Summary
Abstract
Insan plasenta onlarca yıl önce anne ve doğmamış çocuk arasında bir aşılmaz engel olduğu düşünülüyordu. Ancak, talidomid bağlı doğum kusurları ve çok daha sonraki çalışmalar keşfinden sonra tam tersi oldu. Bugün nikotin gibi birçok zararlı ksenobiyotiklerin, eroin, metadon ya da ilaçlar gibi çevresel kirleticiler bu engeli aşmak için tanımlanmıştır. Nanoteknoloji artan kullanımı ile, plasenta ya yanlışlıkla maruz kalma yoluyla ya da kasten potansiyel nanomedical uygulamaları durumunda yeni nanopartiküller temas muhtemeldir. Plasenta en türe özgü memeli organı 1 çünkü Hayvan deneylerinden elde edilen veri insanlara tahmin edilemez. Bu nedenle, Panigel ve arkadaşları tarafından geliştirilen ex vivo çift devir daim insan plasental perfüzyon,. 1.967 2 ve sürekli Schneider ve arkadaşları tarafından modifiye. 1.972 3, mükemmel bir model t olarak hizmet verebilirksenobiyotiklerin veya parçacıkların transferi çalışma o.
Burada, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için insan plasental perfüzyon protokolü ve daha da geliştirilmesi sirkülasyon ex vivo çift odaklanmak.
Plasenta sezaryenle doğum komplikasyonsuz vadeli gebelik annelerin bilgilendirilmiş onam sonra elde edilmiştir. Sağlam bir Kotiledon fetal ve maternal gemiler en az beş saat için kanül ve perfüze edildi. Bir örnek olarak, 80 parçacık boyutları ve çapı 500 nm olan floresan etiketli polistiren partikülleri, maternal devresi eklenmiştir. 80 nm parçacıklar plasenta bariyerini geçtiği ve 500 nm partiküller plasental doku ya da anne devrede muhafaza ise fetusa plasenta üzerinden aktarılır bir madde için mükemmel bir örnek sağlamak mümkün. Ex vivo insan plasental perfüzyon modeli hakkında güvenilir bilgi veren birkaç model biridirakıllı ve klinik ilgili verileri sağlayan önemli bir doku engeli de ksenobiyotiklerin taşıma davranışı.
Introduction
Plasenta oksijen, karbon dioksit, besin ve atık ürünlerin ve anne ve birbirinden ayrılmış büyüyen cenin iki kan devrelerinde tutmak mümkün aynı zamanda değişimi için sorumlu olan karmaşık bir organdır. Buna ek olarak, bağışıklık sistemi tarafından anne çocuğun reddini önler ve gebelik korumak için hormon salgılayan. Hücresel bariyer 4,5 yanal hücre zarları olmayan bir gerçek syncytium eritmek ve formu sitotrofoblastta hücreler tarafından oluşturulmuştur. Tüm plasenta bir fetal villöz ağaç içeren ve plasentanın bir işlevsel birim temsil birkaç kotiledon, düzenleniyor.
Plasenta bariyerini fonksiyonunun çalışma 1960'lı yıllarda talidomid bağlı malformasyonların keşfi ile yoğunlaştı. Bilinen nedenlerden dolayı hamile kadınlar ile translokasyon çalışmaları gerçekleştirilemez. Sonuç olarak, çeşitli alternatif modeller 6,7 geliştirilmiştir 2,3 tarafından geliştirilen ex vivo insan plasental perfüzyon modelidir.
Birçok kadın bu gebelik 8 sırasında uyuşturucu veya çevresel kirleticiler gibi farklı ksenobiyotikler maruz kalmaktadır. Zaten hamilelik sırasında düzenli olarak uygulanmıştır bazı ilaçlar, in vivo çalışmalarda göbek kordonu kanı o ile anne kan konsantrasyonu karşılaştırılması ile gerçekleştirilebilir. Ancak, genel olarak fetus ve bu maddelerin teratojenik olarak farmakokinetik ve-dinamikleri hakkında sadece sınırlı bilgi vardır.
Eroin kolayca plasenta bariyerini geçtiği ve intrauterin gelişme geriliği, erken doğum ya da spontan abortus 9,10 yol açabilir gibi örneğin afyon. Yani, gebelik sırasında kayıp yoksunluk durumunda metadon ile replasman tedavisi önerilir. Eskiin vivo insan plasental perfüzyon modeli fetal dolaşıma metadon devri teslim 12 sonra hesaplanan kordon kanı-to-anne kan konsantrasyon oranı ile iyi korelasyon önemsiz 11 olduğunu ortaya çıkardı.
Nanoteknoloji, özellikle tıpta büyüyen bir alandır. Yani, doğal olarak ince meydana gelen (çapı <2.5 mikron) ve orman yangınları, volkan patlamalar duman ve çöl toz ultra ince parçacıklar (çapı <0.1 mikron), mühendislik nano maruz kalma (en az bir boyut <0,1 mikron 13 altında ) artmaktadır. Bu mühendislik Nanomalzemelerin toksikolojik potansiyeli hakkında sorular yöneltti. Hiçbir insan tehlike henüz ispat edilebilir olsa da, mühendislik nanopartiküller toksikolojik sonuçlarının 14 yol açan olumsuz biyolojik reaksiyona neden olduğunu gösteren temel deneysel çalışmalar da vardır. Son zamanlarda, bazı çalışmalarda bu prenatal maruz belirttihava kirliliği yenidoğan ve çocuk 15,16 daha yüksek solunum ihtiyaç ve hava yolu inflamasyonu ile bağlantılıdır. Buna ek olarak, küçük nano-tanecikleri, özellikle fetus ya da anne ya da tedavi etmek için ilaç taşıyıcılar olarak kullanılabilir. Bu nedenle, farklı ksenobiyotikler veya nano ve plasenta bariyerini geçtiği için yeteneklerini geniş çalışmalara ihtiyaç olduğu ortaya çıkmaktadır. Mühendislik Nanomalzemelere plasental geçirgenliği ile ilgili mevcut çalışmaların gerçek bir bakış Menezes ve ark özetlenmiştir. 2.011 17 ve Buerki-Thurnherr ve ark. 2.012 7.
Insan plasental perfüzyon modeli sirkülasyon ex vivo çift sorumlu mekanizmalar gibi çeşitli endojen ve eksojen bileşiklerin 3,11,12,18,19 ve plasental ulaşım ve plasentanın diğer işlevleri geniş bir yelpazede eğitim için kontrollü ve güvenilir bir sistem sağlar preeklampsi gibi patolojik durumları geliştirilmesi <> 20-22 sup. Birikimi, efektler ve ksenobiyotiklerin veya nanopartiküller geniş bir dizi translokasyon oranları çalışma izin Bu protokolü biz sette özellikle kadar odaklanmak, taşıma ve yöntemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Perfüzyon Sistemi hazırlanması
- Bir su banyosu, bir perfüzyon odası, oksijen için iki sütun, iki peristaltik pompa, iki kabarcık tuzakları, iki akış ısıtıcılar ve basınç sensörü (Şekil 1) oluşan perfüzyon sistemi kurun. Şekil 2'deki şemaya göre silikon, polivinil klorür maddelerden oluşan boru bölümleri ile bu bileşenlerin iletişime. Son olarak sırasıyla fetal ve maternal devre, temsil eden iki devre vardır.
- Su banyosu, akış ısıtıcılar ve perfüzyon odası için ısıtma açın. Sıcaklık 37 ° C olmalıdır
- (NCTC-135 doku kültürü ortamı Earle tamponu (6.8 g / L sodyum klorür, 0.4 g / l, potasyum klorür, 0.14 g / l monosodyum fosfat, 0.2 g / l magnezyum sülfat, 0.2 gram ile 1:02 seyreltilmiş Perfüzyon ortamı ısıtın / l kalsiyum klorür, 2 g / L glikoz), glukoz (1 g / l), dekstran 40 (10 g / L), sığır serum albümini (10 gr ile desteklenmiş/ L), sodyum heparin (2500 IU / L), ameksisilin (250 mg / L) ve sodyum bikarbonat (2.2 g / L), su banyosu içinde pH 7.4).
- - 20 ml 15: arka arkaya tekrar 200 ml distile su (akış oranı: a) 200 ml distile su ile, fetal ve maternal devresinin arteriyel sistemleri, B) 50 ml% 1 sodyum hidroksit, c)% 1 lik fosforik asit ve d) durulama / dak.)
- Fetal kanül bağlayın (Ø 1.2 mm; künt bir iğne değiştirilmiş bir kanatlı iğne infüzyon seti eklenmelidir) fetal arter boru için.
- Tüm tüpleri orta (: 15-20 ml / dk akış hızı) içeren kadar perfüzyon ortamı ile fetal ve maternal devrenin arteriyel sistemleri durulayın. Bu adım sırasında kabarcık tuzakları doldurmak ve tuzak tüm kabarcıklar aşağı kaldırın. Daha sonra pompa durdurun. Bu afferent arter tüpleri her zaman kabarcıkları serbest gerçekten önemlidir, aksi halde kanülasyon sonra özellikle ince fetal damarların yırtılması olabilir.
- Gaz akışını açın. Anne devre wi oksijenliTh% 5 karbon dioksit ve% 5 karbon dioksit ve% 95 nitrojen ile% 95 sentetik hava ve fetal devresi.
- Basınç sensörünün kayda başlayın.
2. Plasenta cannulating
- Primer sezaryen sonra komplikasyonsuz vadeli gebelik sağlam plasenta alın. Yazılı izni doğumdan önce anne tarafından (bizim çalışma durumunda elde edilmiştir) verilmelidir ve çalışma (bizim çalışmalarda olduğu) yerel etik kurul tarafından onaylanmış olması gerekir. İlk görsel kontrol, sağlıklı ve sağlam plasenta sağlamak için ebe tarafından yapılmalıdır.
- Plasentanın kanülasyon önemli bir adımdır! Perfüzyon sırasında dokuda her küçük bozulma maternal ve fetal dolaşım arasında bir sızıntı yol açabilir. Plasenta doğumdan sonra 30 dakika içinde alınması gerekir.
- Anne tarafında görünür kesintileri olmadan plasentanın marjinal zon bir sağlam kotiledon seçin. Koryonik plaka,umbilikal arter ve cerrahi dikiş malzemesi kullanarak daha sonra kanülasyon tarafı (göbek kordonu doğru) için yukarı ven hem ilgili şube kravat. Her zaman iki knot olun.
- İlk fetal arter cannulate. Fetal plasental arter her zaman damarlar daha küçük ve incedir.
- Fetal arter etrafında bir dikiş yapmak, ama hemen kravat yok. Bir forseps ile gemi tutun, dikkatle gemi kesip arter küçük kanül (Ø 1.2 mm) koymak. Daha sonra dikiş (iki knot) bağlayacağım.
- Aynı şekilde fetal damar devam ama daha büyük bir kanül kullanımı (Ø 1.5-1.8 mm; künt bir iğne değiştirilmiş bir kanatlı iğne infüzyon seti eklenmelidir).
- Fetal pompası (2 ml / dak) açın. Hiçbir görünür sızıntı ve kan fetal ven kanül dışına yayılan ise, yavaş yavaş 4 ml / dk 'ya kadar akışını artırmak. Fetal arter içindeki basınç dikkat edin, bu 70 mmHg geçmemelidir. Fetal veya arkadaşı da sıvı sızıntıları dışarı eğerCihaz Dışı kanül başka bir dikiş ile bunları düzeltmek.
- Fetal yüzü doku tutucu üzerindeki plasenta kadar yerleştirin ve sivri üzerinde plasental membran ve doku çekin. Sonunda perfüze kotiledon doku tutucu delik ortasında olmalıdır.
- Yalnızca membran, bir silikon membran (o, 1 mm) ya da alternatif olarak iki Parafilm adet plasenta tutan parçası stabilize.
- Tam doku tutucu monte, vidaları sıkın ve sarkan doku kesti. Venöz ve arteriyel kanül sıkışmak unutmayınız ancak bunun yerine doku tutucu küçük kanallar yatıyordu lütfen.
- , Ters doku tutucu çevirin perfüzyon odasına koydu ve kapağı ekleyin. Şimdi, anne tarafı üstünde olmalıdır. Fetal devre hala bozulmamış ve orta fetal ven boru akan olup olmadığını her zaman kontrol edin.
- Maternal pompası (12 ml / dak) açın. Inci de üç künt kanüller (Ø 0.8 mm) tanıtmakdesidual plaka nüfuz ederek intervillöz uzaya anne arter tüp e sonu. Maternal devresine perfüzat geri dönmek için de perfüzyon odasının üst kısmında en alt konuma anne pompa ile bağlantılı olan venöz drenaj olarak bir tüp koydu.
- Fetal ven tüp fetal ven kanül bağlayın.
3. Perfüzyon ve öncesi ve Deneysel Faz yürütme
- Doku doğum sonrası iskemik dönemden kurtarmak için ve intervillöz uzayda kan dışarı atılması için izin vermek için, 20 dakika öncesi faz açık gereklidir. Maternal ve fetal damar anlamına gelir perfüzyon orta içeren arteriyel rezervuar geri lider değildir. Bir şişe fetal ve maternal venöz çıkış toplamak ve öncesi aşamasından sonra atın.
- Perfüzyonunun bütünlüğü değerlendirmek için, 20 dakikalık bir ön-fazlı gerçekleştirmek için değil, bir kapalı devre içinde. Perfüzyon ortamı ile iki ayrı rezervuar kullanınfetal ve maternal devre için ve fetal rezervuar ve anne haznesindeki anne venöz çıkış geri geri fetal venöz çıkışı önde gelen devreleri kapatın.
- Ana perfüzyon deneme için 120 ml perfüzyon orta (anne için bir ve fetal rezervuar için) ile iki şişeler hazırlamak. Ve bir anne rezervuar için analiz etmek istediği floresan işaretli ksenobiyotik veya nano-tanecikleri: (radyoaktif bir madde,, pozitif bir kontrol olarak hizmet DİKKAT 4 nCi / ml), radyo-etiketli 14C-antipirin ekleyin. Iyi anne perfüzat karıştırın.
- İki hazırlanan şişeler (fetal ve maternal rezervuar) ile saf perfüzyon orta alışverişinde deney başlayın. Fetal haznesindeki fetal venöz çıkış geri ve anne haznesindeki anne venöz çıkış geri önde gelen devreleri kapatın.
- 6 saat perfüzyon devam edin ve düzenli olarak numune almak. Her zaman fetal ve maternal olarak orta tekrar süspansiyonçekilme önce rezervuar.
- Perfüzyon sırasında fetal arter (70 mmHg geçmemelidir), her iki devrede pH (fizyolojik bir aralık 7.2-7.4 olmalıdır) ve rezervuar hem hacmi (fetal hacim kaybı 4 ml / saat geçmemelidir) içinde basınç kontrol . Eğer gerekli ise, hidroklorik asit ya da sodyum hidroksit kullanarak, pH değerini ayarlamak.
- Fetal rezervuar hacim kaybı 4 aşarsa ml / saat orada dokuda bir kaçak ve bir perfüzyon durdurmak zorundadır. Sızıntı olmadan 6 saat bir perfüzyon başarı oranı yaklaşık% 15-20 olduğunu.
- 6 saat sonra perfüzyon durdurun. Pompalar, su banyosu, akış ısıtıcıları ve gaz akışını açın.
- Doku tutucu gelen plasenta kaldırmak, perfüze kotiledon kesme (unperfused doku daha parlak) ve tartın.
- Unperfused (başlangıçta kesildi plasenta parçası, daha önce ön aşamasında alınabilir) numune almak ve perfüze doku (her biri yaklaşık 1 g) eklendi ve -20 ° C'de saklayınhomojenizasyon kadar ya da daha sonraki analizler için likit nitrojende. Histopatolojik değerlendirme için formalin% 4 başka bir doku örneği Fix. Numuneler, plasentanın tüm katmanları içermelidir.
- ) Art arda: a) 200 ml distile su ile b fetal ve maternal devresinin arteriyel sistemleri durulama ile 50 ml% 1 sodyum hidroksit, C) tekrar 50 ml% 1 lik fosforik asit ve d) 200 ml distile su perfüzyon sonra tüpler temizlemek (akış: 15-20 ml / dak).
Plasenta perfüzyon deneyinin tüm çalışma prosedürü, Şekil 3'te gösterilmiştir.
4. Örnekler analiz
- Kalıntı eritrositler çıkarmak için analiz edilmeden önce 800 x g 'de 10 dakika boyunca Perfüzat örnekleri santrifüj. Daha fazla analiz için supernatant al. Numuneler 4 ° C'de bir gece boyunca bırakılabilir Leptin ve hCG üretiminin analizi için numuneler, -20 ° C'de saklanabilir
- En geçirgenliği değerlendirmekplasenta sıvı sintilasyon tarafından C-antipirin 14 analiz. Bir beta sayacı içerisinde 5 dakika boyunca 3 ml sintilasyon kokteyli ve ölçü ile fetal ve maternal numunelerin 300 ul karıştırın.
- Floresan nanopartiküllerin transferi ya da ilgi duyulan ksenobiyotik bir mikroplaka okuyucu (belirtilen dalga boylarında biz nanopartiküller için kullanılan sarı yeşil bir etiket analizi için olan) 485 nm'de uyarma ve 528 nm'de emisyonla flüoresans okunur değerlendirmek.
- Perfüzyon ölçümü sırasında plasenta dokusu glukoz tüketimi ve otomatik bir kan gazı sistemi ile fetal ve maternal devrede laktat üretim canlılığı belirlemek için. Ayrıca, plasenta hormonları insan choriongonadotropin (hCG) ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ile homojenize doku örnekleri ve guruplarına leptin üretimini değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4A, fetal bölmesine transfer değildi büyük polistiren partikülleri (500 nm) ile karşılaştırıldığında plasenta boyunca taşınan küçük polistiren tanecikler (80 mil) arasında, perfüzyon profillerini göstermektedir. Her veri noktası, en az 3 bağımsız deney için belirli bir zaman noktasında ortalama parçacık konsantrasyonunu temsil eder. Polistiren için plasental aktarım boyutu bağlı 19 olan nanopartiküller. 500 nm polistiren partikülleri bile perfüzyon 6 saat sonrasında fetal devresinde görünen değil iken plasenta perfüzyon, 3 saat sonra, daha önce başlangıçta eklenen 80 nm polistiren taneciklerin% 20-30, fetal devresine anne aktarıldı. Bununla birlikte, 500 nm partiküller arasında maternal konsantrasyonu azalmaktadır. Perfüzyon sonra dokuların histolojik bölümündeki Flüoresans görüntüler, bu parçacıklar, plasenta (veriler gösterilmemiştir) arasında villuslarda birikir gösterdi. Şekil 4B radyo-14C-antipirin karakteristik bir perfüzyon profili göstermektedir. Küçük lipofilik molekül olarak antipirin pasif difüzyon ile plasenta bariyerini üzerinden dağıtılan ve devrelerin bütünlüğü için kontrol olarak hizmet vermektedir. Perfüzyon 4-6 saat sonra fetal ve maternal antipirin konsantrasyonu arasında bir denge 23 inşa edilmelidir. Fetal-to-anne ilaç konsantrasyonu (F / M) oranı genellikle (Şekil 5) görüntülenir ksenobiyotiklerin plasental taşıma hızı değerlendirmek ve karşılaştırmak.
Laktat ve plasental hormonu (insan choriongonadotropin ve leptin) üretiminin yanı sıra glukoz tüketimi analizi sayesinde perfüzyon sırasında plasenta dokusu yaşayabilirliği ve işlevselliği (Şekil 6) takip edilebilir. Ksenobiyotik ile perfüzyonları değerleri daima kontrol perfüzyon ksenobiyotik olmadan değerleri aynı aralığında olmalıdır. Buna ek olarak, histop perfüze plasental doku athological değerlendirme yapılabilir. Olmayan perfüze plasental doku ile bir karşılaştırma sonra perfüzyon (örneğin bakteriyel kontaminasyon) nedeniyle patolojik değişiklikler ortaya koyabilir ve bu nedenle başka bir kalite kontrol parametresi olarak hizmet verebilir.
Ex vivo çift devir daim insan plasental perfüzyon modeli ile elde edilen bir temsilci sonuçları son zamanlarda 11,19 yayınlandı.
Şekil 1. Ex vivo insan plasental perfüzyon set-up. 1) Su maternal ve fetal depoları ile banyo, 2) perfüzyon odası, 3) kabarcık tuzak, 4) oksijenatör sütun, ve 5) akış ısıtıcı.
load/50401/50401fig2.jpg "/>
Şekil 2. Ex vivo insan plasental perfüzyon modelinin şematik gösterimi FA: fetal arter; FV:. Fetal ven; MA: anne arter; PD: anne ven; BT: kabarcık tuzak; Not: basınç sensörü
Şekil 3,. Bir ex vivo insan plasental perfüzyon deneyi Çalışma prosedürü. Doğumdan sonra, plasenta 30 dakika içinde kanül zorundadır. Devridaim ile 6 saat önce deney aşamasında bir açık ön aşaması ve kapalı ön faz, en az 20 dk için gerçekleştirilmelidir.
Şekil 4. Polistiren parçacıklar ve 14 Perfüzyon profilleri </> C-19 antipirin sup. Perfüzyon boyutlarda polistiren taneciklerin profili 80 nm (s = 4) ve 500 nm (s = 3). İlk olarak 25 ug / ml parçacıklar ve 4.2 nCi / ml, 14 C-antipirin anne devresi eklenmiştir. Parçacıkların miktarı (A) ve 14 C-antipirin (B) belirtilen zaman geçtikten sonra (F, açık semboller) anne (m, katı semboller) ve fetal devrelerde ölçüldü. Ortalama konsantrasyon olduğunu görüntülenir ± SE. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. Insan plasenta 19 arasında polistiren parçacıkların büyüklüğü bağımlı transferi. 14 C-antipirin ve polistiren parçacıkların fetal ve maternal konsantrasyonları arasındaki oranlar kalk vardıplasenta perfüzyon 180 dakika sonra ulated. Veri ortalama ± SE en az 3 bağımsız deneyler temsil eder. Kontrol sütun partikül içermeyen ama 14 C-antipirin ile perfüzyonları gösteriyor. (* P 80 nm oranı değeri ile karşılaştırılır <0.05).
6 Şekil. Perfüzyon 19 sırasında plasenta dokusunun canlılığı. (A) Glikoz tüketimi ve perfüze plasentada laktat üretimi. Görüntülenen perfüze kotiledon ağırlığı bölünmesiyle zamanla devrelerinde toplam içeriğinde değişiklikler (fetal ve maternal) toplamıdır. (B) plasenta hormonları normalize net üretim (NP ilk doku içeriği T0 bölü) insan choriongonadotropin ve leptin. Veri ortalama ± SE l temsildoğu 3 bağımsız deneyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çift sirkülasyon perfüzyon burada gösterdi altında, cevaplanması gereken soru bağlı olarak mümkün birçok deneysel yapılandırmaları vardır. Özellikle açık plasental perfüzyonları yaygın kararlı durum konsantrasyonu 3 de ilaç boşluk değerlendirmek için kullanılır. Çevrimli perfüzyon kurulum endojen veya eksojen maddelerin aktif nakil teyit etmek için uygulanabilir. Bu yaklaşım için ksenobiyotik ile aynı konsantrasyonu anne ve fetal dolaşıma eklenmelidir. Konsantrasyon değişim ölçüsüne karşı aktif nakil olduğu varsayılır, devreleri biri ya da test maddesinin birikimi 24 görülebilir. Önemli olan, bir tek fetal devresine test maddesinin ilave edilmesi de mümkündür ve bu belirli madde 25 plasental bariyeri üzerinden taşıma mekanizmasını ortaya çıkarabilir.
Protokol tim içinde geliştie ve özellikle de akış hızı, perfüzyon ortamının bileşimi, oksijenasyon şeklinde ısıtma ve 26,27 ile ilgili farklı araştırma grupları arasında değişebilir. Özellikle akış hızı tranplasental transferi meydana geldiği zaman etkileyebilir. Bu kontrol etmek için, antipirin gibi bir pasif taşınan referans bileşiği ve buna ek olarak önemlidir. Ksenobiyotik devri oranı her zaman antipirin (F / M oranı 0.75 üzerinde olmalıdır) 26 aktarım hızı ile karşılaştırılabilir. Antipirin transferi özellikle akışı ve alışveriş yüzeyi ile sınırlı olduğundan, bu karşılaştırma akışında farklar ve deneyler arasında değişebilir dikkate perfüze kotiledon büyüklüğü alır. Buna ek olarak, FITC-dekstran bariyer 26 bütünlüğü için kontrol olarak hizmet etmek için fetus devreye ilave edilebilir. Fetal hacim kaybı de bariyer bütünlüğünü için bir belirteç olarak kullanılır. Genellikle fetal sıvı ml / saat 28 izin en fazla 4 kayıp, ancakyeniden bir genel kabul görmüş sınırıdır.
Açıkçası, bireyler arası varyasyon ve düşük bir başarı oranı (% 15-20) gibi ex vivo insan plasental perfüzyon yöntemin bazı dezavantajları da vardır. Ayrıca, 6 saat bir perfüzyon süre kronik ilaç tedavisi taklit edemez ve bu nedenle tamamen uzun süreli maruz kaldıktan sonra bir ksenobiyotik devri gözardı edilemez. Modelin bir diğer sınırlama bariyer kalındır erken gebelik yaşlarda taşıma hızı hala bilinmemektedir iken vadede özellikle transplasental transferi değerlendirilir olmasıdır. Gerçekten de, ilk trimester plasenta perfüzyon mümkündür ancak bu plasenta durumu oldukça sınırlıdır. Bununla birlikte, bugüne kadar ex vivo plasental perfüzyon yöntemi örgütlü insan plasenta dokusunda çeşitli ksenobiyotiklerin veya nanopartiküller taşınması incelemek için tek modeldir. Ex vivo insan perfüzyon modelinde toxicodynamics sadece pl analiz edilebilir iseacental doku, hayvan deneyleri gerçekten de embriyotoksisite hakkında bilgi verebilir. Olsa da, çünkü insanlar ve kemirgenler arasında plasenta bariyerini anatomik farklılıklar bu sonuçları 4,5 insanlara tahmin edilemez. Transplasental transferi araştırmak için başka bir olasılık birincil sitotrofoblastlardan, koriokarsinom hücre hatları, izole plazma membran veziküller veya plasental doku eksplant 29 gibi hücre kültür modelleri olabilir. Bu hücrelerin malign gebelik koryokarsinom türetilen ve geçirgen bir zar üzerinde konfluent tek tabaka oluşturur, bu nedenle taşıma çalışmaları yapılabilir, en çok kullanılan model BEWO hücre hattıdır. BEWO hücre modeli kullanılarak taşıma çalışmalarının sonuçları ex vivo insan plasental perfüzyon 30 elde edilen sonuçlar ile iyi bir korelasyon. Ancak, ilaç ulaşım (özel bir taşıyıcı protein örneğin katkısı) ve metabolizma ayrıntılarını incelemek için, BEWO hücre modeli m olabilirmümkün cevheri öncelikle ele almak daha kolay ve genetiği değiştirilmiş taşıyıcılar veya enzimlerin ifade gibi manipülasyon duyarlı, ama genel ilaç transfer çalışmaları ile ilgili olarak bu modelin güvenilirliği sınırlı olduğu için. Bu kan akımı yoksun ve tek tabaka bütünlüğünü 6,29 ekleme yoğunluğu, maruziyet süresi ve membran tohum, hücre kültürü koşulları gibi birçok faktöre bağlıdır beri dikkatle değerlendirilmelidir.
Farklı ksenobiyotik ve aynı zamanda önemli ölçüde tranplasental Transfer 31 etkileyebilecek çeşitli plazma proteinlerine bağlama nanopartiküller, plazma proteinlerine bağlanma göz önüne alındığında bu nedenle önemlidir. Perfüzyon ortamı sığır serumu albümini, en sık plazma protein içerir. Son zamanlarda, bir çalışma ex vivo insan plasental perfüzyon modeli ile elde edilen çeşitli maddelerin transferi oranları anne in vivo kordon kanında ile iyi bir korelasyon olduğunu gösterditransfer oranları plazma proteinlerine bağlanma 12 ölçüde göre ayarlandı kan yoğunlaşma oranları.
Genel olarak, ex vivo plasental perfüzyon modeli insan plasenta arasında ulaşım çalışma ve ksenobiyotikler ve nanopartiküller in vivo transplasental pasajda tahmin etmek için geçerli ve güvenilir bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma mali İsviçre Ulusal Vakfı, (NRP 64 programı hiçbir 4.064-131.232 vermek) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
| Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
| Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
| Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
| Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPMENT | |||
| Water bath | VWR | 462-7001 | |
| Thermostat | IKA-Werke GmbH Co. KG | 3164000 | |
| Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
| Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Blunt cannulae ( 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Blunt cannulae ( 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Blunt cannulae ( 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Blunt cannulae ( 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
| Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH meter + electrode | VWR | 662-2779 | |
References
- Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
- Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
- Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
- Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
- Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
- Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
- Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
- Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers' requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
- Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
- von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
- Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
- Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. , (2008).
- Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
- Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
- Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
- Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
- Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
- Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
- Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
- May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
- Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
- Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
- Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
- leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
- athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
- Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
- Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
- Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
- Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
- Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).
