Den<em> Ex vivo</em> Dual resirkulerende humant placentaperfusjon modellen kan brukes til å undersøke overføring av xenobiotics og nanopartikler over det humane placenta. I denne videoen protokollen beskriver vi utstyr og teknikker som kreves for en vellykket gjennomføring av en placenta perfusjon.
Tiår siden den menneskelige morkaken var tenkt å være en ugjennomtrengelig barriere mellom mor og ufødte barn. Men oppdagelsen av thalidomid-induserte misdannelser og mange senere studier etterpå beviste det motsatte. I dag flere skadelige xenobiotics som nikotin, ble heroin, metadon eller narkotika samt miljøgifter beskrevet å overvinne denne barrieren. Med den økende bruk av nanoteknologi, er placenta som kan komme i kontakt med nye nanopartikler enten ved et uhell eller med vilje ved eksponering i tilfelle av mulige nanomedical anvendelser. Data fra dyreforsøk kan ikke ekstrapoleres til mennesker fordi morkaken er den mest artsspesifikke pattedyr organ en. Derfor, den ex vivo dual resirkulerende human placental perfusjon, utviklet av Panigel et al. 1967 2 og kontinuerlig modifisert av Schneider et al. 1972 3, kan tjene som en utmerket modell to studere overføring av xenobiotics eller partikler.
Her fokuserer vi på ex vivo dual resirkuleringsanlegg menneskelig placentaperfusjon protokollen og dens videre utvikling for å skaffe reproduserbare resultater.
Den placentae ble innhentet etter informert samtykke fra mødre fra ukompliserte sikt svangerskap gjennomgår keisersnitt. De foster eller mor fartøy av en intakt cotyledon ble kanylert og perfused minst fem timer. Som en modell partikkel fluorescensmerkede polystyren-partikler med størrelser på 80 og 500 nm i diameter ble tilsatt til den maternal krets. De 80 nm-partiklene var i stand til å krysse placenta, og gir et godt eksempel på et stoff som blir overført over placenta til fosteret mens de 500 nm partikler ble beholdt i placenta-vev eller mors krets. Den ex vivo menneskelig placentaperfusjon modellen er en av få modeller som gir pålitelig informasjon omtransport oppførselen til xenobiotics på et viktig vev barriere som leverer prediktive og klinisk relevante data.
Placenta er et komplekst organ, som er ansvarlig for utveksling av oksygen, karbondioksyd, næringsstoffer og avfallsprodukter og samtidig i stand til å holde de to blod kretser av mor og foster den voksende skilt fra hverandre. I tillegg hindrer det avvisning av barnet ved mors immunsystem og utskiller hormoner for å opprettholde svangerskapet. Den cellulære barrieren er dannet av de cytotrophoblast celler som smelter og danner en sann syncytium uten sideveis cellemembraner 4,5. Hele placenta er organisert i flere cotyledons, som inneholder en fetal villøse treet og representerer en funksjonell enhet av morkaken.
Studiet av placenta funksjonen ble intensivert med oppdagelsen av thalidomid induserte misdannelser i 1960. Av åpenbare grunner translokasjon studier med gravide kvinner ikke kan utføres. Derfor har ulike alternative modeller er utviklet 6,7 </sopp>. Den mest lovende og trolig mest klinisk relevant modell er ex vivo menneskelig placentaperfusjon modell utviklet av Panigel og medarbeidere 2,3.
Mange kvinner er utsatt for ulike xenobiotics som narkotika eller miljøgifter under svangerskapet 8. For noen stoffer som allerede var administrert regelmessig under svangerskapet, kan in vivo studier utføres ved sammenligning av morens blod konsentrasjon med det i navlestrengsblod. Men generelt er det bare begrenset informasjon om farmakokinetikk og-dynamikk hos fosteret og teratogenisiteten av disse stoffene.
For eksempel opiater som heroin lett krysser placenta og kan føre til intrauterin veksthemning, prematur fødsel eller spontan abort 9,10. Så, i tilfelle av manglende avholdenhet under svangerskapet en substitusjonsbehandling med metadon anbefales. Exvivo human placentaperfusjon modell viste at overføringen av metadon inn i fosterets sirkulasjon er ubetydelig 11, som korrelerer godt med den beregnede ledningen blod-til-mors blod konsentrasjon forholdet etter levering 12..
Nanoteknologi er et voksende felt, spesielt i medisin. Så, under den naturlig forekommende fine (<2,5 pm i diameter) og ultrafine partikler (<0,1 pm i diameter) i røyk av skogbranner, vulkan utbrudd og i ørken støv, eksponering mot konstruert nanomaterialer (minst en dimensjon <0,1 pm 13 ) er økende. Dette reiste spørsmål om toksikologiske potensialet av konstruerte nanomaterialer. Selv om ingen menneskelig fare kunne bevises ennå, er det viktigste eksperimentelle studier som indikerer at nanopartikler kan forårsake uønskede biologiske responser som fører til toksikologiske utfall 14. Nylig, indikerte noen studier at prenatal eksponering forluftforurensning er koblet til en høyere respiratorisk nød og luftveisinflammasjon hos nyfødte og barn 15,16. I tillegg kan små nanopartikler brukes som medikament bærere til spesifikt å behandle enten fosteret eller moren. Derfor blir det tydelig at omfattende studier av forskjellige xenobiotics eller nanomaterialer og deres evne til å krysse placenta er påkrevd. En faktisk oversikt over aktuelle studier på placenta permeabilitet til konstruert nanomaterialer er oppsummert i Menezes et al. 2011 17 og Buerki-Thurnherr et al. 2012 7.
Den ex vivo dual resirkulerende humant placentaperfusjon modellen gir en kontrollert og pålitelig system for å studere det placental transport av forskjellige endogene og eksogene forbindelser 3,11,12,18,19 og en rekke andre funksjoner i placenta lignende mekanismer som er ansvarlige for den utvikling av patologiske tilstander som preeklampsi <sup> 20-22. I denne protokollen fokuserer vi hovedsakelig på settet opp, håndtering og metode som gjør at studiet av akkumulering, effekter og translokasjon priser på et bredt sett av xenobiotics, nanopartikler.
Under dual resirkuleringsanlegg perfusjon viste her, er det flere andre eksperimentelle som er mulig avhengig av spørsmålet som må besvares. Spesielt åpne placenta perfusjoner blir ofte brukt til å vurdere stoffet clearance ved steady-state konsentrasjon tre. Den resirkulerende perfusjon set-up kan også anvendes for å bekrefte aktiv transport av endogene eller eksogene substanser. For denne tilnærmingen samme konsentrasjon av xenobiotic må legges til mors og fosterets sirkulasjon. Antatt at det er ak…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av den sveitsiske National Foundation, (NRP 64-programmet, gir ingen 4064-131232).
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
EQUIPMENT | |||
Water bath | VWR | 462-7001 | |
Thermostat | IKA-Werke GmbH & Co. KG | 3164000 | |
Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
Notebook | Hewlett Packard | ||
Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
Blunt cannulae (Ø 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
Blunt cannulae (Ø 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
Blunt cannulae (Ø 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
Blunt cannulae (Ø 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
Parafilm | VWR | 291-1212 | |
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
pH meter + electrode | VWR | 662-2779 |