Summary
Die
Abstract
Vor Jahrzehnten der menschlichen Plazenta wurde gedacht, um eine undurchdringliche Barriere zwischen Mutter und das ungeborene Kind. Allerdings ist die Entdeckung von Thalidomid-induzierten Missbildungen und viele spätere Studien danach bewies das Gegenteil. Heute mehreren schädlichen Fremdstoffen wie Nikotin, wurden Heroin, Methadon oder Drogen sowie Umweltschadstoffe beschrieben, diese Barriere zu überwinden. Mit dem zunehmenden Einsatz von Nanotechnologie ist die Plazenta wahrscheinlich in Kontakt mit neuartigen Nanopartikel kommen entweder versehentlich oder absichtlich durch ein Engagement im Falle von potentiellen Nanomedizin. Daten aus Tierversuchen nicht auf den Menschen übertragen werden, da die Plazenta ist die Spezies-spezifische Säugetierorgans 1. Daher ist die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion durch Panigel et al. 2 und 1967 kontinuierlich von Schneider et al modifiziert. 3 im Jahr 1972, als ein hervorragendes Modell t dienenO Studie die Übertragung von Fremdstoffen oder Partikel.
Hier konzentrieren wir uns auf die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion Protokoll und seine Weiterentwicklung, um reproduzierbare Ergebnisse zu erwerben konzentrieren.
Die Plazenten wurden nach Einwilligung der Mütter von einer unkomplizierten Schwangerschaften Kaiserschnitt unterzogen Lieferung erhalten. Die fetalen und mütterlichen Gefäße eines intakten cotyledon wurden durchbohrt und mindestens fünf Stunden perfundiert. Als Modell Partikel fluoreszenzmarkierten Polystyrol-Partikel mit Größen von 80 und 500 nm Durchmesser wurden in den mütterlichen Kreislauf aufgenommen. Die 80 nm-Partikel konnten die Plazentaschranke und bieten ein perfektes Beispiel für eine Substanz, die über die Plazenta auf den Fötus übertragen werden, während die 500 nm Partikel in der Plazentagewebe oder mütterlichen Kreislauf gehalten wurden. Die ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Modell ist eines der wenigen Modelle, die zuverlässige Informationen überdas Verkehrsverhalten von Fremdstoffen an einem wichtigen Gewebe Barriere, die vorausschauende und klinisch relevante Daten liefert.
Introduction
Die Plazenta ist ein komplexes Organ, das für den Austausch von Sauerstoff, Kohlendioxid, Nährstoffen und Abfallprodukten und gleichzeitig in der Lage, die beiden Schaltungen Blut der Mutter und den wachsenden Fötus voneinander getrennt zu halten. Außerdem verhindert es die Ablehnung des Kindes durch das mütterliche Immunsystem und Hormone absondert, um eine Schwangerschaft zu erhalten. Die zelluläre Barriere wird durch die Zytotrophoblastzellen die verschmelzen und bilden eine echte Synzytium ohne seitliche Zellmembranen 4,5 gebildet. Die ganze Plazenta in mehrere Keimblätter, die fetale villous Baum enthalten und stellen eine funktionelle Einheit der Plazenta organisiert.
Die Untersuchung der Plazenta-Funktion wurde mit der Entdeckung der Thalidomid Fehlbildungen induziert in den 1960er Jahren intensiviert. Aus offensichtlichen Gründen Translokation Studien mit schwangeren Frauen können nicht durchgeführt werden. Folglich wurden verschiedene alternative Modelle entwickelt 6,7 ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Modell Panigel und Mitarbeiter 2,3 entwickelt.
Viele Frauen sind auf verschiedene Xenobiotika wie Drogen oder Umweltgiften während ihrer Schwangerschaft 8 ausgesetzt. Bei einigen Arzneimitteln, die bereits verabreicht wurden regelmäßig während der Schwangerschaft, kann in vivo Studien durch Vergleich der mütterlichen Blutkonzentration mit der in Nabelschnurblut durchgeführt werden. Allerdings, in der Regel gibt es nur begrenzte Informationen über die Pharmakokinetik und-dynamik in den Fötus und das Teratogenität dieser Stoffe.
Zum Beispiel Opiate wie Heroin leicht die Plazentaschranke und kann auf intrauterine Wachstumsretardierung, Frühgeburt oder Fehlgeburt 9,10 führen. Also, bei fehlender Abstinenz während der Schwangerschaft eine Substitutionstherapie mit Methadon wird empfohlen. Der Exvivo menschlichen Plazentaperfusion Modell zeigte, dass die Übertragung von Methadon in den fetalen Kreislauf vernachlässigbar 11, die korreliert gut mit dem berechneten Nabelschnurblut-to-mütterlichen Blut Konzentrationsverhältnis nach der Lieferung der 12.
Nanotechnologie ist ein wachsendes Feld vor allem in der Medizin. Also, unter dem natürlich vorkommenden feinen (<2,5 &mgr; m im Durchmesser) und ultrafeine Partikel (<0,1 &mgr; m im Durchmesser) in Rauch der Waldbrände, Vulkanausbrüche und in der Wüste Staub, die Exposition gegenüber Nanomaterialien (mindestens einer Dimension <0,1 um 13 ) steigt. Dies warf Fragen über die toxikologischen Potential Nanomaterialien. Obwohl kein Mensch Gefahr noch nachgewiesen werden konnte, gibt es Haupt-experimentelle Studien darauf hinweist, dass Nanopartikel können schädliche biologische Reaktionen, die zu toxikologischen Ergebnisse 14 verursachen. Kürzlich gaben einige Studien, dass pränataleLuftverschmutzung auf einen höheren Bedarf Atemwege und Entzündung der Atemwege bei Neugeborenen und Kinder 15,16 verbunden. Darüber hinaus können kleine Nanopartikel als Drug-Carrier verwendet werden, um speziell zu behandeln entweder den Fötus oder die Mutter. Daher wird es offensichtlich, dass umfangreiche Untersuchungen verschiedener Xenobiotika oder Nanomaterialien und deren Fähigkeit, die Plazentaschranke erforderlich sind. Eine aktuelle Übersicht über die aktuellen Studien auf Plazentagängigkeit zu Nanomaterialien in Menezes et al zusammengefasst. 2011 17 und Buerki-Thurnherr et al. 2012 7.
Die ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion Modell bietet eine kontrollierte und zuverlässiges System für die Untersuchung der Plazenta Transport verschiedener endogener und exogener Verbindungen 3,11,12,18,19 und eine breite Palette von anderen Funktionen der Plazenta wie Mechanismen, die für die Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Präeklampsie <sup> 20-22. In diesem Protokoll haben wir vor allem auf dem Aufbau, Handhabung und Verfahren, die das Studium der Akkumulation, Effekte und Translokation Preise einer breiten Palette von Fremdstoffen oder Nanopartikeln erlauben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereiten der Perfusion Systems
- Richten Sie die Perfusion System, bestehend aus einem Wasserbad, ein Perfusionskammer, zwei Spalten für Sauerstoffversorgung, zwei Schlauchpumpen, zwei Blasenfallen, zwei Durchlauferhitzern und einem Drucksensor (Abbildung 1). Verbinden dieser Komponenten mit Rohrabschnitte aus Silikon und Polyvinylchlorid-Materialien nach dem Schema in Fig. 2 aufgebaut. Schließlich gibt es zwei Schaltungen, die die Mutter und Kind-Schaltung sind.
- Schalten Sie auf dem Wasserbad, den Durchlauferhitzer und die Heizung für die Perfusionskammer. Die Temperatur sollte 37 ° C sein
- Aufwärmen des Perfusionsmedium (NCTC-135 Zellkulturmedium verdünnt 1:2 mit Earle-Puffer (6,8 g / L Natriumchlorid 0,4 g / L Kaliumchlorid, 0,14 g / l Mononatriumphosphat, 0,2 g / L Magnesiumsulfat, 0,2 g / l Calciumchlorid, 2 g / l Glucose) mit Glukose (1 g / L), Dextran 40 (10 g / L), Rinderserumalbumin (10 g ergänzt/ L), Heparin-Natrium (2.500 IU / L), Amoxicillin (250 mg / L) und Natriumbicarbonat (2,2 g / l), pH 7,4) in dem Wasserbad.
- Nachfolgend spülen die arteriellen Systeme des fetalen und mütterlichen Kreislauf mit a) 200 ml destilliertem Wasser, b) 50 ml 1% iger Natronlauge, c) 1% Phosphorsäure und d) wieder 200 ml destilliertem Wasser (Flussrate: 15 - 20 ml / min).
- Schließen Sie das fetale Kanüle (Ø 1,2 mm; stumpfe Nadel sollte auf einer modifizierten Flügelkanüle Infusionsset befestigt werden), um die fetale arterielle Schlauch.
- Spülen Sie die arteriellen Systeme des fetalen und mütterlichen Kreislauf mit Perfusionsmedium bis alle Rohre Medium (Durchfluss: 15-20 ml / min) enthalten. In diesem Schritt füllen die Blasenfallen und entfernen Sie alle Blasen hinter dem Ableiter. Dann stoppen die Pumpen. Es ist wirklich wichtig, dass die zuführenden Arterien Rohre stets frei von Blasen, sonst nach Kanülierung besonders die feinen Gefäße fetalen reißen können.
- Schalten Sie den Gasstrom. Die mütterliche Schaltung wird mit Sauerstoff angereichert with 5% Kohlendioxid und 95% synthetischer Luft und die fetale Schaltung mit 5% Kohlendioxid und 95% Stickstoff.
- Start der Aufnahme des Drucksensors.
2. Kanülieren die Placenta
- Erhalten intakt placentae von einer unkomplizierten Schwangerschaften nach der primären Kaiserschnitt. Die schriftliche Zustimmung gegeben hat (wurde im Falle unserer Studien erhalten) von den Müttern werden vor der Auslieferung und die Studie hat die von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden (war der Fall in unsere Studien). Erste visuelle Kontrolle sollte von Hebammen durchgeführt werden, um eine gesunde und intakte Plazenta versichern.
- Kanülierung der Plazenta ist ein wichtiger Schritt! Während jede kleine Störung Perfusion des Gewebes kann zu einem Leck zwischen dem mütterlichen und fetalen Kreislauf führen. Die Plazenta ist innerhalb von 30 min nach der Lieferung erhalten werden.
- Wählen Sie eine intakte cotyledon an der Randzone der Plazenta ohne sichtbare Störungen auf der mütterlichen Seite. Am Chorionplatte,binden beide verbundenen Zweige der Nabelschnur Arterie und Vene oberhalb des späteren Kanülierung Seite (in Richtung der Nabelschnur) mit chirurgischem Nahtmaterial. Machen Sie immer zwei Knoten.
- Kanülieren der fetalen Arteria erste. Die fetale Plazenta Arterien sind immer kleiner und dünner als die Venen.
- Machen Sie eine Naht um die fetale Arterie, sondern binden Sie es nicht sofort. Halten Sie das Gefäß mit einer Pinzette, schneiden Sie das Gefäß sorgfältig und setzen Sie den kleinen Kanüle (Ø 1,2 mm) in der Arterie. Dann binden Sie die Naht (zwei Knoten).
- Fahren Sie mit dem fetalen Vene in der gleichen Weise, sondern verwenden eine größere Kanüle (Ø 1,5-1,8 mm; stumpfe Nadel sollte auf einer modifizierten Flügelkanüle Infusionsset befestigt werden).
- Schalten der fetalen Pumpe (2 ml / min). Wenn es kein sichtbares Leck und Blut ausströmt aus dem fetalen Venenkanüle, langsam erhöhen den Fluss bis zu 4 ml / min. Beobachten des Drucks in der fetalen Arteria Wert nicht mehr als 70 mmHg. Wenn Lecks bei der fetalen oder Maternal Kanüle befestigen Sie sie mit einem anderen Faden.
- Legen Sie die Plazenta auf das Gewebe Halter mit der fetalen Seite nach oben und ziehen Sie den Plazenta-Membran und Gewebe über die Spikes. Am Ende der perfundierten cotyledon sollte in der Mitte des Loches in dem Papierrollenhalter sein.
- Stabilisieren Sie den Teil, wo nur die Membran hält die Plazenta mit einem Silikon-Membran (Ø 1 mm) oder alternativ zwei Parafilm Stücke.
- Montieren Sie das komplette Gewebe Halter, die Schrauben festziehen und schneiden Sie die überstehenden Gewebes. Bitte beachten Sie, dass der venösen und arteriellen Kanülen nicht eingeklemmt, sondern lag in den kleinen Kanälen des Gewebes Inhaber.
- Drehen Sie den Papierrollenhalter den Kopf, steckte es in den Perfusionskammer und fügen Sie den Deckel. Jetzt sollte der mütterlichen Seite an der Spitze sein. Überprüfen Sie immer, wenn die fetalen Kreislauf noch intakt ist und das Medium strömt aus dem fetalen Venenschlauchset.
- Drehen der mütterlichen Pumpe (12 ml / min). Führen Sie die drei stumpfen Kanülen (Ø 0,8 mm) an der THe Ende des mütterlichen Arterie Rohr in die intervillösen Raum durch Eindringen der dezidualen Platte. Um das Perfusat dem mütterlichen Kreislauf zurück legte eine Röhre venösen Abfluss, der auch mit dem mütterlichen Pumpe in die unterste Position im oberen Teil der Kammer Perfusion angeschlossen.
- Schließen Sie das fetale Venenkanüle der fetalen Vene Rohr.
3. Ausführen des Pre-und Experimentelle Phase der Perfusion
- Damit die Gewebe aus dem ischämischen Periode nach der Entbindung zu erholen und zu spülen, das Blut im intervillösen Raum, ist eine offene Vorphase von 20 min notwendig. Das bedeutet, dass die mütterlichen und fetalen Vene führen nicht zurück in die arteriellen Reservoir, das die Perfusionsmedium. Sammeln Sie die fötalen und mütterlichen venösen Abfluss in einer Flasche und entsorgen Sie sie nach der Pre-Phase.
- Um die Integrität der Perfusion beurteilen erneut eine Vorphase von 20 min, jedoch in einem geschlossenen Kreislauf. Mit zwei getrennten Behältern mit Perfusionsmediumfür die fetale und mütterliche Schaltung und schließen Sie die Schaltungen von führenden der fetalen venösen Abfluss zurück in der fetalen Reservoir und der mütterlichen venösen Abfluss zurück in die mütterliche Reservoir.
- Für die Haupt-Perfusion Experiment vorbereitet zwei Kolben mit 120 ml Perfusionsmedium (eine für die Mutter und eine für die fötale Reservoir). Fügen Sie den radioaktiv markierten 14 C-Antipyrin (4 nCi / ml; dient als positive Kontrolle; ACHTUNG: radioaktive Substanz) und die fluoreszenzmarkierten xenobiotischen oder Nanopartikel, die man will, um die mütterliche Reservoir zu analysieren. Mischen Sie die mütterliche Perfusat gut.
- Starten Sie das Experiment durch Austausch der reinen Perfusionsmedium mit den beiden vorbereiteten Kolben (fetale und mütterliche Stauseen). Schließen Sie die Schaltungen von führenden der fetalen venösen Abfluss zurück in der fetalen Reservoir und den mütterlichen venösen Abfluss zurück in die mütterliche Reservoir.
- Fahren Sie mit der Perfusion für 6 Stunden und nehmen regelmäßig Proben. Immer resuspendieren das Medium in der fetalen und mütterlichenReservoir vor der Entnahme.
- Kontrollieren Sie den Druck in der fetalen Arteria (sollte nicht mehr als 70 mmHg), pH-Wert in beiden Kreisen (sollte in einem physiologischen Bereich 7,2-7,4 sein) und das Volumen der beiden Stauseen (fetale Volumenverlust sollte nicht mehr als 4 ml / h) während der Perfusion . Wenn notwendig, den pH-Werten unter Verwendung von entweder Salzsäure oder Natriumhydroxid.
- Wenn der Volumenverlust in der fetalen Reservoir übersteigt 4 ml / h gibt es ein Leck in das Gewebe, und man muss die Durchblutung zu stoppen. Die Erfolgsrate einer Perfusion für 6 Stunden ohne Leck ist etwa 15-20%.
- Stoppen Sie die Perfusion nach 6 Stunden. Drehen Sie die Pumpen, Wasserbad, Durchlauferhitzer und Gasstrom.
- Entfernen Sie die Plazenta von der Gewebe-Halter, schneiden Sie den durchbluteten cotyledon (heller als die unperfused Gewebe) und gewogen.
- Nehmen Sie Proben von unperfused (Teil der Plazenta, die am Anfang abgeschnitten wurde; konnte bereits während der Pre-Phase) entnommen und durchbluteten Gewebe (je ca. 1 g) und speichert sie bei -20 ° Cbis zur Homogenisierung oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Analyse. Fix noch Gewebeprobe in 4% Formalin zur histopathologischen Auswertung. Die Proben sollten alle Schichten der Plazenta.
- Reinigen der Rohre nach Perfusion durch sukzessives Spülen der arteriellen System des fötalen und mütterlichen Kreislauf mit a) 200 ml destilliertes Wasser, b) 50 ml 1%-iger Natronlauge, c) 50 ml 1% iger Phosphorsäure und d) erneut 200 ml destilliertem Wasser (flow: 15-20 ml / min).
Der gesamte Arbeitsablauf der Plazenta Perfusion ist in Abbildung 3 dargestellt.
4. Die Analyse der Proben
- Zentrifugieren Sie die Proben Perfusat für 10 min bei 800 xg vor der Analyse restliche Erythrozyten zu entfernen. Nehmen Sie den Überstand für die weitere Analyse. Die Proben können über Nacht bei 4 ° C belassen werden Für die Analyse von Leptin und hCG-Produktion können die Proben bei -20 ° C gelagert werden
- Um die Durchlässigkeit der AuswertungsPlazenta analysieren die 14 C-Antipyrin durch Flüssigszintillationszählung. Mischen Sie 300 ul der fetalen und mütterlichen Proben mit 3 ml Szintillationscocktail und Maß für 5 min in einer Beta-Zähler.
- Um die Übertragung der fluoreszierenden Nanopartikel oder die xenobiotischen von Interesse lesen Sie die Fluoreszenz bei 485 nm Anregung und 528 nm Emission in einem Mikroplatten-Reader (angezeigt Wellenlängen sind für die Analyse der gelb green label, die wir für die Nanopartikel verwendet) zu beurteilen.
- Um die Lebensfähigkeit des Plazentagewebe während der Perfusion messen die Glukose Verbrauch und Laktat-Produktion in der fetalen und mütterlichen Kreislauf mit einem automatisierten Blutgassystems bestimmen. Zudem untersuchen die Produktion des Plazentahormone menschlichen Choriongonadotropin (hCG) und Leptin in die homogenisierte Gewebeproben und die Perfusaten durch Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4A zeigt die Perfusion Profile kleiner Polystyrol-Partikel (80 nm), die über die Plazenta im Vergleich zu größeren Teilchen Polystyrol (500 nm), die nicht an der fetalen Kompartiment übertragen wurden transportiert. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert Partikelkonzentration zu dem gegebenen Zeitpunkt von mindestens 3 unabhängigen Experimenten. Für Polystyrol-Nanopartikel die Plazenta Übertragung größenabhängigen 19. Nach 3 h Plazenta Perfusion bereits 20-30% der ursprünglich zugesetzten 80 nm Polystyrol-Partikel wurden aus dem mütterlichen zum fetalen Schaltung übertragen, wobei die 500 nm Polystyrolpartikel nicht angezeigt wurden in der fötalen Schaltung auch nach 6 h Perfusion. Dennoch ist der mütterliche Konzentration der Teilchen 500 nm abnimmt. Fluoreszenzbilder am histologischen Schnitt des Gewebes nach Perfusion zeigte, dass diese Teilchen in die Zotten der Plazenta (Daten nicht gezeigt) zu akkumulieren. 4B 14 C-Antipyrin. Antipyrin als kleines lipophiles Molekül wird über die Plazenta über passive Diffusion verteilt und dient als Kontrolle für die Integrität der Schaltungen. Nach 4-6 h Perfusion ein Gleichgewicht zwischen dem fetalen und mütterlichen Antipyrin Konzentration sollte 23 gebaut werden. Um zu beurteilen, und vergleichen Sie die Plazenta Transport von Xenobiotika die fetale-to-mütterlichen Wirkstoffkonzentration (F / M)-Verhältnis in der Regel angezeigt wird (Abbildung 5).
Durch die Analyse von Laktat und Plazenta Hormon (humanes Choriongonadotropin und Leptin) Produktion sowie Glucoseverbrauch die Lebensfähigkeit und Funktionalität des Plazentagewebe während der Perfusion könnte überwacht werden (Abbildung 6). Die Werte für die Infusionen mit xenobiotischen sollte immer im gleichen Bereich wie die Werte werden von der Kontrolle Perfusion ohne Fremdstoff. Außerdem histop athological Auswertung der durchbluteten Gewebe der Plazenta durchgeführt werden konnte. Ein Vergleich mit nicht-perfundierten Plazentagewebe könnte dann zeigen pathologische Veränderungen durch Perfusion (zB bakterielle Kontamination) und könnte daher als eine weitere Qualitätskontrolle Parameter dienen.
Weitere repräsentative Ergebnisse mit der ex vivo Dual Umluftbetrieb menschlichen Plazentaperfusion Modell erhalten wurden kürzlich veröffentlicht 11,19.
Abbildung 1. Ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Set-up. 1) Wasserbad mit mütterlichen und fetalen Stauseen, 2) Perfusionskammer, 3) Blasenfalle, 4) Oxygenator Spalten und 5) Durchlauferhitzer.
load/50401/50401fig2.jpg "/>
Abbildung 2. Schematische Darstellung der ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Modell FA: fetale Arterie; FV:. Fetalen Vene; MA: mütterliche Arterie, MV: mütterliche Ader; BT: Blasenfalle; PS: Drucksensor
Abbildung 3. Arbeitsablauf eines ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Experiment. Nach der Lieferung der Plazenta innerhalb von 30 min durchbohrt werden muss. Vor 6 Stunden Versuchsphase mit Rückführung eine offene Vorphase und geschlossenen Vorphase sollte mindestens 20 min jeden durchgeführt werden.
Abbildung 4. Perfusion Profile von Polystyrol-Teilchen und 14 </ Sup> C-19 Antipyrin. Perfusion Profil von Polystyrol-Partikel in den Größen 80 nm (n = 4) und 500 nm (n = 3). Zunächst 25 ug / ml und 4,2 nCi Partikel / ml 14 C-Antipyrin wurden dem mütterlichen Kreislauf aufgenommen. Die Menge der Partikel (A) und 14 C-Antipyrin (B) in den Mutter (M, geschlossene Symbole) und fetalen (F, offene Symbole) Schaltungen nach den angegebenen Zeitpunkten gemessen. Angezeigt wird die mittlere Konzentration ± SE. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 5. Größe-abhängige Übertragung von Polystyrol-Partikel in der menschlichen Plazenta 19. Die Verhältnisse zwischen fetalen und mütterlichen Konzentrationen von 14 C-Antipyrin und Polystyrol-Partikel waren calculated nach 180 min der Plazenta Perfusion. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SE von mindestens 3 unabhängigen Experimenten. Die Steuerung Spalte zeigt Infusionen ohne Partikel aber mit 14 C-Antipyrin. (* P <0,05 verglichen mit 80 nm-Verhältnis Wert).
Abbildung 6. Die Lebensfähigkeit der Plazenta-Gewebe während der Perfusion 19. (A) Glucose und Lactatproduktion in der durchbluteten Plazenta. Angezeigt wird die Summe der Änderungen in Gesamtgehalt in den Schaltungen (fetale und maternale) über die Zeit durch das Gewicht des perfundierten cotyledon unterteilt. (B) normalisierte Produktion (NP durch anfängliche Gewebe Inhalt T0 unterteilt) der Plazentahormone menschlichen Choriongonadotropin und Leptin. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SE von lOsten 3 unabhängigen Experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Unter dem Dual Umluftbetrieb Perfusion zeigte hier, gibt es mehrere andere experimentelle Konfigurationen möglich, abhängig von der Frage, die beantwortet werden muss. Besonders offen Plazenta Infusionen werden häufig verwendet, um die Arzneimittel-Clearance im Steady-State-Konzentration 3 zu beurteilen. Die Rückführung Perfusion Set-up kann auch angewendet werden, um den aktiven Transport von endogenen oder exogenen Substanzen zu bestätigen. Für diesen Ansatz die gleiche Konzentration des xenobiotischen muss der mütterlichen und der fetalen Kreislauf hinzugefügt werden. Angenommen, dass es den aktiven Transport gegen den Konzentrationsgradienten kann Akkumulation der Testsubstanz in einem der beiden Schaltungen 24 beobachtet werden. Zu beachten ist, ist die Zugabe der Testsubstanz lediglich der fetalen Schaltung auch möglich und kann den Mechanismus der Transport über die Plazenta von diesem Stoff 25 offenbaren.
Das Protokoll hat sich im Laufe tim entwickelte und kann zwischen verschiedenen Forschungsgruppen vor allem in Bezug auf den Durchfluss, die Zusammensetzung der Perfusionsmedium, Form Sauerstoffversorgung und Heizung 26,27 variieren. Vor allem die Fließgeschwindigkeit beeinflussen können, zu welchem Zeitpunkt transplazentare Übertragung auftritt. Um dies zu kontrollieren, ist die Zugabe eines passiv transportiert Referenz-Verbindung wie Antipyrin wichtig. Die Übertragungsrate des Fremdstoff kann immer auf die Übertragungsrate von Antipyrin (F / M-Verhältnis sollte über 0,75 sein) 26 verglichen werden. Da die Übertragung Antipyrin wird hauptsächlich durch die Strömung und den Austausch Oberfläche begrenzt, nimmt dieser Vergleich Unterschiede in der Strömung und die Größe der perfundierten cotyledon berücksichtigt, die zwischen den Experimenten variieren könnten. Darüber hinaus könnte FITC-Dextran auf die fötale Schaltung als Kontrolle für die Integrität der Barriere 26 dienen hinzugefügt werden. Fetal Volumenverlust wird auch als Marker für die Integrität der Barriere eingesetzt. Normalerweise wird eine fetale Flüssigkeitsverlust bis 4 ml / h 28 erlaubt, aber diere es keine allgemein akzeptierte Grenze.
Offensichtlich gibt es einige Nachteile der ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Verfahren wie inter-individuelle Variationen und eine geringe Erfolgsquote (15-20%). Darüber hinaus kann eine Perfusion Zeitraum von 6 Stunden nicht simulieren eine chronische medikamentöse Behandlung und kann daher nicht völlig ausschließen die Übertragung eines xenobiotischen nach langfristiger Exposition. Eine weitere Einschränkung des Modells ist, dass vor allem die Übertragung an transplazentare Laufzeit beurteilt wird, während die Transportgeschwindigkeit am frühen Gestationsalter wenn die Barriere dicker ist bleibt noch unbekannt. Tatsächlich ist Perfusion ersten Trimester placentae möglich, aber die Verfügbarkeit dieser placentae ist ziemlich begrenzt. Dennoch, bis jetzt die ex vivo Plazentaperfusion Verfahren ist das einzige Modell, um den Transport von verschiedenen Xenobiotika oder Nanopartikel in organisierten menschlichen Plazentagewebe studieren. Während Toxikodynamik in der ex vivo Perfusion menschlichen Modell kann nur in der pl analysiert werdenacental Gewebe, können Tierversuche in der Tat auch Informationen über die Embryotoxizität. Obwohl wegen der anatomischen Unterschiede der Plazenta-Schranke zwischen Mensch und Nager diese Ergebnisse nicht auf den Menschen extrapoliert werden 4,5. Eine weitere Möglichkeit zur Übertragung transplazentare untersuchen kann Zellkulturmodellen wie primäre Zytotrophoblasten, Chorionkarzinom Zelllinien isoliert Plasmamembranvesikel oder Plazentagewebe Explantate 29 sein. Die am häufigsten verwendete Modell ist die BeWo Zelllinie, diese Zellen aus einer malignen Gestationsalter choriocarcinoma abgeleitet und kann eine konfluente Monoschicht auf eine permeable Membran bilden, so Transportstudien durchgeführt werden kann. Ergebnisse von Studien zum Transport mit dem BeWo Zellmodells korrelieren gut mit den Ergebnissen in der ex vivo menschlichen Plazentaperfusion 30 erhalten. Allerdings, um die Details des Drogenkonsums Transport (z. B. Beitrag eines spezifischen Transportprotein) und den Stoffwechsel zu untersuchen, kann die Zelle BeWo Modell m seinErz machbar vor allem weil es einfacher zu handhaben ist und anfällig für Manipulation wie Expression von gentechnisch veränderten Transporter oder Enzyme, aber bezüglich der allgemeinen Droge Transfer Studien die Zuverlässigkeit dieses Modells ist begrenzt. Es fehlt die Durchblutung und die Integrität der Monolayer muss sorgfältig geprüft werden, da sie von mehreren Faktoren wie Zellkultur Bedingungen abhängt, Aussaatdichte, Expositionsdauer und die Membran Einlage 6,29.
Verschiedene Xenobiotika und auch Nanopartikel binden an verschiedene Plasmaproteine, die wesentlichen Einfluss auf die Übertragung transplazentare 31; angesichts der Bindung an Plasmaproteine ist daher wichtig. Als Perfusionsmedium enthält Rinderserumalbumin, die häufigste Plasmaprotein. Kürzlich zeigte eine Studie, dass die Übertragung Verhältnisse verschiedener Substanzen mit der ex vivo menschlichen Plazentaperfusion Modell erhalten korrelieren sehr gut mit der in vivo Nabelschnurblut von MütternKonzentration im Blut Verhältnisse, wenn die Übertragung Verhältnisse nach dem Ausmaß der Plasmaproteinbindung 12 wurden angepasst.
Insgesamt ist die ex vivo Plazentaperfusion Modell eine gültige und zuverlässige Methode, um den Transport über die Plazenta zu untersuchen und die in vivo diaplazentare von Fremdstoffen und Nanopartikel vorherzusagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird finanziell vom Schweizerischen Nationalfonds (NFP 64 Programms, gewähren keine 4064-131232) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
| Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
| Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
| Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
| Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPMENT | |||
| Water bath | VWR | 462-7001 | |
| Thermostat | IKA-Werke GmbH Co. KG | 3164000 | |
| Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
| Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Blunt cannulae ( 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Blunt cannulae ( 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Blunt cannulae ( 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Blunt cannulae ( 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
| Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH meter + electrode | VWR | 662-2779 | |
References
- Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
- Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
- Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
- Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
- Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
- Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
- Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
- Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers' requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
- Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
- von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
- Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
- Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. , (2008).
- Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
- Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
- Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
- Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
- Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
- Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
- Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
- May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
- Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
- Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
- Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
- leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
- athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
- Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
- Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
- Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
- Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
- Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).
