Summary
La proteína nucleoide mitocondrial de levadura, Mgm101, es una proteína de recombinación de tipo Rad52 que forma grandes anillos de oligómeros. Un protocolo se describe la preparación Mgm101 recombinante soluble usando la proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetado estrategia junto con intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño.
Abstract
El gen MGM101 se identificó hace 20 años por su papel en el mantenimiento de ADN mitocondrial. Los estudios de varios grupos han sugerido que la proteína Mgm101 está implicado en la reparación de recombinación de ADN mitocondrial. Recientes investigaciones han indicado que Mgm101 se relaciona con la familia de proteínas de recombinación de tipo Rad52. Estas proteínas forman grandes anillos de oligómeros y promueven la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Sin embargo, la caracterización de Mgm101 se ha visto obstaculizada por la dificultad en la producción de la proteína recombinante. Aquí, se describe un procedimiento fiable para la preparación de Mgm101 recombinante. Proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetados Mgm101 se expresa primero en Escherichia coli. La proteína de fusión se purificó inicialmente por cromatografía de afinidad de amilosa. Después de ser liberado por escisión proteolítica, Mgm101 se separa de MBP por cromatografía de intercambio catiónico. Monodispersada Mgm101 se obtiene despuéspor cromatografía de exclusión por tamaño. Se obtiene un rendimiento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultivo bacteriano puede ser obtenido de forma rutinaria. El Mgm101 recombinante tiene un mínimo de contaminación de ADN. Las muestras preparadas se utilizan con éxito para el análisis de imágenes de partículas bioquímicas, estructurales e individuales de Mgm101. Este protocolo también se puede usar para la preparación de otras proteínas de unión al ADN oligoméricas grandes que pueden ser mal plegadas y tóxico para las células bacterianas.
Introduction
La recombinación homóloga es importante para la reparación de doble filamento se rompe (DSBs) y enlaces cruzados, y para la reiniciación de la replicación del ADN a partir de horquillas de replicación se derrumbó 1. En la recombinación homóloga convencional, el centro de reacción es catalizada por las recombinasas dependientes de ATP incluyendo RecA en procariotas, y Rad51 y Dmc1 en eucariotas 1-3. Estas recombinaciones forman nucleoprotein filamentos en ssDNA, que son esenciales para iniciar la búsqueda de homología y el capítulo invasión dentro de moldes de ADN dúplex (Figura 1, panel izquierdo) 4-7. Además del esquema convencional, la recombinación homóloga también puede tener lugar de una manera RecA/Rad51-independent (Figura 1, panel derecho). Por ejemplo, las proteínas de levadura Rad52 y Rad59 pueden catalizar directamente la hibridación de cadenas de ADNmc complementarias que están expuestos por resección de roturas de ADN de doble cadena. Este proceso de recombinación, conocido como cantarle línea de recocido, por lo general no implica homóloga de emparejamiento con las plantillas de ADN de doble cadena. Después del recocido, colas heterólogas se eliminan por exonucleasas y mellas se ligan para restaurar la continuidad del genoma 8-10. Reparación por el mismo mecanismo de recocido capítulo suele ir acompañada de las supresiones de secuencias genómicas entre las regiones directamente repetidas.
Rad52 pertenece a un grupo diverso de proteínas de recombinación que son muy extendida entre bacteriófagos 11. Estas proteínas también se conocen como proteínas individuales de recocido Strand (SSAP), sobre la base de su actividad en la promoción de la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Los mejores SSAP bacteriófagos son caracterizados Redβ y Erf del bacteriófagos λ y P22, RecT del profago rac y la proteína Sak del fago lactococcal UL36. Los SSAP se caracterizan estructuralmente por un típico pliegue β-β-β-α, aunque similitud es prácticamente indetectablepoder en sus secuencias primarias. Todos ellos forman grandes anillos homo-oligómeros de 10-14 simetría veces in vitro 12-14. Las consecuencias funcionales de la organización estructural de orden superior característica no se entiende bien.
Estamos interesados en la comprensión del mecanismo de la recombinación homóloga en el genoma mitocondrial. Anteriormente hemos identificado el gen MGM101 que es esencial para el mantenimiento de ADNmt en Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 posteriormente se encontró que se asocia con nucleoides mitocondriales y es necesario para la tolerancia de ADNmt a los agentes que dañan el ADN 16. Sin embargo, el estudio de Mgm101 ha sido muy limitado en la última década por la dificultad para producir Mgm101 recombinante. Hemos tenido éxito recientemente en la producción de Mgm101 soluble en grandes cantidades a partir de E. coli mediante la estrategia de fusión MBP. Esto nos ha permitido demostrar que Mgm101 accionessimilitudes bioquímicas y estructurales con la Rad52-familia de proteínas 17,18. En este informe, se describe un procedimiento de purificación de tres etapas, que produce los análisis bioquímicos y estructurales Mgm101for homogéneos (Figura 2).
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Protocol
Estudios previos han demostrado que los primeros amino-terminal de 22 residuos de Mgm101 se escinden después de la importación en mitocondrias 19. Para la expresión en Escherichia coli, el marco de lectura abierto MGM101 carece de los primeros 22 codones se amplifica por PCR y se coloca aguas abajo de la secuencia de malE que codifica la proteína de unión a maltosa (MBP) en una versión modificada del vector de expresión pMAL-c2E. Esto genera la fusión MBP-Mgm101 con un enlazador que contiene un sitio de escisión para la proteasa PreScission (Figura 3). El plásmido se construyó por primera vez por la selección de E. transformantes de E. coli sin IPTG y selección azul / blanco Xgal. El plásmido pMAL-c2E-MGM101 resultante se introduce luego en la E. coli cepa BL21-CodonPlus (DE3)-RIL mediante la selección de colonias resistentes a la ampicilina y cloranfenicol.
1. Expresión, Inducción, lisis celular y DNasa I tratamiento
- INOCular transformantes frescos en 10 ml de medio LB (1% de Bacto triptona, extracto de levadura al 0,5%, 1% de NaCl) suplementado con glucosa (0,2%), ampicilina (100 mg / ml) y cloranfenicol (50 mg / ml). Incubar a 37 ° CO / N con agitación a 200 rpm.
- Inocular el precultivo 10 ml en 2 litros del medio LB suplementado como anteriormente. Cultivar las células a 37 ° C con agitación hasta una DO600 alcanza 0,5.
- Inducir la expresión de la proteína de fusión MBP-Mgm101 mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,3 mM. Cultivar las células con agitación a 30 ° C durante 5 h.
- Recoger las células por centrifugación usando un JA-10 rotor Beckman (5500 xg, 4 ° C, 10 min). Después de desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 30 ml de tampón de lisis (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 y EDTA 1 mM, pH 7,4) que contiene inhibidores de la proteasa (leupeptina 25 mM, pepstatina A 1 mM y PMSF 1 mM).
- Someter a ultrasonidos suspensión de células en hielo durante 20seg usando un procesador ultrasónico (Heat Systems, Modelo W-385) en el ciclo de trabajo del 50%, se deja enfriar en hielo durante 30 seg, y repetir 2x.
- Añadir 1 ml de DNAsa 1 stock a 2 mg / ml. Oscilar el lisado de células a 4 ° C durante 2 horas.
- Ajuste de NaCl a una concentración final de 500 mM.
- Eliminar los restos celulares por centrifugación a 10.000 xg a 4 ° C durante 30 min.
2. La purificación con cromatografía de afinidad de amilosa
- Equilibrar 1,5 ml de resina de amilosa (50% suspensión) en el tampón de lisis. Añadir la resina de amilosa equilibrada para el lisado de células. Agite suavemente a 4 º CO / N.
- Cargar la mezcla de lisado-resina en una columna de cromatografía de columna Econo-instalado en una habitación fría. Permita que las proteínas no unidas a pasar la columna por gravedad.
- Lavar la resina de amilosa con 300 ml del tampón de lavado I (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; 400 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF).
- Repetir el lavado con 150 ml de tampón de lavado II (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF).
- Añadir 5 ml de tampón de elución (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,4, y 0,2 mM de PMSF, 10 mM de maltosa) a la columna, incubar a 4 ° C durante 10 min, recoger el efluente y repita para más veces.
- Combinar los eluatos, determinar el rendimiento y la pureza de MBP-Mgm101 mediante la carga de una parte alícuota del eluido en un gel de SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie (Figura 4).
3. PreScission escisión de la proteasa y Cromatografía de intercambio catiónico
- Añadir 50 unidades de proteasa PreScission al eluato MBP-Mgm101. Realizar la escisión en 4 ° CO / N y permitir que continúe durante la diálisis contra el tampón de diálisis (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM de NaCl; DTT 2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF)
- Controlar la eficacia de la escisión en un gel de SDS-PAGE (Figura 5A).
- Cargue el troceados MBP-Mgm101 por múltiples inyectariones en un cartucho Mini Macro-Prep High S Bio-Escala conectados a un sistema de FPLC de doble paso biológica Bio-Rad.
- Iniciar la cromatografía de intercambio catiónico mediante la aplicación de un gradiente de paso de sal de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM y 1,000 mM de NaCl que se crea mediante la mezcla de tampón A (5 mM de NaCl, 10 mM de fosfato de Na, pH 7,2; 1 mM PMSF) y Tampón B (NaCl 1 M, 10 mM de fosfato de Na, pH 7,2; 1 mM de PMSF). Establecer la velocidad de flujo a 0,5 ml / min. Recoger la fracción Mgm101 y comprobar la pureza de la proteína en un gel de SDS-PAGE (Figura 5B).
4. Cromatografía de Exclusión de Tamaño
- Combinar las fracciones de proteínas de cromatografía de intercambio catiónico. Dializar la proteína en el tampón de equilibrado GF (MOPS 20 mM, pH 7,0; NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4; 5 mM 2-mercaptoetanol 0,2 mM PMSF).
- Se concentra la proteína con columna de centrifugación de ultrafiltración Vivaspin 15R para reducir el volumen a ~ 1 ml por centrifugación a 3000 xg a 4 ° C.
- Cargar Mgm101 ona calibrado Superose 6 prep columna grado equilibrada con el tampón de cromatografía (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7,4; 0,2 mM PMSF).
- Iniciar la exclusión por tamaño con el tampón de cromatografía se ejecute a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min.
- Reunir las fracciones de los purificados Mgm101 picos. Cargar alícuotas de las fracciones en un 12% SDS-PAGE para comprobar la calidad final de la proteína.
- Concentrado de la proteína con Vivaspin 6, a continuación, congelar rápidamente las muestras en N2 líquido y se almacena a -80 ° C.
- Usa los Mgm101 muestras dentro de 6-12 meses para el ensayo de unión al ADNmc (Figura 8) y para la visualización estructural por microscopía electrónica de transmisión (Figura 9).
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Representative Results
Mgm101 es una proteína Rad52 recombinación relacionada en la mitocondria. Rad52 ha sido ampliamente estudiado por su papel en la recombinación del ADN mitocondrial (Figura 1). Mgm101 recombinante se puede preparar mediante un procedimiento de tres pasos (Figura 2). Esto se ve facilitado por el uso de la estrategia de MBP-etiquetado que permite Mgm101 a ser expresado en una forma soluble y posteriormente liberado de la etiqueta mediante escisión proteolítica (Figura 3).
En una preparación típica, de aproximadamente 2-3 mg de fusión MBP-Mgm101 se puede recuperar a partir de 1 litro de cultivo bacteriano después de la cromatografía de afinidad de amilosa. En un gel de SDS-PAGE, MBP-Mgm101 se detecta como una banda principal de ~ 70 kDa (Figura 4). La contaminación por otras proteínas es mínima si la resina se lava adecuadamente antes de la elución. Después de la escisión por la proteasa PreScission, MBP y Mgm101 se separan y se muestran como bandas de 42 kDa y 28 kDa, respectivamente, enSDS-PAGE (Figura 5A). En el caso de la digestión incompleta, como se indica por la presencia de una banda de ~ 70 kDa, se aconseja una digestión prolongada con proteasa PreScission adicional.
Para la cromatografía de intercambio catiónico de troceados MBP-Mgm101, MBP no es retenida por la columna antes de la aplicación de la sal (Figura 6). Típicamente, Mgm101 se eluye con 500 mM de sal sin contaminación apreciable por MBP (Figura 5B). Un pequeño pico a 300 mM en algún momento es visible, lo que corresponde a una cantidad traza de fusión MBP-Mgm101 no escindida. Es posible que Mgm101 en esta fracción está ligada por la contaminación de ADN, lo que reduce la afinidad de unión a la columna. Por lo tanto, de intercambio catiónico es un paso necesario para reducir al mínimo la contaminación de ADN.
La figura 7 muestra el paso final de Mgm101 purificación por cromatografía de exclusión de tamaño. Los Mgm101 oligómeros eluyen normalmente en un pico monodispersedde ~ 400 kDa. Algunas formas mutantes de Mgm101 se ven a menudo con un aumento de tamaño entre V0 (volumen vacío) y el pico de 400 kDa. La razón de esto es todavía desconocido. Las mutaciones que afectan a la oligomerización de Mgm101 pueden inducir la formación de agregados que eluyen en las fracciones V0. Sin embargo, nunca hemos visto picos correspondientes a Mgm101 monómeros. Mgm101 monómeros son probablemente inestables en solución.
El purificado Mgm101 tiene una alta afinidad de unión a DNA de cadena simple (Figura 8). La afinidad de unión de DNA de cadena simple se puede estimar sobre la base de la valoración de la ssDNA libre en el gel. El complejo Mgm101/ssDNA migra pobremente de los pozos. Una posible explicación es que Mgm101 está cargado positivamente y la unión de múltiples subunidades de Mgm101 a ssDNA neutraliza sus cargas negativas que hace que los complejos de proteínas / ADN inmóvil bajo las condiciones de electroforesis. Cuando se prepara adecuadamente, Mgm101 une ssDNA con una Kd de ~ 200 nm.
Figura 9 muestra la visualización directa estructural de la Mgm101 purificado por tinción negativa microscopía electrónica de transmisión. Mgm101 recién preparado está presente principalmente como grandes anillos de oligómeros con un diámetro de ~ 20 nm. En cambio, las personas de edad Mgm101 muestras forman filamentos comprimidos. Estos filamentos no están formadas por el apilamiento simple de los anillos. Es evidente que hay un patrón helicoidal en los filamentos. Las condiciones que modulan el proceso de filamentación están actualmente bajo investigación. Es aconsejable que la calidad de la proteína se comprueba en SDS-PAGE después de la incubación a 4 ° C para las muestras envejecidas antes de ser analizados por microscopía electrónica.
Figura 1. Diagrama esquemático simplificado que muestra que Rad52 sirve como un mediador para la carga de la recombinasa Rad51 en el sitio de recombinación en una cacanónica vía de recombinación homóloga (panel izquierdo), y promueve sola línea de recocido independiente de Rad51 (panel derecho).
Figura 2. Esquema general para la preparación de Mgm101 recombinante. Mgm101 se expresa por primera vez en E. coli en una forma MBP-fundido. Las células bacterianas se lisaron por sonicación. Digestión con ADNasa I se aplica para reducir la contaminación de ADN. La fusión MBP-Mgm101 se purifica a continuación, a partir del lisado ADN-agotado mediante el uso de una columna de amilosa. Después de la escisión proteolítica, Mgm101 se suelta y se separa de MBP por cromatografía de intercambio catiónico. Este paso es necesario para reducir aún más la contaminación por ADN. La fracción eluida Mgm101 se purifica a continuación, a la homogeneidad pasándolo a través de una columna de Superose calidad preparativa 6.
Figura 3. Mapa físico del plásmido pMAL-c2E-MGM101 Mgm101-expresando. Se indica el sitio de escisión de la proteasa PreScission entre MBP y Mgm101. La escisión proteolítica rendimientos MBP y Mgm101 con un peso molecular de 42 y 28 kDa, respectivamente.
Figura 4. SDS-PAGE que muestra la pureza de la proteína de fusión MBP-Mgm101 después de la cromatografía de afinidad de amilosa. La concentración de proteína se determina midiendo la absorbancia a 280 nm y aproximadamente 5 g de Mgm101 se carga en el gel. El gel se tiñe con azul de Coomassie.
Figura 5. Análisis de SDS-PAGE de Mgm101. A) La liberación de Mgm101 de la proteína de fusión MBP-Mgm101 después de la escisión con la proteasa PreScission. Después de la digestión con la proteasa S / N, una parte alícuota que contenía aproximadamente 5 g de proteína se cargó en el gel. El gel se tiñe por el azul de Coomassie. Mgm101 migra ligeramente más lento que su tamaño esperado de 28 kDa, debido a la carga positiva global de la proteína con la condición de SDS-PAGE estándar. B) Mgm101 después de la separación de MBP por cromatografía de intercambio catiónico.
Figura 6. Cromatograma que muestra la separación de Mgm101 de MBP por cromatografía de intercambio catiónico. El troceados MBP-Mgm101 se inyecta en un Bio-Escala Mini Macro-Prep High S cartucho varias veces. Un gradiente de paso de sal de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM y 1,000 mM de NaCl, se aplica a continuación. Haga clic aquí para ver la figura larer .
Figura 7. Cromatograma que muestra el perfil de elución de Mgm101 oligómeros en una columna de Superose 6 calidad preparativa de calibrado. La cromatografía se lleva a cabo por a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min. El Mgm101 eluido se observa como un pico de ~ 400 kDa. V0: volumen vacío. Haz clic aquí para ver la figura larer .
Figura 8. Ensayos de movilidad electroforética que muestra que el Mgm101 purificado tiene una actividad de unión robusta a ssDNA. El 1,25 x 10 -3 2, 1 mM de EDTA, pH 8,0; 10% de glicerol; DTT 1 mM, 50 mg / ml de BSA y 1 mM de PMSF. Después de la incubación a TA durante 30 min, las muestras se cargan en un gel de acrilamida nativa 6% y se ejecutan en tampón TBE 0,5 X a 4 ° C.
Figura 9. Micrografías electrónicas muestran que la organización estructural de frescos (panel izquierdo) y la edad (panel derecho) Mgm101. Negativo tinción de microscopía electrónica de transmisión se lleva a cabo utilizando un-JEM 2100 microscopio electrónico de transmisión (JEOL) que opera a 200 kV. Para la tinción negativa de edad Mgm101, la proteína se almacena a 4 ° C en el tampón de GF (MOPS 20 mM, pH 7,0; 150 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 1 mM de EDTA, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF) durante 4 semanas antes de ser analizados. (Cortesía del Dr. Stephan Wilkens).
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Discussion
Ha sido un reto para producir una proteína estable, nativo recombinante Mgm101 de E. coli posiblemente debido a su insolubilidad en células bacterianas. En este informe, muestran que la estrategia de fusión MBP permite que la proteína que se expresa en un nivel razonablemente alto. Mediante el uso de tinción negativa microscopía electrónica de transmisión y cromatografía de exclusión por tamaño, hemos demostrado previamente que la proteína de fusión MBP forma oligómeros uniformes in vitro 18. Es posible que el plegamiento y oligomerización de Mgm101 pueden ser más lenta en las células bacterianas en comparación con la matriz mitocondrial. El unoligomerized Mgm101 puede formar rápidamente agregados que son tóxicas in vivo. MBP-etiquetado puede mantener Mgm101 en una conformación soluble que permite oligomerización productiva y disminuye su toxicidad.
Un criterio importante para la buena calidad de la preparación Mgm101 es tener un mínimo de contaminación por ADN. El A 280 / A
Hemos demostrado previamente que el almacenamiento de Mgm101 a 4 ° C durante unas pocas semanas induce la formación de filamentos helicoidales largos 17. El mecanismo de formación de filamentos no se entiende bien. El exceso de filamentación afecta a la solubilidad de la proteína. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que las alícuotas de proteína Mgm101 recién preparada se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido seguido de almacenamiento a -80 ° C. La actividad de unión a ADN de la proteína permanece sin cambios después de 6-12 meses de almacenamiento under estas condiciones.
Este protocolo también se puede usar para preparar proteínas mutantes de Mgm101. El estado de oligomerización y la estabilidad de Mgm101 son frecuentemente afectados por las mutaciones. Mutaciones leves pueden causar una precipitación parcial de las proteínas purificadas sobre la escisión de MBP. En estos casos, el aumento del volumen de cultivo de 6 litros puede permitir un rendimiento suficiente de las proteínas purificadas estables a partir de cromatografía de exclusión por tamaño. Mutaciones graves que afectan a la oligomerización pueden permitir la producción de las proteínas en una forma MBP-fundido, pero la proteína puede no ser estable después de la eliminación de la MBP.
En resumen, el protocolo actual es fiable que permite alto nivel de expresión de grandes Mgm101 anillos oligoméricas en E. coli. Este protocolo se puede adaptar a la producción de Mgm101 ortólogos 20, 21 y otras proteínas oligoméricas, especialmente cuando la solubilidad de las proteínas es baja en las células bacterianas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Stephan Wilkens para la ayuda en la microscopía electrónica de transmisión. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la concesión R01AG023731 Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
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