheren Hintergrund Signal am Rand des Bildes hat im Vergleich zur Ergebnisliste das Original (Abbildung 2a), weil das Hintergrundbild (Abbildung 2b) hat eine geringere Intensitäten an den Rand des Bild. Während also Untergrundkorrektur ein Signalanstieg an der Kante des Bildes ergeben können, ist dies ein notwendiger Schritt für die anschließende quantitative Analyse.

Um eine quantitative Beurteilung der HerDox Anreicherung in Tumoren zu erhalten, wurden konfokale Fluoreszenz-Aufnahmen bei verschiedenen Brennweiten erhältlichTiefen in situ gefolgt von maximaler Intensität z-Projektion der Bilder (3), und Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität des projizierten Bildes. Das resultierende Bild enthält HerDox Akkumulation Informationen über den angegebenen Z-Tiefe an jedem Pixel, und so der Mittelwert der Fluoreszenzintensitäten reflektiert insgesamt HerDox Ansammlungen in Tumoren in unterschiedlichen Tiefen quantitativ.

Um HerDox Fluoreszenz von Autofluoreszenz in Tumoren zu unterscheiden und quantitativ unterscheiden die beiden mit hoher Spezifität, ratiometrischen spektralen Bildgebung und Analyse durchgeführt wurde. Die reinen spektralen Signaturen für Doxorubicin und Autofluoreszenz von Spectral Imaging sind in den 4 und 5 dargestellt sind. Referenz spektralen Signaturen (Abbildung 6) wurden auch durch Mischen verschiedener Verhältnisse der reinen spektralen Signaturen mit dem Programm haben wir 9 erstellt. Jeder reference spektrale Signatur stellt hier relative Fluoreszenz von HerDox in Tumoren mit Bezug auf Autofluoreszenz angesammelt. Die spektralen Klassifizierung Bilder (Daten wurden in dieser Arbeit nicht gezeigt) zeigten bessere quantitative HerDox Ansammlungen 7 im Vergleich zu der spektralen unvermischt Bild über den reinen Bezug spektralen Signaturen (Abbildung 7). Abbildungen 4-7 zeigen typische Befunde bei der Durchführung ratiometrischen Spectral Imaging und Analyse.

Abbildung 1
1. In vivo optischen Scanner. Eine optische Bildgebung mit Fluoreszenz-Intensität, spektrale, Fluoreszenz-Lebensdauer und intravital konfokalen Imaging-Funktionen verwendet werden. Die optische Multimode-Imaging-System verwendet hier gezeigt, und wurde described zuvor 8. Bild zur Verfügung gestellt mit freundlicher Genehmigung von Springer Science & Business Media BV: Hwang, JY, et al, Mol. Gen.. Imaging Biol., 14, 431-42 (2012).

Abbildung 2
Abbildung 2. Repräsentative Fluoreszenzintensität Bilder von inneren Organen und Tumoren, die von einer Maus, die HerDox extrahiert. Gewebe und Tumore wurden aus eingeschläfert Mäuse 24 Stunden nach der letzten (Tag 7) Injektion von HerDox Fluoreszenzintensität Bilder vor und nach Hintergrund-Korrektur (b) werden durch (a) und (c) dargestellt geerntet. Klicken Sie hier, um zu vergrößern herausfinden .


Abbildung 3. Maximale Intensität z-Projektion der Bilder auf sequenzielle z-Tiefe erhalten. Die gestapelten Bilder auf der linken Seite dargestellt sind repräsentativ für die konfokale Scans von Tumorgewebe bei sequentiellen 1 um Tiefe erhalten. Das Bild rechts zeigt die Zusammenstellung der gestapelten Bilder auf der linken Seite.

Fig. 4
Abbildung 4. Erwerb eines reinen spektralen Signatur für Doxorubicin. Nachdem die Bilder von Doxorubicin-Lösung wurden bei sequentiellen Wellenlängen innerhalb 510-650 nm hergestellt, mit einem Schritt-Größe von 10 nm (links), der reinen spektralen Signatur für Doxorubicin erhalten wurde mit dem Programm, das wir entwickelt. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 5
Abbildung 5. Erwerb eines reinen spektralen Signatur für Autofluoreszenz. Nachdem die Bilder von unbehandelten Tumor bei sequentiellen Wellenlängen innerhalb 510-650 nm erhalten wurden, mit einer Schrittweite von 10 nm (links), die reine spektrale Signatur für Autofluoreszenz wurden unter Verwendung des Programms haben wir entwickelt. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Abbildung 6. Vier Referenz spektralen Signaturen für ratiometrischen Spectral Imaging und Analyse. Die Referenz spektralen Signaturen wurden durch Mischen der reinen spektralen Signaturen unter Verwendung des Programms entwickelten wir erstellt. Der grüne durchgezogene Linie stellt reine Autofluoreszenz, die rote durchgezogene Linie 0.1.doxorubin +0,9 darstellt. Autofluoreszenz stellt die blau gefärbte durchgezogene Linie 0.2. Doxorubicin +0.8. Autofluoreszenz und die cyan-farbige durchgezogene Linie 0.3.doxorubin +0.7. Autofluoreszenz sind. Hwang, JY, et al, PLoS One 7 (4), (2012):.. Abbildung ist aus der Autoren reproduziert früheren Arbeiten.

Abbildung 7
Abbildung 7. HerDox Fluoreszenz im Gewebe vor und nach der spektralen un-Mischen. Nach Erhalt der spektralen Signaturen von Dox und Autofluoreszenz, the Dox Signale werden durch lineare spektrale un-mixing 12,13 getrennt. Die Abbildung zeigt die Autofluoreszenz und HerDox gemischten Bild vor spektralen un-Misch-und dem abgetrennten HerDox Bild nach der spektralen un-Mischen.

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Discussion

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Dox Fluoreszenz in vivo nachweisbar sein mit der Multimode-Imager, wenn Tumoren subkutane sind. Allerdings ist die therapeutisch wirksame Dosis von HerDox (0,004 mg / kg) unterhalb der Nachweisgrenze nach einer Einzeldosis. Im Gegensatz dazu, nach 7 tägliche Injektionen (1x/day für 7 Tage), ist der Tumor Akkumulation und Retention der Partikel ausreicht, um die Visualisierung von Dox Fluoreszenz ermöglichen.

Es ist wichtig bei der Arbeit mit Dox oder einem anderen Fluorophor für in-vivo-Bildgebung, dass saubere Technik verwendet wird. Tropfen auf der Außenseite der Maus sollte vermieden werden, da der Scanner die Fluoreszenz an der Außenseite der Haut, ohne zu unterscheiden, ob die Dox externe oder interne ist zu erkennen. Ebenso können Dox Kontamination auf den Handschuhen fluoreszierenden Markierungen auf der Außenseite des Maus verlassen während Behandlung der Tiere, wodurch eine fehlerhafte Fluoreszenzdetektion.

In dem Multimode-System, einLaserstrahl zur Anregung HerDox verwendet. Der Laserstrahl weist typischerweise eine Gaußsche Profil. Daher ist für gleichmäßige Anregung der Proben von Interesse sind optische Diffusoren verwendet. Dennoch ist die diffuse Laserlicht etwas bewahrt eine Gaußsche Strahlprofil. So ideal quantitative Analyse müssen Hintergrund-Korrektur durchgeführt werden. Die vor-korrigierten und Hintergrundbildern haben typischerweise eine Tiefe von 16 Bits. Bevor das Hintergrund-Korrektur durchgeführt wird, sollte das Bild Tiefe auf 32 Bits umgewandelt werden, um unerwünschte Fehler aus der Bildtiefe Diskrepanz zwischen resultierende und Eingabebilder zu vermeiden.

In den Erwerb eines Hintergrundbildes wurde ein schwarzes Papier (Artagain), bereits auf einer Bildplatte in Ordnung zu bringen, um die Beleuchtung Reflexionen bevor Fluoreszenz-Bildgebung zu verhindern. Da die Kamera hochempfindliche wurde niedrig Hintergrundsignale vom schwarzen Papier von der Kamera erfasst wird. Daher wird der HintergrundSignale in Abbildung 2 dargestellt kam aus dem schwarzen Papier statt aus einer leeren Petrischale.

Eine hohe Konzentration von Doxorubicin-Lösung wurde verwendet, um reinen spektralen Signaturen mit hoher Genauigkeit zu erhalten. Wir untersuchten weiter spektralen Auflösungen bei dem das System zum Aufspüren von genügend Fluoreszenz von der Probe, um zuverlässige spektrale Signaturen erzeugen. Als Ergebnis wurde die spektrale Auflösung bis 10 nm eingestellt. Hier fanden wir, dass das Mikroskop unter der Einstellung der höheren spektralen Auflösungen (<10 nm) konnte nicht erkennen ausreichende Fluoreszenz zuverlässige spektralen Signaturen ergeben. Mit der reinen spektralen Signaturen konnten wir erzeugen mehrere ratiometrischen spektralen Signaturen (Abbildung 6). Insbesondere könnte man quantitativ unterscheiden HerDox Fluoreszenz-Signale von Autofluoreszenz von den jeweiligen ratiometrische spektralen Signaturen 7. Die spektrale unvermischt Bild mit dem reinen spektralen Signatur erhaltens (Abbildung 7) war ähnlich dem klassifizierten Bild von den beiden Referenz spektralen Signaturen (blau:. 0.2.Dox +0,8 Autofl und Grün:.. Autofl). Insgesamt stellte die ratiometrischen konfokalen / Spectral Imaging mehr quantitative Informationen über HerDox Akkumulation in Tumorzellen in situ mit hoher Auflösung, also die Überprüfung seiner Nützlichkeit in der Analyse der Nanopartikel geliefert HER2 + Tumoren.

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Disclosures

Der Autor, Daniel Farkas, ist Vorsitzender des Spectral Molecular Imaging. Die übrigen Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu LKM-K von den National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 und R01CA140995) finanziert. Dr. Medina-Kauwe dankt C. Rey, M. M-Kauwe und D. Revetto für anhaltende Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope Leica SPE
In Vivo Optical Imager Spectral Molecular Imaging Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week Charles River Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository 0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle BD 309301
Delta T chamber Bioptechs 04200417B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7, (3), 335-352 (2012).
  2. Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  3. Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23, (2), 367-377 (2006).
  4. Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 81753-81761 (2001).
  5. Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 8795-8803 (2001).
  6. Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13, (10), 821-836 (2006).
  7. Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7, (4), e34463 (2012).
  8. Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16, (6), 066007 (2011).
  10. Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. Biomedical Optical Imaging. Oxford University Press. New York. (2009).
  11. Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
  12. Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4, (2), e4418 (2009).
  13. Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95245-95265 (2005).
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Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).More

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).

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