Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

Summary

A estimulação do nervo infravermelho tem sido proposto como uma alternativa para a estimulação eléctrica em uma variedade de tipos de nervos, incluindo os que estão associados ao sistema auditivo. Este protocolo descreve um método de patch clamp para estudar o mecanismo da estimulação do nervo no infravermelho de uma cultura de neurónios auditivos primários.

Abstract

Demonstrou-se em anos recentes que pulsado, o laser de infravermelhos podem ser utilizadas para induzir respostas eléctricas em tecido neural, independente de qualquer outra modificação do tecido alvo. Estimulação neural de infravermelho foi relatada numa variedade de tecido neural periférico e sensorial in vivo, com particular interesse mostrado na estimulação de neurónios do nervo auditivo. No entanto, enquanto que o INS foi mostrado para trabalhar nestas configurações, o mecanismo (ou os mecanismos) pelo qual a luz infravermelha provoca excitação neuronal não é actualmente bem compreendido. O protocolo aqui apresentado descreve um método de fixação de membranas de células inteiras concebido para facilitar a investigação de estimulação neural infravermelhos em cultura neurónios auditivos primários. Por caracterizar completamente a resposta destas células a iluminação laser infravermelho, in vitro, sob condições controladas, pode ser possível obter uma melhor compreensão da physica fundamentaisl e os processos bioquímicos subjacentes estimulação neural por infravermelhos.

Introduction

Os campos da neurofisiologia e biônica médica dependem fortemente de técnicas que permitem a estimulação controlável de respostas elétricas no tecido neural. Enquanto a estimulação elétrica continua sendo o padrão ouro em excitação neural, sofre de uma série de inconvenientes, tais como a presença de artefatos de estímulo durante a gravação de respostas neurais, e uma falta de especificidade estimulação devido à propagação de corrente em ^um tecido circundante.

As duas últimas décadas têm visto o desenvolvimento de técnicas de estimulação opticamente mediadas ^2. Várias destas técnicas requerem a modificação do tecido-alvo, quer através da adição de uma molécula em particular (por exemplo, moléculas em gaiolas) ³ ou alguma forma de manipulação genética (por exemplo, Optogenetics) ^4, nenhum dos quais são fáceis de aplicar do lado de fora de um ambiente de pesquisa. De particular interesse é, por conseguinte, a estimulação neural por infravermelhos (INS), whereby tecido neural é excitado por luz pulsada de laser infravermelho. INS tem o potencial para ultrapassar muitos dos problemas da estimulação eléctrica, permitindo altamente específico, a estimulação não-contacto do tecido neural ^2. No entanto, enquanto que o INS tem sido demonstrado com sucesso numa variedade de configurações, in vivo, o mecanismo exacto de excitação permanece incerto.

Algumas publicações recentes têm mostrado progresso para desvendar o mecanismo por trás INS ^5-7. Aquecimento rápido devido à absorção da luz do laser por água parece desempenhar um papel fundamental. No entanto, para além deste consenso ainda está para ser atingido. Shapiro et ai. ⁷ propor um mecanismo geral pelo qual altamente rápido aquecimento provoca uma perturbação na distribuição de partículas carregadas adjacentes à membrana celular, conduzindo a uma alteração na capacitância da membrana celular e subsequente despolarização. Além disso, Albert et al. ^Cinco afirmar que laser aquecimento induzido activa uma classe específica de canais de iões sensíveis à temperatura (receptor de potencial transiente canais vanilóides), permitindo que os iões passam através da membrana celular. Nesta fase, ainda não está claro como esses mecanismos se combinam, ou mesmo se existem outros factores que estão ainda a ser identificado.

Apesar de um pequeno número de publicações (Referências ^5,7-9) investigaram INS in vitro, a grande maioria dos trabalhos publicados neste campo foi realizado in vivo (por exemplo, as referências ^1,6,10-18). Estimulação dos neurônios auditivos infravermelho tem sido uma área de interesse particular, devido às potenciais aplicações em implantes cocleares ^10,14-18. Enquanto experimentos in vivo são importantes para verificar a eficácia da técnica em diversas configurações, o aumento do nível de controle oferecido por estudos in vitro deverá levar a uma compreensão mais detalhada do mechnismo responsável pelo INS. Este relatório descreve a preparação de culturas de neurônios do gânglio espiral para as investigações patch clamp, pois estes podem ser usados ​​para estudar os mecanismos fundamentais e ao mesmo tempo ligando para a grande massa de dados existentes no sistema auditivo.

A técnica de patch clamp é uma excelente ferramenta para investigações de fenômenos eletrofisiológicos, proporcionando um meio de registrar a atividade elétrica das células individuais e estudar a contribuição das correntes subjacentes individuais ^19. Quando esta técnica é aplicada a uma preparação estável na in vitro de neurónios primárias, tais como culturas de neurónios do gânglio espiral, oferece a oportunidade de estudar em profundidade os mecanismos pelos quais a actividade neural é controlada e manipulada.

Os protocolos especificados neste trabalho métodos esboço para investigar o efeito da estimulação a laser sobre as propriedades elétricas dos neurônios do gânglio espiral através de patch clampgravações. A abordagem baseia-se um laser de fibra de acoplamento, em vez de um laser de espaço livre, permitindo uma operação mais segura bem como mais fácil e reproduzível de alinhamento sem a necessidade de modificar a configuração do microscópio padrão. Com base nestes protocolos, deverá ser possível realizar uma vasta gama de ensaios de modo a determinar de forma mais clara o mecanismo ou os mecanismos por detrás do INS.

Protocol

1. Cultura de neurônios do gânglio espiral

1. Esterilizar redonda pequena (por exemplo, 10 mm de diâmetro) lamínulas de vidro e uma pinça curva em uma autoclave. Transferir as lamelas esterilizadas em poços individuais de uma solução estéril de 4 anéis placa de petri de 35 milímetros ou placa de 4 poços, utilizando as pinças esterilizadas. Aplicar 150 ul de poli-L-ornitina (500 ug / ml) e laminina rato (0,01 mg / ml) para a superfície superior da lamela e colocar numa incubadora (37 ° C) durante até 48 horas. Assegurar que as lamelas não flutuem a partir do fundo do poço.
2. Preparar 50 ml de meio Neurobasal estéreis (NBM) de cada cultura neural: 47,5 ml neurobasal A, 0,5 ml de N ₂ suplemento, 1 ml de suplemento de B27, de 0,5 ml de L-glutamina, e 0,5 ml de penicilina-estreptomicina. Nota: Os suplementos podem ser congelado, armazenado a -20 ° C e adicionado ao meio no dia necessária.
3. Dissociar neurônios do gânglio espiral de pós-natais dias 4-7 filhotes de rato, como descrito anteriormente ^20,21, nosção enzimáticas (0,025% de tripsina e 0.001% de DNase I) e técnicas mecânicas. Consulte Whitlon et al. ²² e Vieira et al. ²³ para os procedimentos detalhados de neurônios do gânglio espiral da cultura, ou Parker et al. ²⁴ para uma demonstração de isolamento modiolus.
4. Aspirar qualquer solução poly-L-ornithine/laminin restante das lamelas e lave brevemente com NBM.
5. Adicionar 150-200 ul da suspensão de neurónios do gânglio espiral dissociado para as lamelas e colocar numa incubadora (37 ° C, 10% de CO _2). Nota: até 20 lamelas pode ser preparado a partir de uma ninhada média de oito filhotes de ratos.
6. Quatro horas depois do chapeamento neurónios, aspirar a solução para remover os detritos celulares e substituir com 150-200 ul aquecido NBM fresco. Nota: A mídia pode exigir a reposição diária para evitar a desidratação.
7. Retorno lamelas à incubadora até ser necessário para registos electrofisiolicos. Nota: espiral dissociadaculturas de neurónios do gânglio pode ser utilizado para experiências electrofisiológicas e quatro horas após a dissociação e por até dois dias depois. Tempo in vitro, deve ser tido em conta durante a análise dos resultados. Reabastecer NBM cada 24-48 horas.

2. Preparação para o patch Recordings Grampo

1. Preparar soluções
   1. Solução intracelular (micropipeta): 115 mM de K-gluconato, 7 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,05 mM de EGTA, 2 mM de Na ₂ ATP, 2 mM de MgATP, 0,5 mM Na ₂ GTP (ajustar para pH 7,3 com KOH, ajustar a 295 mOsmol / kg, com sacarose). Filtrar a solução através de um filtro estéril (0,2 um) e dividem-se em alíquotas de 200 ul de ser armazenado a -20 ° C até ao dia da gravação.
   2. Solução extracelular (banho): NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl2 ₂ mM, _MgCl2 1 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM (ajustado a pH 7,4 com NaOH; ajustar a 300-310 mOsmol / kg, com sacarose) . Esta solução é feita no dia da gravação.
2. Prepare gravação micropipetas com uma resistência de 2-6 mohms. Nós usamos um laser de CO ₂ extrator (P-2000; Sutter Instruments) e vidro de borosilicato (1,0 mm de diâmetro externo, 0,58 milímetros de diâmetro interno e 75 mm de comprimento).
3. Prepare o laser. Este protocolo destina-se a utilização com um laser de fibra de acoplamento, tal como a 1870 nm, a partir de Infravermelhos neuroestimulador Optotech P / L. A fibra óptica utilizado para entrega de luz nas nossas experiências é uma fibra de sílica diâmetro 200/220 mM de núcleo / revestimento, com uma abertura numérica de 0,22 e conectores FC-PC em ambas as extremidades (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0,22). Os cordões foram cortadas ao meio para produzir duas tranças de fibras (isto é, conectorizada numa extremidade e clivada no outro). Os efeitos do diâmetro do núcleo da fibra e a abertura numérica em mudanças de temperatura induzidas a laser têm sido discutidas em detalhe por Thompson et ai ^25.
   1. Cleave a ponta da fibra de entrega de luz, utilizando técnicas convencionaise assegurar que a ponta resultante é de alta qualidade por meio de observação com um microscópio óptico (isto é, a ponta deve ser perpendicular ao eixo da fibra e aparecem plana sobre a inspecção visual). Ligar o fornecimento de luz de fibra para a fibra de saída acoplado do laser utilizando um estímulo adequado, através do conector (por exemplo, Thorlabs ADAFC2).
   2. Medir a potência do laser de saída da ponta clivada da fibra de entrega de luz, utilizando um instrumento adequado (por exemplo, Fieldmate Coerente com LM-3 cabeça do detector). Recomenda-se verificar a potência do laser cada vez que a fibra de entrega luz é clivada ou um ajuste significativo é feito para o laser (por exemplo, o transporte de um laboratório para outro).
   3. Insira fibra entrega a luz em uma bucha de fibra ou dispositivo equivalente e apor o mandril ao microposicionador apropriado. É importante ser capaz de determinar com precisão o ângulo θ que a fibra óptica faz com a lamela. Este anglE pode ser medido tomando uma fotografia do arranjo experimental e utilizando software de processamento de imagem (por exemplo ImageJ) para se obter o ângulo. O ângulo θ (ou intervalo de ângulos possíveis) é limitado principalmente por limitações espaciais do arranjo experimental - em particular o microscópio. Os valores típicos de θ nas nossas experiências (com base em um microscópio vertical) são cerca de 36 °, no entanto, o ângulo ideal pode diferir significativamente para configurações alternativas (por exemplo, aqueles que utilizam um microscópio invertido).
   4. Fazer as ligações entre o laser e o sistema de aquisição de dados de patch clamp (Digidata 1440A, por exemplo, Molecular Devices), conforme mostrado na Figura 2. A saída digital a partir do sistema de aquisição de dados de patch clamp deve ser ligado ao laser através de um gerador de função externa, tornando-se possível especificar parâmetros de pulso de laser independentes do sistema de aquisição de dados. Alternativamente, esta saída pode ser conectado diretamente aoo motorista do laser (que exige a duração de pulso e taxa de repetição para ser definido pelo software de aquisição de dados). Em qualquer caso, o sinal utilizado para disparar o laser deve ser ligada de volta para uma entrada do sistema de aquisição de dados, para assegurar que a temporização e duração dos pulsos de laser pode ser registada concorrentemente com o sinal electrofisiológico.

3. Remendo Recordings Grampo para investigação de INS

1. Encher o contentor apropriado do sistema de perfusão com uma solução extracelular e ajustar a taxa de fluxo para proporcionar perfusão do banho a uma taxa de 1-2 ml / min. Usamos um sistema (frasco aspirador, de válvula de estrangulamento, e tubagem PE) alimentada por gravidade com um aquecedor em linha, para permitir um aquecimento rápido da solução, e uma bomba peristáltica, para remover a solução passou por sucção.
2. Coloque uma lamela com a cultura de células para a câmara de registo (de banho) de um microscópio vertical. Utilizando uma objetiva de imersão em água de alta ampliação (e. G. 40X) e de contraste de fase (por exemplo, contraste de interferência diferencial ou contraste gradiente Dodt), localizar visualmente os neurônios do gânglio espiral dentro da cultura. Um neurónio típico gânglio espiral é de fase brilhante, redondos e cerca de 15 um de diâmetro, com um núcleo proeminente, como mostrado na figura 1a.
3. Uma vez que um neurônio foi localizado, mudar para um objetivo de ampliação menor (por exemplo, 10x) e localize o neurônio alvo dentro do campo visual.
4. Mover o fornecimento de luz de fibra óptica em posição usando o seguinte procedimento (ou equivalente):
   1. Utilizar a microposicionador para mover a fibra de saída até que a ponta fica perto do neurónio alvo nos planos horizontal e vertical. A posição vertical da ponta da fibra pode ser verificada por meio de mover o objectivo cima e para baixo (a digitalização da focagem).
   2. Retornar ao objectivo alta ampliação e posicionar a ponta da fibra óptica na sua posição destinada ao lado de tele neurônio (ver Figura 2 inset). Ao ajustar a posição vertical da fibra, é importante que o bordo inferior da fibra está assente sobre (isto é, apenas tocando) da lamela, para minimizar a incerteza na localização da fibra. O alinhamento óptimo, no plano horizontal irão depender do ângulo θ que faz com que a fibra com a lamela e o raio r da fibra. A fim de posicionar as fibras de modo que o centro do neurónio-alvo se situa ao longo do eixo da fibra, a distância horizontal entre o bordo superior da fibra e da célula alvo deve ser
      Δ _target = r (θ Cosec - 2 sin θ),
      em que os valores negativos indicam que as saliências de fibras ópticas da célula. Quando o alinhamento da fibra, uma distância de _alvo Δ entre a borda superior da fibra e do centro do neurónio pode ser conseguida por cerca de uma inspecção visual. No entanto _alvo Δ é projetado paraservir como uma orientação aproximada só. Posicionamento da fibra de tal modo que a distância real Δ entre o bordo superior da fibra e do centro do neurónio difere de forma mensurável a partir Δ _alvo (como mostrado na Figura 1) pode fornecer informações sobre o efeito de ambos deslocamento radial (ou seja, a partir do centro da feixe) e deslocamento axial (isto é, ao longo do eixo da fibra) do feixe em relação ao neurónio alvo. Por exemplo, configurando Δ ≈ 0 seria esperado um aumento da temperatura local na vizinhança da célula - ou seja, uma vez que o perfil do feixe de fibras multimodo típicos é bem aproximada pela distribuição de um chapéu ^de topo ^26, a diminuição na energia absorvida localmente (temperatura) devido ao deslocamento a partir do centro do feixe é mínima em comparação com o aumento da energia absorvida a partir de mover a face da extremidade da fibra mais perto da célula.
      Enquanto cuidados devem ser tomados para posicionar a fibra com a maior precisão e repetidamente como possible usando sinais visuais, medições precisas da localização da fibra em relação ao alvo neurônio (por exemplo, Δ) é de maior importância do que posicionando-o a uma distância pré-determinada distância. Δ pode ser determinado (com um grau de incerteza máxima estimada de ± 3 mm) por análise de imagem tal como descrito no passo 3.8.2 do protocolo. Em algumas experiências ^{a 5,8,} fontes de luz branca foram acoplados através da fibra, a fim de atingir a célula desejada. Esta abordagem foi encontrado para ser ineficaz na configuração microscópio vertical, conforme a intensidade da luz difundida a partir da região alvo foi relativamente baixo a estes ângulos rasos (θ).
   3. Uma vez que a fibra está em posição, a movê-lo para fora de uma quantidade conhecida para permitir o posicionamento simples da micropipeta. A fibra pode então ser devolvida à sua posição original quando a gravação é conseguida neural.
5. Encha a micropipeta com solução intracelular e segura se encaixar nas cabeçastagem do amplificador (por exemplo, Multiclamp 700B, Molecular Devices). Usando o tubo ligado ao lado do suporte de microeléctrodos, aplicar uma pequena quantidade de pressão positiva para evitar o entupimento da micropipeta.
6. Usando um micromanipulador, mova o micropipeta na posição logo acima do neurônio-alvo.
7. Protocolo para gravações de células inteiras:
   1. Aplicar a 10 mseg, 10 mV pulso de onda quadrada (por exemplo, selo de teste) no modo de fixação de tensão do amplificador e ajustar o potencial micropipeta (offset pipeta) do sinal de linha de base para 0 nA. O ensaio de vedação deve também ser usada para determinar se a resistência dos microeléctrodos está dentro da gama desejada (por exemplo, 2-6 mohms).
   2. Enquanto monitoriza a resistência, usados ​​ajustes finos da micromanipulador para posicionar cuidadosamente a micropipeta sobre a superfície do neurónio alvo. Quando a micropipeta está em contacto com o neurónio, irá aumentar a resistência (por ~ 0,5 a 1 mohms). Eummediately seguindo o aumento da resistência, remover a pressão de fluido positiva e aplicar uma pequena pressão negativa. Uma vez que a resistência passou 10-20 mohms, corrigir o potencial para um nível de retenção (por exemplo, em torno de -60 mV) membrana.
   3. A resistência do eléctrodo deve continuar a aumentar até exceder um GÊ, o que significa que uma vedação eficaz (denominado «gigaseal ') foi formado entre a membrana celular e micropipeta. Neste ponto, remove toda a pressão do fluido a partir da micropipeta.
   4. Uma vez que o gigaseal tenha sido formado, o uso de impulsos de corrente de curta duração (25 a 100 ms; +1 V) ou breves impulsos de pressão de fluido negativa a ruptura da membrana celular e obter uma configuração de célula total.
   5. Gravar a capacitância de membrana, a resistência em série e resistência de entrada, conforme determinado a partir da curva exponencial montado na corrente durante o impulso de teste de vedação. Minimizar os transientes de capacitância, ajustando os controles CpFast e CpSlow no amplificador, então switch no amplificador em modo de células inteiras, e compensar a capacitância e resistência até que uma corrente fixa é observada durante o ensaio de vedação. Aplicar a compensação de resistência em série (~ correção de 70%, a previsão de 70%), o ajuste de capacitância e resistência controles para manter uma resposta selo teste plana.
   6. Alternar para o modo atual-clamp no amplificador. Tome nota do potencial de repouso (na ausência de injeção de corrente). Ajustar a corrente que prende a estabilizar o potencial da membrana no nível desejado (por exemplo, -60 mV). Neutralizar a capacitância pipeta e ajustar o equilíbrio da ponte para equilibrar a queda de tensão.
   7. Verifique as propriedades de disparo do neurônio, estimulando com despolarização atual (10-200 pA pA em 10 etapas, 300 ms de duração).
8. 1. Mova a volta de fibra óptica para a posição ao lado do neurônio. Utilizando o software de imagem acoplado a uma câmara CCD captar imagens da posição da fibra em relação ao alvo neuron, incidindo sobre o plano do neurónio, inicialmente, e, em seguida, sobre a borda superior da fibra óptica (ver Figura 1).
   2. Por análise subsequente das imagens resultantes (por exemplo, Figuras 1B e 1C) é possível determinar com exactidão Δ (a posição do bordo superior da fibra óptica em relação ao centro do neurónio alvo). Depois Δ é conhecido, os parâmetros tais como a distância entre a face da extremidade da fibra para o neurónio alvo (ao longo do eixo da fibra) z e o deslocamento no sentido radial do neurónio a partir do centro do feixe de δ r pode ser calculada usando as relações trigonométricas simples:
      z = r sin 2θ + Δ cos θ
      δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) Ay ² + ^{2) 1/2,}
      Ay onde é a distância entre o eixo da fibra e do centro do neurónio, como visto a partir de cima (por exemplo, sie Figura 1).
      A análise deve levar em conta as variações de posicionamento de célula para célula, como conhecimento exato desses parâmetros de localização pode ser necessária para resolver as possíveis diferenças entre os processos de estimulação ^25.

4. Experimentos INS

1. Durante a gravação de dados eletrofisiológicos em qualquer pinça de corrente ou configurações braçadeira de tensão, execute o laser de estimulação para os parâmetros desejados (por exemplo, energia, comprimento de pulso, taxa de repetição, etc.) Com a nossa laser, a potência óptica é controlado através de uma entrada direta para o motorista laser e é especificada manualmente antes de cada gravação. Duração do impulso e frequência de repetição pode ser controlada por qualquer um gerador de sinal externo ou o software de aquisição de dados (tal como descrito no passo 2.3.4). Assegure-se que os dados são registados a partir de tanto o canal de fixação de membranas e o canal de gatilho laser.

Pulsos de laser com comprimentos que variamde cerca de 500 ms a 15 ms e energias de ~ 0,25-5 mJ por impulso normalmente produzem respostas elétricas mensuráveis. Definindo a taxa de repetição de pulsos de laser para ser 1 Hz ou menos pode ser útil para as experiências iniciais, uma vez que irá minimizar os efeitos deste parâmetro. Os resultados típicos que mostram a variação do sinal gravado é apresentado no seguinte ponto.

Representative Results

Neurónios do gânglio espiral respondem à iluminação laser com formas de onda repetíveis em ambos tensão braçadeira e configurações de gravação actual-clamp. Figura 3a mostra alterações típicas na corrente de fluxo através de uma membrana celular, em resposta a um 2,5 ms, 0,8 mJ impulso laser (de resposta média de 6 pulsos de laser, repetido a intervalos de 1 segundo), com o potencial de membrana realizada a -70 mV, -60 mV e -50 mV. Correntes internas líquidas são constantemente evocadas em resposta a pulsos de laser, retornando aos valores iniciais após a iluminação cessou. A forma das correntes induzidas a laser podem ser vistas para variar, como o potencial de membrana é alterada, indicando que poderá ser importante para a realização de experiências com um intervalo de potenciais de exploração, a fim de obter uma compreensão completa dos processos subjacentes INS. Estas experiências podem ser realizadas com uma pequena modificação do protocolo de corrente e analisados ​​utilizando técnicas estabelecidas, como a taxa de tensão (qv) análise (SEe ⁷ de referência para os exemplos de curvas QV obtidos a partir do INS, in vitro).

Os dados apresentados na Figura 3b é indicativo da mudança no potencial de membrana tipicamente evocadas por 2,5 ms, 0,8 mJ pulso de laser (membrana inicial 73mV de potencial em média de 16 pulsos de laser emitidos a um ritmo de repetição de 4 Hz). Gravações corrente-clamp mostram uma despolarização da membrana constante ao longo do pulso de laser, seguido por uma queda de aproximadamente exponencial no sentido do potencial de membrana em repouso após o pulso. O exemplo da Figura 3b, também exibe uma despolarização da membrana adicional pequena sequência do pulso de laser. Shapiro et ai. ⁷ têm demonstrado que as alterações induzidas por laser em potencial de membrana estão intimamente relacionadas com as alterações locais de temperatura (isto é, a temperatura na proximidade directa da célula). Além disso, o modelo descrito por Thompson et ai ^27.determinou que, sob certas condições de alinhamento, a difusão a partir de gradientes de temperatura resultante axial e radial na região iluminada pode conduzir a variações locais de temperatura que se assemelham muito às mudanças no potencial da membrana mostrados na Figura 3b. Como resultado destas descobertas, pensa-se que a posição da célula-alvo em relação à face terminal da fibra entrega a luz desempenha um papel significativo na determinação do decurso de tempo das variações de laser evocados no potencial da membrana e a temperatura máxima na região da célula.

Iluminando com energia excessiva ou a exposição a um grande aumento na temperatura pode resultar em danos para o neurónio alvo. Isto muitas vezes pode ser observada através de deterioração das propriedades eléctricas de células (por exemplo, um aumento abrupto de corrente necessária para manter o potencial de membrana a um nível constante, e / ou um grande aumento do ruído e instabilidade no sinal). Em caso extremoA morte celular ocorre quase instantaneamente ao ser exposto a laser. Figura 4 mostra uma gravação voltagem-grampo da morte de um neurónio do gânglio espiral, resultante da exposição a 25 ms, 8 mJ pulso de laser.

Figura 1. Imagens de contraste de fase mostrando uma típica neurónio do gânglio espiral e as posições relativas de fibra óptica e micropipeta (visto de cima) durante as experiências de estimulação. Ópticas a) neurónios do gânglio espiral típico. B) A fibra óptica na posição (imagem está focada na parte superior extremidade da fibra óptica) c) sobrepostos imagens que mostram a posição da fibra em relação à célula (nota:. da borda superior da fibra é ligeiramente saliente da célula ou seja Δ é negativo). Como pode ser visto a partir de cima, e y δ & Delta; são o deslocamento radial do centro do neurónio do eixo da fibra e a distância a partir da borda superior da fibra para o centro do neurónio respectivamente. As setas indicam a posição dos neurónios do gânglio espiral. Barras de escala 20 uM.

Figura 2. Esquemático da instalação experimental para experiências de estimulação ópticos (não à escala) Inserção:. Posição da fibra óptica e microeléctrodo em relação à célula alvo. θ, Δ e Z são como definidos no protocolo de passos 3.4.2 e 3.8.2.

Figura 3. A) Voltage-clamp (resposta média de 6 pulsos de laser entregvermelho, a uma taxa de 1 Hz) e b) de corrente de fixação (resposta média de 16 pulsos de laser repetido a uma taxa de 4 Hz) gravações de neurónios do gânglio espiral mostrando as alterações induzidas a laser no potencial de membrana e membrana de corrente mediante a iluminação de uma 2,5 mseg , 0,8 mJ pulso de laser. Regiões sombreadas indicam o tempo de exposição ao laser. Inserções mostram respostas durante a iluminação a laser com mais detalhes. Nota: a inserção em um) incide sobre o traço obtido com um potencial de membrana de -60 mV. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 4. Gravação voltagem-grampo que mostra a morte celular, resultante de exposição a um (25 ms, 8 mJ) de impulsos de laser excessivamente enérgico. Note-se que a amplitudeo sinal é mostrado na nA e é significativamente maior do que as correntes de pA mostrados na Figura 3.

Discussion

Utilizando os protocolos descritos neste documento, é possível extrair e cultura de neurônios do gânglio espiral e investigar evocadas laser de atividade elétrica através da realização de experimentos de patch clamp de células inteiras. Quando usado in vitro, a técnica de fixação de membranas oferece um nível de controlo sobre os parâmetros experimentais, que não é alcançável in vivo. Parâmetros de estimulação a laser, tais como comprimento de onda, a energia de pulso, comprimento de pulso, a forma de pulso, e as seqüências de repetição de pulso podem ser estudados em um ambiente reproduzível. Além disso, o ambiente em que os neurónios são mantida (por exemplo, temperatura da solução, os factores químicos) pode ser variada sistematicamente, tornando-se possível estudar as propriedades da membrana e, consequentemente, os mecanismos subjacentes a estimulação neural por infravermelhos. A interacção entre as modalidades de estimulação eléctrica e óptica, também podem ser investigadas de uma forma controlada. Estes estudos fundamentais pode ainda ser desenvolvida através da introdução de fluorescent sondas para monitorizar parâmetros adicionais tais como a concentrações iónicas ou a expressão de proteínas de choque térmico. A clara compreensão destes vários parâmetros não é apenas fundamental para alcançar uma compreensão completa do fenômeno, mas também para alcançar a estimulação mais eficiente através de otimização de processos.

Devido à importância do papel desempenhado pela temperatura no mecanismo de INS ^5-7, a medição exacta do aquecimento localizado devido à iluminação do laser é de suma importância na definição deste mecanismo ^27. Um método detalhado de obtenção de medições de temperatura calibrados por registo da corrente que flui através de uma pipeta patch de aberta, tem sido descrito por Yao et al. ²⁸ e empregada por numerosos autores, para determinar a magnitude e evolução no tempo da mudança de temperatura induzidas a laser em ambientes representativos daqueles encontrado in vitro (por exemplo, ver Referências ^{7, 8).} Fornecerd a posição da fibra de entrega de luz pode ser determinada com precisão (por exemplo, usando o protocolo de corrente), este método de medição da temperatura é susceptível de permitir o mapeamento preciso da mudança local na temperatura, devido a estímulos INS típicos.

O comprimento de onda do laser estimulante é um parâmetro que deve ser considerada em experiências INS, uma vez que as alterações de temperatura induzida a laser (e, consequentemente, os mecanismos subjacentes do INS) são mediadas pelas características de absorção de comprimento de onda dependente de água ⁷ (ver Thompson et ai. Por ²⁵ uma discussão detalhada dos efeitos esperados de comprimento de onda). Afora a 1870 nm diodo laser utilizado neste protocolo (Infrared Estimulador de Nervos, Optotech P / L), uma variedade de comprimentos de onda e pacotes de laser têm sido utilizados por outros autores. Alguns exemplos comuns de os lasers usados ​​em publicações ins existentes são: lasers de diodo de Aculight com comprimentos de onda que variam de 1,840-1,940 nm ^6,7,10,13,16-18; Hólmio: YAG (2,12 mm) de 1-2-3 Laser ^{6,11,12,14,15,} e lasers de diodo operando em 1875 nm ^5,8, 1.470 nm ⁸ e 1.535 nm ⁸ de Sheaumann laser.

Uma desvantagem potencial da aplicação desta técnica para cultura de neurónios do gânglio espiral é que, devido ao tamanho relativamente pequeno dos neurónios (~ 10-15 um de diâmetro), o eléctrodo de registo está directamente iluminado pelo laser. Tem sido sugerido que a iluminação do laser para além de um certo limite pode alterar as propriedades do circuito ⁷ de gravação (isto é, a resistência do selo e de pipeta). Shapiro et ai. ^Sete medido este limite por monitorização da alteração no potencial de reversão curvas QV como a potência do laser foi aumentada, encontrar um pulso de energia limiar de 3 mJ. Como uma abordagem alternativa, pode ser possível determinar a magnitude deste efeito, medindo a resistência combinada do selo e pipeta em wModo de célula orifício (por exemplo, a gravação da resposta da corrente a 10 mseg, 10 pulsos de voltagem mV) ao variar a temperatura da solução extracelular. A fim de compreender plenamente os mecanismos de INS, é vital que o laser induziu alterações na resistência ser medido e levado em conta.

Até à data, a maioria do trabalho experimental relativo estimulação neural infravermelho foi realizada in vivo. Enquanto relataram limites de exposição radiante para a estimulação de infravermelho in vivo variar um pouco (por exemplo, 0,32 Jcm ^-2 a 2,12 mm para ratos nervo ciático ^1, <0,1 Jcm ^-2 a 1,855 mm para os nervos auditivos gerbil ^18), eles são significativamente inferiores aos limites determinados por meio de estudos in vitro (por exemplo, cerca de 20 ^-2 a Jcm 1,875 mM para as células ganglionares da retina de rato e células ganglionares vestibulares rato ^5,8, 8,3 J por ^cm2 de rato neonatal cardiomiopatiacitos ^9). Nesta fase, os detalhes do processo de INS não estão suficientemente bem compreendidas para especular sobre a causa desta diferença, no entanto, utilizando modelos in vitro, tais como neurónios auditivos que se assemelham de perto dos objectivos da anterior em trabalho in vivo pode ser vantajoso em encontrar uma explicação .

Alguns outros modelos in vitro envolvem células maiores tais como oócitos Xenopus (~ 1 mm de diâmetro) utilizados por Shapiro et ai. ⁷ Estas podem ser úteis para sondar as variações espaciais na eficácia do INS através células individuais, a fim de investigar se os componentes celulares são influenciadas por estimulação. Modelos mais simples, como vesículas lipídicas bicamada pode permitir o controle ainda mais preciso sobre os parâmetros experimentais do que em experimentos in vitro, porém esses modelos são um pouco limitadas em escopo e não podem revelar toda a complexidade do INS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips	Lomb Scientific	CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish	VWR International	82050-542
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015
Curved forceps	WPI	14101	Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator	ThermoScientific	Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A	Gibco	10888-022
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-148
L-Glutamine	Invitrogen	25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Potassium D-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
Potassium hydroxide	LabServ	BSPPL738.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	310166
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	383147
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sodium hydroxide	LabServ	BSPSL740.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope	Zeiss	AxioExaminerD1	Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective	Zeiss	W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage	ThorLabs	Burleigh Gibraltar
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Vibration isolation table	TMC	Micro-g 63-532
CCD Camera	Diagnostic Instruments	RT1200
Camera software	Diagnostic Instruments	SPOT Basic
In-line solution heater	Warner	SH-27B
Temperature controller	Warner	TC-324B
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Micropipette glass	Sutter Instruments	GBF100-58-15	Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P2000
Recording Software	AxoGraph		Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle	Sigma-Aldrich	CLS12201L	1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing	Harvard	PolyE #340
Masterflex peristaltic pump	Cole-Parmer	HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode	Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)	AFW Technologies	MM1-FC2-200/220-5-C-0.22	Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC)	Thorlabs	ADAFC2
Optical fiber cleaver	EREM	FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm)	Siemens		For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)	Siemens		For removing outer coating of patch cord
Signal generator			Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner			Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck	Newport	FPH-DJ
Laser power meter and detector head	Coherent	FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.