Summary
Kızılötesi sinir stimülasyonu işitme sistemi ile ilgili olanlar dahil olmak üzere, sinir tipleri, bir dizi elektrik stimülasyonu için bir alternatif olarak önerilmiştir. Bu protokol, birincil işitsel nöronların bir kültür içinde kızılötesi sinir stimülasyonu mekanizmasını incelemek için bir yama kelepçe yöntem açıklanır.
Abstract
Bu darbeli, kızılötesi lazer ışık hedef doku arasında herhangi bir başka değişiklik bağımsız olarak, sinir dokusu elektrik yanıtları ortaya çıkarmak için kullanılabilir, son yıllarda gösterilmiştir. Kızılötesi sinir uyarımı işitsel sinir nöronların uyarılması gösterilen özel bir ilgi ile, in vivo periferik ve duyusal sinir dokusu çeşitli rapor edilmiştir. INS bu ayarları çalışmak gösterilmiştir Ancak,, kızılötesi ışık sinir uyarım neden olan mekanizma (veya mekanizmaları) şu anda iyi anlaşılmış değildir. Burada sunulan protokol kültürlenmiş birincil işitsel nöronlar içinde kızılötesi sinir stimülasyonu soruşturma kolaylaştırmak için tasarlanmış bir bütün hücre yama kelepçe yöntem açıklanır. İyice kontrollü şartlar altında in vitro kızılötesi lazer aydınlatma için bu hücrelerinin yanıtı ile karakterize, bu temel Physica geliştirilmiş bir anlaşılmasını sağlamak için mümkün olabilirl ve biyokimyasal süreçleri kızılötesi sinir stimülasyonu altında yatan.
Introduction
Nörofizyoloji ve tıbbi biyonik alanlarında nöral dokuda elektrik tepkilerin kontrol uyarılması izin teknikleri temeline dayanmaktadır. Elektrik stimülasyonu sinir uyarım olarak altın standart olmaya devam ederken sinir yanıtları, ve doku 1 çevredeki içine akım yayılmasını nedeniyle stimülasyon özgüllük eksikliği kaydederken, bu tür stimülasyon eserler varlığı gibi sakıncaları bir dizi çekiyor.
Son yirmi yılda optik aracılı stimülasyon teknikleri 2 gelişimi gördük. Bu tekniklerin bazıları ya da belirli bir molekülün eklenmesi (kafesli moleküller) 3 ya da bir araştırma ayarı dışında uygulamak kolaydır ikisi de genetik manipülasyon çeşit (örneğin optogenetik, 4) vasıtasıyla, hedef doku değişiklik gerektirir. Özellikle ilgi çekici bu nedenle kızılötesi sinir stimülasyonu (INS), whereb olduğuy sinir doku darbeli kızılötesi lazer ışık heyecanlı. INS sinir doku 2 çok özel, temassız stimülasyon sağlayarak elektrik stimülasyonu eksikliklerin birçok üstesinden gelmek için potansiyeline sahiptir. INS başarılı in vivo ayarları çeşitli gösterilmiştir Ancak,, uyarma mekanizması tam olarak bilinmese kalır.
Bazı yeni yayınlar 5-7 INS arkasındaki mekanizma ortaya çıkarılması doğru ilerleme göstermiştir. Su ile lazer ışığının emilimi nedeniyle hızlı ısıtma önemli bir rol oynar. Ancak, bunun ötesinde bir fikir birliği henüz ulaşmış olmaktır. Shapiro ve ark. 7 hızlı bir ısıtma ve daha sonra hücre zarı depolarizasyon kapasitans bir değişime yol açan, hücre zarı bitişik yüklü parçacıklar dağılımı içinde bir karışıklık sebep olur, son derece genel mekanizma önerilmiştir. Buna ek olarak, Albert ve arkadaşları. 5 olduğu iddia LASEr kaynaklı ısıtma iyonlarının hücre zarından geçmesine izin, ısıya duyarlı iyon kanalları (geçici reseptör potansiyeli vanilloid kanal), belirli bir sınıf aktive eder. Bu aşamada tespit edilmesi henüz daha faktörler olup olmadığını gerçekten bu mekanizmaların bir araya nasıl belirsiz, ya da.
Bir yayın az sayıda (referans 5,7-9), in vitro incelenmiştir INS olmasına rağmen, bu alanda yayınlanan çalışma bölgesinin büyük bir kısmı (örneğin, referans 1,6,10-18) in vivo olarak gerçekleştirilmiştir. Işitsel sinirlerin Kızılötesi uyarılması koklear implant 10,14-18 içinde potansiyel uygulamaları nedeniyle özel bir ilgi alanı olmuştur. In vivo deneyler, çeşitli ortamlarda teknik, in vitro çalışmalar tarafından sağlanan kontrol artan seviyesi Mech daha detaylı bir anlayış yol açması beklenmektedir etkililiğini doğrulamak için önemli olmakla birlikte,INS sorumlu olarak tarif etmişler. Bu rapor ayrıca, işitsel sistemin mevcut verilerin büyük gövdesine bağlantı sırasında temel mekanizmaları incelemek için kullanılabilir olarak, yama kelepçe araştırmalar için kültürlenmiş spiral ganglion nöronlarının hazırlanmasını tarif etmektedir.
Yama kelepçe tekniği tek hücrelerinde elektriksel aktivite kayıt aracı sağlayan ve bireysel temel akımları 19 katkısı eğitim, elektrofizyolojik olayların araştırmalar için mükemmel bir araçtır. Bu teknik, kültür spiral ganglion nöronları gibi birincil nöronların, in vitro hazırlanmasında istikrarlı uygulandığında, bu derinlik sinirsel aktivite kontrol ve manipüle edildiği mekanizmaları eğitim için bir fırsat sunuyor.
Yama kelepçe ile spiral ganglion nöronları elektriksel özellikleri üzerine lazer stimülasyon etkisini araştırmak için bu çalışma taslak yöntemleri belirtilen protokollerikayıtları. Yaklaşım standart mikroskop konfigürasyonu değiştirmek için gerek kalmadan güvenli operasyon gibi kolay ve tekrarlanabilir uyum sağlayan, daha çok bir boş-alan lazer daha fiber çiftli lazer dayanmaktadır. Bu protokollerin dayanarak, daha açık bir şekilde INS arkasında mekanizmasında veya mekanizmalarında belirlemek için deneyler geniş bir yapmak mümkün olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Spiral ganglion nöronlar Kültür
- Bir otoklav küçük turu (örneğin 10 mm çapında) cam lamelleri ve kavisli bir forseps sterilize edin. Steril forseps kullanılarak steril 4 halka 35 mm petri ya da 4-plaka ayrı kuyu içine sterilize lamelleri aktarın. En fazla 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde lamel yeri ve üst yüzeyi (37 ° C) ile poli-L-ornitin (500 mg / ml) ve fare laminin (0.01 mg / ml) 150 ul uygulanır. Lamelleri kuyunun dibinde uzak yüzer yok emin olun.
- 47.5 ml Neurobasal A, 0.5 ml 2 N takviyesi, 1 mi B27 takviyesi, 0.5 ml L-glutamin, ve 0.5 ml penisilin-streptomisin: Her sinir kültürü için 50 ml steril Neurobasal ortamı (NBM) hazırlayın. Not: Ek dondurulabilir, -20 ° C'de depolanır ve gerektiğinde günde ortam ilave edildi.
- Daha önce 20,21 açıklandığı gibi doğum sonrası günlük 4-7 sıçan yavrular spiral ganglion nöronları ayırmak, bizeenzimatik (tripsin% 0.025 ve% 0.001 DNase I) 'in ve mekanik teknikler de ing. Whitlon ve ark. 22 ve Vieira et al. 23 bakınız modiolus izolasyon bir gösteri için spiral ganglion nöron kültürü, ya da Parker ve ark. 24 ayrıntılı yordamlar için.
- Lamelleri kalan tüm poly-L-ornithine/laminin çözüm aspire ve NBM ile kısa bir süre yıkayın.
- Bir kuluçka (37 ° C,% 10 CO 2) içine lamelleri ve yere ayrışmış spiral ganglion nöron süspansiyon 150-200 ul ekleyin. Not: 20 kadar lamelleri 8 sıçan yavruları bir defada doğurulan ortalama yavru yola çıkılarak kolayca hazırlanabilir.
- Dört saat kaplama nöronlar sonra, hücre enkaz kaldırmak ve 150-200 ul ısıtılmış taze NBM ile değiştirin çözüm aspire. Not: Medya dehidratasyonu önlemek için günlük ikmal gerektirebilir.
- Elektrofizyolojik kayıtlar için gerekli kadar inkübatör lamelleri dönün. Not: ayrışmış spiralGanglion nöron kültürleri dört saat sonra ve daha sonra çözülme fazla iki gün için elektrofizyolojik deneyler için kullanılabilir. In vitro zaman sonuçlarının analizi sırasında dikkate alınmalıdır. Her 24-48 saat NBM yenileyin.
2. Patch Kelepçe Kayıtlar Hazırlık
- Çözümler hazırlayın
- Hücre içi (mikropipet) çözeltisi: 115 mM K-glukonat, 7 mM KCI, 10 mM HEPES, 0.05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, MgATP 2 mM, 0.5 mM Na 2 GTP (KOH ile pH 7.3 'e ayarlanır; 295 ayarlamak sukroz ile mOsmol / kg) verildi. Steril bir filtre (0.2 um) aracılığıyla çözüm geçmek ve kayıt güne kadar -20 ° C'de depolanmak üzere 200 ul hacimde ayrılır.
- Hücre dışı (banyo) çözeltisi: 137 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glükoz (NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın, sukroz ile 300-310 mOsmol / kg' a ayarlayın) . Bu çözüm, kaydın gün yapılır.
- MQ 2-6 bir direnç ile kayıt mikropipetler hazırlayın. Ve borosilikat cam (1.0 mm dış çapı 0.58 mm iç çapı; 75 mm uzunluk), biz bir CO2 lazer çektirmesi (Sutter Aletleri P-2000) kullanın.
- Lazer hazırlayın. Bu protokol, OPTOTECH P / L, bu tür 1.870 nm Kızılötesi sinir uyarıcısı olarak bir fiber çiftli lazer ile kullanım için tasarlanmıştır Deneylerde ışık teslimat için kullanılan fiber optik iki ucunda bir sayısal 0.22 diyafram ve FC-PC konektörler ile 200/220 mikron çekirdek / kaplama çapı silika elyaftır (AFW Teknolojileri MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Patch kablo iki fiber pigtail (yani bir ucunda Konnektörlü ve diğer de bölünmüş) üretmek için ikiye kesilmiştir. Lif çekirdek çapı ve lazer kaynaklı ısı değişiklikleri sayısal açıklık etkileri Thompson ve arkadaşları tarafından ayrıntılı olarak ele alınmıştır. 25
- Bölünme, standart teknikler kullanılarak, ışık dağıtım lif ucuve elde edilen ucu bir optik mikroskop (yani ucu lif eksenine dik olması ve görsel denetim üzerine düz görünmelidir) ile gözlem ile yüksek kalitede olduğundan emin olun. Bağlayıcı (örneğin Thorlabs ADAFC2) aracılığıyla uygun bir uyarım kullanılarak lazer elyaf çiftli çıkışına ışık dağıtım lif bağlayın.
- Uygun bir alet (LM-3 dedektör kafası ile örneğin Tutarlı FieldMate) kullanarak ışığı teslim lif bölünmüş ucundan çıkış lazer gücünü ölçün. Bu lazer güç ışığı teslim lif bölünmüş ya da önemli bir ayar (örneğin bir laboratuvar diğerine ulaşım) lazer yapılır her zaman kontrol edilmesi önerilir.
- Bir fiber ayna veya eşdeğer cihaz ve yapıştırın uygun micropositioner için ayna ışık teslim lif yerleştirin. Bu doğru fiber optik lamel ile yaptığı açı θ tespit edebilmek için önemlidir. Bu anglE deneysel düzenlemenin bir fotoğraf çekme ve açısını elde etmek için görüntü işleme yazılımı (örneğin İmageJ) kullanılarak ölçülebilir. Özellikle mikroskopta - açısı θ (veya olası açıları aralığı) öncelikle deneysel düzenleme mekansal sınırlamaları ile sınırlıdır. Bizim deneylerde θ tipik değerleri (dik bir mikroskop dayalı) 36 ° civarında, ancak en iyi açısı (ters bir mikroskop kullanarak bu gibi) alternatif kurulumları için önemli ölçüde farklılık gösterebilir.
- Lazer ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, yama kelepçe veri toplama sistemi (örneğin Digidata 1440A, Molecular Devices) ile bağlantı kurarlar. Yama kelepçe veri toplama sisteminden dijital çıkış mümkün veri toplama sisteminden bağımsız lazer darbe parametreleri belirlemek için yapım, harici bir fonksiyon jeneratörü ile lazer bağlanmalıdır. Alternatif olarak bu çıkış doğrudan bağlanabilirlazer sürücüsü (darbe uzunluğu ve tekrarlama oranı veri toplama yazılımı tarafından ayarlanacak gerektiren). Her iki durumda da, lazer tetiklemek için kullanılan sinyal lazer darbelerinin zamanlaması ve süresi elektrofizyolojik sinyali ile eş zamanlı olarak kaydedilebilir sağlamak için bilgi elde etme sisteminde bir girişine geri bağlanmış olması gerekir.
3. INS incelenmesi için yama Kelepçe Kayıtlar
- Hücre-dışı çözelti ile perfüzyon sistemi uygun bir kap doldurun ve 1-2 ml / dakika arasında bir oranda banyosunun perfüzyon sağlamak için akış hızını ayarlamak. Bu çözeltinin hızlı ısıtma ve emme tarafından harcanan çıkarmak için çözelti bir peristaltik pompa sağlamak için bir in-line bir ısıtıcı ile yerçekimi beslemeli sistemi (aspiratör şişesi, sıkıştırma valfi ve PE tüp) kullanın.
- Dik bir mikroskop kayıt odasına (banyo) içine kültürlenmiş hücreler ile bir lamel yerleştirin. Bir yüksek büyütme su daldırma hedefi (E kullanarak40X. G.) Ve faz-kontrast (örneğin diferansiyel girişim kontrast veya Dodt degrade kontrast), görsel kültürü içinde spiral ganglion nöronları bulun. Şekil 1a gösterildiği gibi tipik bir spiral ganglion nöron, önemli bir çekirdek ile çapı faz-parlak, yuvarlak ve yaklaşık 15 mikron.
- Bir nöron bulunan sonra, daha düşük bir büyütme hedefi (örneğin 10X) geçmek ve görme alanı içinde hedef nöron bulun.
- Aşağıdaki yordamı (veya eşdeğeri) kullanarak yerine ışık teslim fiber optik hareket:
- Ucu, yatay ve dikey düzlemde hem de hedef nöron yakın kadar çıkış elyaf hareket ettirmek için micropositioner kullanın. Lif ucunun dikey konumunu nesnel yukarı ve aşağı hareket (odak tarama) tarafından doğrulanabilir.
- Yüksek büyütme hedefi geri dönmek ve t yanındaki istediğiniz konumda fiber optik ucu pozisyono nöron (Şekil 2 ilave bakınız). Fiberin dikey pozisyonunun ayarlanması, bu fiber alt kenarı fiberin konumda belirsizlik en aza indirmek için, lamel (yani sadece dokunarak) üzerine oturtulmuş olması önemlidir. Yatay düzlemde en iyi şekilde sıraya elyaf lamel ve lif r yarıçapı ile yaptığı θ açısına bağlıdır. Hedef nöronun merkezi lif ekseni boyunca uzanır, böylece lif konumlandırmak için, fiberin üst kenarı ile hedef hücre arasındaki yatay mesafe olmalıdır
Δ target = r (Cosec θ - 2 sin θ),
negatif değerler işaret eder nerede fiber optik çıkıntılar hücre. Fiber hizalama olduğunda, elyaf üst kenarı ve nöronun arasındaki Δ hedef bir mesafe yaklaşık görsel muayene ile elde edilebilir. Ancak Δ hedef için tasarlanmıştırsadece kaba bir kılavuz olarak hizmet vermektedir. Fiberin üst kenarı ve nöron merkezi arasındaki gerçek mesafe Δ Δ hedef (Şekil 1'de gibi) ölçülebilir farklı şekilde lif Konumlandırma ortasından her iki radyal yer değiştirme (yani yürürlüğe fikir sağlayabilir Hedef nöron göre kirişin kiriş) ve eksenel yer değişimi (yani lif ekseni boyunca). Tipik modlu fiberler için ışın profili de bir üst şapka dağıtımı 26, yerel olarak emilen enerji (sıcaklık) düşüş ile yaklaşık olarak bu yana yani - Örneğin, Δ ayarı ≈ 0 hücrenin çevresinde yerel sıcaklığını artırmak için beklenir kirişin merkezinde yer değiştirme nedeniyle yakın hücreye fiber uç yüzü hareket emilen enerji artışı ile karşılaştırıldığında çok azdır.
Bakımı gibi doğru ve tekrarlanabilir bir po gibi lif konumlandırmak için alınması gerekirkengörsel ipuçları, hedef nöron (örneğin Δ) göre lif konumu hassas ölçüm kullanarak ssible önceden belirlenmiş bir mesafe uzakta konumlandırma daha büyük önem taşımaktadır. Protokolün adım 3.8.2 'de tarif edilene Δ resim analizi ile (± 3 um arasında bir tahmin edilen maksimum belirsizlik ile) tespit edilebilir. Bazı deneylerde 5,8 olarak, beyaz ışık kaynakları ve istenen hücre hedeflemek için fiber üzerinden akuple edilmiştir. Bu yaklaşım, hedef bölge saçılan ışığın yoğunluğunu bu sığ açıları (θ) nispeten düşük olduğu gibi, dik bir mikroskop kurulum etkisiz olduğu bulunmuştur. - Lif konumda sonra, mikropipet basit konumlandırma sağlamak için bilinen bir miktar dışarı hareket ettirin. Fiber sonra sinir kayıt elde edilir orijinal konumuna iade edilebilir.
- Hücre içi çözüm mikropipet doldurun ve güvenli başlarına yerine uygunamplifikatör millere (örneğin Multiclamp 700B, Molecular Devices). Mikroelektrot tutucunun tarafına bağlı tüp kullanarak, mikropipet tıkanmasını önlemek için pozitif basınç küçük bir miktar uygulanır.
- Bir micromanipulator kullanarak, sadece hedef nöron üzerinde pozisyona mikropipet hareket ettirin.
- Tüm hücre kayıtları için Protokol:
- Amplifikatör gerilim-kelepçe modunda 10 msn, +10 mV kare dalga darbe (örneğin Seal Test) uygulayın ve 0 nA için temel sinyal mikropipet potansiyeli (pipet offset) ayarlayın. Sızdırmazlık da mikroelektrot direnişini istenen aralığı (- MQ 6 örneğin 2) içinde olup olmadığını belirlemek için kullanılmalıdır.
- Direncinin izlenmesi sırasında, yavaşça hedef nöron yüzeyi üzerine mikropipet konumlandırmak için mikromanipülatör ince ayar kullanımı. Mikropipet nöron ile temas halinde olduğunda, direnç (~ 0,5-1 MQ) tarafından artacaktır. Benmmediately direnç artışı takiben, pozitif sıvı basıncı kaldırmak ve küçük bir negatif basınç uygulayın. Bir kez direnci 10 geçti - 20 MQ, bir holding düzeyinde (-60 mV civarında örneğin) potansiyel membran düzeltmek.
- Bu 1 GΩ aşana kadar elektrot direnci etkili bir mühür ('gigaseal' olarak adlandırılan) hücre zarı ve mikropipet arasında oluşan olduğunu simgeleyen, artmaya devam etmelidir. Bu noktada, mikropipet tüm sıvı basıncı çıkarın.
- Gigaseal oluşmuştur sonra, kısa akım darbeleri (25 to 100 mikrosaniye, +1 V) kullanın veya kopma hücre zarı negatif sıvı basıncı kısa bakliyat ve tüm hücre yapılandırma elde.
- Membran kapasitans, seri direnç ve sızdırmazlık darbe sırasında mevcut takılı üstel eğrisinden belirlenen giriş direnci kaydedin. Sonra switc, amplifikatör üzerindeki CpFast ve CpSlow kontrolleri ayarlayarak, kapasitans geçici aza indirmekh tüm hücre moduna amplifikatör ve düz akım kadar kapasite ve direnç telafi sızdırmazlık sırasında görülmektedir. Düz test işareti yanıt korumak için kapasitans ve direnç kontrolleri ayarlayarak,; seri direnç tazminat (% 70 tahmini ~% 70 düzeltme) uygulayın.
- Amplifikatör akım kelepçe moduna geçin. Istirahat membran potansiyeli (mevcut enjeksiyon yokluğunda) dikkat edin. Istenen seviyede (örneğin -60 mV) de membran potansiyeli stabilize etmek için bir holding akımı ayarlayın. Pipet kapasitans nötralize ve gerilim düşümü dengelemek için köprü dengesini ayarlar.
- (; 300 milisaniye süresi +10 pA adımda 10-200 pA) mevcut depolarizan ile uyararak nöron ateşleme özelliklerini kontrol edin.
- Nöron yanında pozisyona fiber optik geri hareket ettirin. Bir CCD kamera birleştirilmiş görüntüleme yazılımı kullanılarak, hedef nöro ile ilgili lif pozisyonu görüntülerini yakalamakN, fiber optik (bkz. Şekil 1) üst kenarında daha sonra ilk olarak bir nöronun düzlem üzerinde odaklanarak, ve.
- Ortaya çıkan görüntüler sonraki analiz (örneğin, Şekil 1b ve 1c) tarafından tam olarak Δ (hedef nöronların merkezi optik fiber göreli üst kenarının konumu) belirlemek mümkündür. Sonra Δ bilinmektedir, bu tür fiber uç yüzü olan hedef nöron (lif ekseni boyunca) Z ve kiriş δ r merkezi nöron radyal yer değiştirmesi için mesafe parametreleri basit trigonometrik ilişkiler kullanılarak hesaplanabilir:
z = r sin 2θ + Δ cos θ
δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + δy 2) 1/2,
δy lif ekseni ve yukarıda da görüleceği gibi nöron merkezi arasındaki mesafe olduğu (örneğin see Şekil 1).
Bu konumu parametrelerin doğru bilgi uyarılması işlemleri 25 arasındaki olası farklılıkları gidermek için gerekli olabilecek Analizi, hücreden hücreye hesap pozisyonel varyasyonları almalıdır.
4. INS Deneyler
- Akım kelepçe veya gerilim kelepçe yapılandırmaları birinde elektrofizyolojik veri kaydederken, istenen parametreleri (örneğin güç, darbe uzunluğu, tekrarlama oranı vb) de uyarılması lazer çalıştırın. Bizim lazer, optik güç lazer sürücü doğrudan bir giriş üzerinden kontrol edilir ve her kayıttan önce manuel olarak belirtilir. Darbe uzunluğu ve tekrarlama oranı, harici sinyal üreteci veya veri toplama yazılımı (, adım 2.3.4 'de açıklandığı gibi) ya da kontrol edilebilir. Veri yama kelepçe kanal ve lazer tetikleyici kanal hem de kaydedilir emin olun.
Arasında değişen uzunlukları ile lazer darbeleriyaklaşık 500 mikro-saniyeye 15 msn ve darbe başına ~ 0,25-5 mJ enerjileri tipik olarak ölçülebilir elektrik yanıtları verim. Bu parametre etkilerini en aza indirmek çünkü 1 Hz ya da daha az olduğu lazer darbelerinin tekrar oranının ayarlanması, ilk deneyler için faydalı olabilir. Kaydedilen sinyal değişikliği tipik sonuçları aşağıdaki bölümde sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spiral ganglion nöronlarının voltaj-kıskaç ve akım kelepçe kayıt konfigürasyonlarının tekrarlanabilir dalga lazer aydınlatma yanıt. Şekil 3a, bir 2.5 ms, 0.8 mJ lazer darbeli (6 ortalama müdahale yanıt olarak bir hücre zarından akımı tipik değişiklikler gösterir -70 mV, -60 mV ve -50 mV düzenlenen membran potansiyeli ile 1 sn aralıklarla) tekrarlanan lazer darbeleri,. Net içe akımları sürekli aydınlatma kesildikten sonra başlangıç değerlerine dönen, lazer darbeleri yanıt olarak uyarılır. Lazer kaynaklı akımların şekli INS altında yatan süreçlerin tam bir anlayış kazanmak için tutma potansiyelleri bir mesafeden deneyler için önemli olabileceğini gösteren, membran potansiyeli değiştirilir olarak değişir görülebilir. Bu deneyler mevcut protokol küçük değişiklik ile yürütülen ve bu şarj gerilim olarak yerleşmiş teknikleri (QV) analizi kullanılarak analiz edilebilir (sein vitro elde edilen INS QV eğrileri örnekleri) e Referans 7.
Şekil 3b sunulan veriler genellikle 2.5 msn, 0.8 mJ lazer darbe (ilk membran potansiyeli-73mV, 4 Hz tekrarlama hızı teslim 16 lazer darbeleri üzerinde ortalama) tarafından uyarılmış membran potansiyeli değişimin göstergesidir. Güncel-kelepçe kayıtları darbe sonra istirahat membran potansiyeli doğru bir yaklaşık üstel azalma takip lazer darbe boyunca sabit bir membran depolarizasyon göstermektedir. Şekil 3b örnekte de lazer darbe sonrasında küçük bir ek membran depolarizasyon sergiler. Shapiro ve arkadaşları. 7 membran potansiyeli lazer bağlı değişiklikleri yakından sıcaklık yerel değişiklikleri (hücrenin doğrudan çevresinde yani sıcaklık) ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bundan başka, model Thompson et al. 27Belirli uyum koşullar altında, ışıklı bölgede eksenel ve radyal sıcaklık değişimleri kaynaklanan difüzyon yakından Şekil 3b de gösterilen membran potansiyeli değişiklikleri benzeyen yerel sıcaklık değişimlerine yol açabilir olduğunu belirlemiştir. Bu bulguların bir sonucu olarak, bu ışık dağıtım fiberin uç yüze göre hedef hücrenin konumu membran potansiyeli lazer uyarılmış varyasyonların zaman süreci ve maksimum sıcaklık hem de belirlenmesinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir Hücrenin bölgesinde.
Aşırı enerji ya da büyük sıcaklık artışına maruz kalma ile aydınlatan hedef nöron zarar neden olabilir. Bu genellikle (ani bir sabit bir seviyede membran potansiyeli sağlamak için gerekli akımda bir artışa ve / veya sinyal gürültü içinde ve istikrarsızlık büyük bir artış gibi) hücre elektriksel özelliklerinin bozulması kullanılarak gözlemlenebilir. Olağanüstü bir durumdain hücre ölümü lazer maruz kalma üzerine hemen hemen anında meydana gelir. Şekil 4, bir 25 ms, 8 mJ lazer darbeli maruz kalma sonucu ortaya çıkan bir sarmal gangliyon nöron ölümünün bir voltaj-kıskaç kayıt gösterir.
Şekil 1. Tipik bir spiral ganglion nöron ve optik stimülasyon deneyler sırasında fiber optik ve mikropipet (yukarıda görüldüğü) göreli konumlarını gösteren Faz kontrastlı görüntüler. A) Tipik spiral ganglion nöron. B) konumda fiber optik (görüntü üzerine odaklanmıştır Optik fiberin kenarı), c), hücre (not göre elyaf konumunu gösteren bindirilmiş görüntü:. elyaf üst kenarı hafifçe hücre yani Δ çıkıntılı değildir) negatiftir. Yukarıda belirtildiği gibi, δ y, ve Del görüldüğüta, lif eksen nöron merkezinin radyal yer değiştirmesi ve sırasıyla nöronun merkezine elyaf üst kenarı arasındaki mesafe vardır. Oklar spiral ganglion nöronun konumunu gösterir. Ölçek çubukları 20 mikron.
Şekil 2. Optik stimülasyon deneyler için deney düzeneği (ölçekli değildir) şematik Ankastre:. Fiber optik ve hedef hücre göre mikroelektrot konumu. θ, Δ ve Z protokol safhaları 3.4.2 ve 3.8.2 'de tanımlandığı gibidir.
Şekil 3. A) Gerilim-kelepçe (6 lazer darbeleri delive gelen ortalama yanıt1 Hz oranında kırmızı) ve b) akım kelepçe (4 Hz hızında tekrar 16 lazer darbelerinden ortalama yanıt) kayıtları zarında lazer bağlı değişiklikler 2.5 msn ile aydınlatma üzerine mevcut ve membran potansiyeli gösteren spiral ganglion nöronlar , 0.8 mJ lazer darbe. Gölgeli bölgelerle lazere maruz zamanlamasını gösterir. Parçalar daha ayrıntılı olarak lazer aydınlatma sırasında yanıtları göstermektedir. Not: a) ilave -60 mV bir membran potansiyeli ile elde edilen iz üzerinde duruluyor. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Aşırı enerjik (25 msn, 8 mJ) lazer darbe maruz kalma sonucu hücre ölümü gösteren Gerilim-kelepçe kayıt. Not genliğiSinyal Na ve Şekil 3'te gösterildiği gibi olan pA akımları önemli ölçüde daha büyük olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda belirtilen protokolleri kullanarak ayıklamak ve kültür spiral ganglion nöronları ve tüm hücre yama kelepçe deneyler yaparak lazer uyarılmış elektriksel aktivite araştırmak mümkündür. In vitro olarak kullanıldığında, yama klemp tekniği, in vivo olarak ulaşılabilir değildir deney parametreleri üzerinde bir kontrol düzeyi sağlar. Bu dalga boyu, darbe enerjisi, darbe uzunluğu, darbe şekil ve darbe tekrarlama dizileri olarak lazer stimülasyon parametreleri tekrarlanabilir bir ortamda incelenebilir. Buna ek olarak, nöronlar muhafaza edildiği bir ortamda (örneğin, çözelti sıcaklığı, kimyasal faktörlerin) mümkün membran özelliklerini incelemek ve dolayısıyla kızılötesi sinir uyarımı altında yatan mekanizmaları için yapım, sistematik olarak çeşitli olabilir. Elektrik ve optik stimülasyon yöntemleri arasındaki etkileşimi de kontrollü bir şekilde araştırılabilir. Bu temel çalışmalar fl getirerek daha fazla gelişmiş olabiliruorescent sondalar gibi iyonik konsantrasyonları veya ısı şok proteinlerin ifadesi olarak ek parametreleri izlemek için. Bu çeşitli parametrelerin net bir anlayış olgusunun tam bir anlayış elde etmek için değil, aynı zamanda proses optimizasyonu ile daha etkin uyarılması elde etmek için sadece önemli değildir.
INS mekanizması sıcaklık oynadığı önemli rol nedeniyle 5-7, lazer aydınlatma nedeniyle lokalize ısıtma doğru ölçümü bu mekanizma 27 tanımlanmasında büyük önem taşımaktadır. Açık bir yama pipet akan akım kaydederek kalibre sıcaklık ölçümleri elde ayrıntılı bir yöntem 28. Yao ve ark ve çok sayıda yazar tarafından istihdam, bu ortamları temsilcisi lazer kaynaklı ısı değişiklikleri büyüklüğünü ve zaman ders belirlemek için olmuştur in vitro (örneğin Referanslar 7, 8) bulunur. Sağlamakd ışık teslim lif konumunu tam olarak tespit edilebilir (mevcut protokolünü kullanarak gibi), sıcaklık ölçüm bu yöntem tipik INS uyaranlara bağlı olarak sıcaklık, yerel değişimin doğru haritalama sağlamak için muhtemeldir.
Uyarıcı lazer dalga boyunda lazer kaynaklı ısı değişiklikleri (ve dolayısıyla INS altında yatan mekanizmaları) su 7 dalga boyu bağımlı emme özellikleri aracılık çünkü (için Thompson ve ark. 25'e bakınız, INS deneylerde dikkat edilmesi gereken bir parametredir beklenen dalga boyu etkileri ayrıntılı bir tartışma). Bunun protokolü (Kızılötesi Nerve Stimulator, OPTOTECH P / L), dalga boyları ve lazer paketleri çeşitli kullanılan 1.870 nm diyot laser diğer yazarlar tarafından kullanılmıştır. Mevcut INS yayınlarında kullanılan lazerlerin bazı yaygın örnekleri, şunlardır: 1,840-1,940 6,7,10,13 nm arasında değişen dalga boyuna sahip ikinci Aculight diyot lazerler16-18; Holmium: Lazer 1-2-3 6,11,12,14,15 gelen YAG lazerler (2.12 mikron) ve nm 8 1.875 de nm 5,8, 1.470 işletme diyot lazerler ve Sheaumann gelen 1.535 nm 8 lazer.
Kültürlü spiral ganglion nöronlar için bu tekniği uygulayarak bir potansiyel dezavantajı nöronların (~ 10-15 mikron çapında) nispeten küçük boyutu bu sayesindedir, kayıt elektrot doğrudan lazer tarafından aydınlatılır. Bu belirli bir eşiğin ötesinde lazer aydınlatma kayıt devresi 7 (yani mühür ve pipet direnci) özelliklerini değiştirebilir öne sürülmüştür. Shapiro ve arkadaşları. 7 lazer gücü arttı gibi 3 mJ bir eşik darbe enerji bulma, QV eğrileri ters potansiyel değişim izlenerek bu eşiği ölçülen. Alternatif bir yaklaşım olarak, w ve conta pipet kombine direnci ölçerek bu etkinin büyüklüğünü belirlemek mümkün olabilirdelik hücre modu (10 msn, +10 mV gerilim darbe için geçerli yanıt kaydederek gibi) hücre dışı çözeltinin sıcaklığını değişen süre. Tam INS mekanizmalarını anlamak için, bu lazer kaynaklı direnç değişimin ölçülmesine ve dikkate alınması çok önemlidir.
Kızılötesi sinir stimülasyonu in vivo olarak üstlenilmiştir ilgili deneysel çalışmalarının çoğu Bugüne kadar. In vivo kızılötesi uyarılması için rapor radyan maruz kalma eşik biraz farklı olsa da (sıçan siyatik sinirleri 1 için 2.12 mikron örneğin 0.32 Jcm -2, <0.1 gerbil işitme sinirleri 18 1.855 mikron Jcm -2), onlar üzerinden belirlenen eşik daha düşüktür In vitro çalışmalar (örneğin fare retina ganglion hücrelerinin ve sıçan vestibüler ganglion hücrelerinin sıçan yenidoğan cardiomy için -2 5,8, 8,3 J cm için 1.875 mikron yaklaşık 20 Jcm -2cytes 9). Bu aşamada INS sürecinin ayrıntıları yeterince iyi bu farkın nedeni hakkında spekülasyon anlaşılamamıştır, ancak, bu tür yakından in vivo çalışmalarında önceki hedefleri benzer işitsel sinirlerin in vitro modellerinde kullanarak bir açıklama bulmakta avantajlı olabilir .
In vitro modeller başka bir tür Shapiro ve arkadaşları tarafından kullanılan Xenopus oositleri (~ 1 mm çapında) gibi daha büyük hücreler içerir. 7 Bu hücresel bileşenler etkilenmektedir olup olmadığını araştırmak için tek tek hücreler boyunca INS etkinliğini mekansal varyasyonlar tarama için yararlı olabilir uyarılarak. Bu çift katlı lipid veziküller gibi basit modeller in vitro deneylerde daha deneysel parametreleri üzerinde daha hassas kontrol izin verebilir, ancak bu modellerin biraz kapsamı sınırlıdır ve INS tam karmaşıklığı açıklayamazsınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Bağlantı Projesi hibe LP120100264 altında Avustralya Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al.
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T.
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
