Summary
A proteína de levedura nucleóide mitocondrial, Mgm101, é uma proteína de recombinação de tipo rad52 que forma anéis grandes oligoméricas. Um protocolo é descrito para preparar Mgm101 solúvel recombinante utilizando a proteína de ligação à maltose (MBP), acoplado com a estratégia de marcação de permuta catiónica e a cromatografia de exclusão de tamanho.
Abstract
O gene foi identificado MGM101 há 20 anos pelo seu papel na manutenção do DNA mitocondrial. Estudos realizados em vários grupos têm sugerido que a proteína Mgm101 está envolvida na reparação de recombinação do DNA mitocondrial. Investigações recentes têm indicado que Mgm101 está relacionado com a família de proteínas do tipo de recombinação de RAD52. Estas proteínas formam anéis grandes oligómeros e promover a hibridação de moléculas de homólogo de ADN de cadeia simples. No entanto, a caracterização das Mgm101 tem sido dificultada pela dificuldade em produzir a proteína recombinante. Aqui, um processo de confiança para a preparação de proteínas recombinantes é descrita Mgm101. Maltose Binding Protein (MBP), marcado Mgm101 é expressa pela primeira vez em Escherichia coli. A proteína de fusão é inicialmente purificado por cromatografia de afinidade em amilose. Depois de ser libertado por clivagem proteolítica, Mgm101 é separada por cromatografia de troca PAM catiónica. Monodispersas Mgm101 é então obtidopor cromatografia de exclusão de tamanho. Um rendimento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultura bacteriana pode ser rotineiramente obtidos. O Mgm101 recombinante tem o mínimo de contaminação de ADN. As amostras preparadas são utilizadas com sucesso para a análise da imagem de partículas bioquímicos, estruturais e de Mgm101 único. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a preparação de outros grandes proteínas de ligação de ADN oligoméricas que podem ser deformadas e tóxico para as células bacterianas.
Introduction
A recombinação homóloga é importante para a reparação de quebras de cadeia dupla (DSB) e reticulações intercadeias, e para a re-introdução de garfos de replicação de ADN de replicação colapsadas 1. Na recombinação homóloga convencional, a reacção é catalisada pela central, as recombinases dependentes de ATP, incluindo RecA em procariotas, e Rad51 e Dmc1 em eucariotas 1-3. Estas recombinases formar filamentos nucleoprotéicos em ADNcs, que são essenciais para iniciar a pesquisa de homologia e invasão vertente dúplex dentro de moldes de ADN (Figura 1, painel da esquerda) 4-7. Além do esquema convencional, a recombinação homóloga pode também ocorrer de uma forma RecA/Rad51-independent (Figura 1, painel da direita). Por exemplo, a levedura RAD52 e Rad59 proteínas podem catalisar directamente o recozimento de cordões ssDNA complementares que são expostos por ressecção de dsDNA quebras. Este processo de recombinação, conhecido como cantarle vertente recozimento, geralmente não envolve o emparelhamento homólogo com modelos dsDNA. Após o recozimento, caudas heterólogos são removidos por exonucleases e entalhes são ligados para restaurar a continuidade do genoma 8-10. Reparação pelo único mecanismo de recozimento vertente é muitas vezes acompanhada de exclusões de seqüências genômicas entre as regiões diretamente repetidas.
Rad52 pertence a um grupo diverso de proteínas de recombinação que são comuns entre os bacteriófagos 11. Estas proteínas são também conhecidos como fio único Proteínas de recozimento (SSAPs), com base na sua actividade na promoção da hibridação de moléculas de homólogo de ADN de cadeia simples. Os melhores SSAPs bacteriófagos são caracterizadas e redp Erf do bacteriófagos λ e P22, RecT do profago rac Sak e a proteína do fago Lactococcus ul36. Os SSAPs são estruturalmente caracterizados por uma dobra β-β-β-α típico, apesar de similaridade é virtualmente indetectávelpoder em suas seqüências primárias. Todos eles formam grandes anéis de homo-oligoméricas de 10-14 simetria vezes in vitro 12-14. As implicações funcionais desta organização estrutural de ordem superior característica não é bem compreendida.
Estamos interessados em compreender o mecanismo de recombinação homóloga no genoma mitocondrial. Foram identificadas anteriormente MGM101 o gene que é essencial para a manutenção de mtDNA em Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 foi posteriormente se verificou estar associada com nucleoids mitocondriais e é necessário para a tolerância de mtDNA com agentes prejudiciais de ADN 16. No entanto, o estudo da Mgm101 foi retido na última década pela dificuldade de produzir Mgm101 recombinante. Recentemente, conseguiu produzir Mgm101 solúvel em grandes quantidades a partir de E. coli utilizando a estratégia de fusão MBP. Isso nos permitiu demonstrar que Mgm101 açõessemelhanças bioquímicas e estruturais com o rad52-família de proteínas 17,18. Neste relatório, um procedimento de purificação de três passos é descrito, que produz Mgm101for análises bioquímicas e estruturais homogéneos (Figura 2).
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Protocol
Estudos anteriores têm mostrado que os primeiros 22 amino-terminais de resíduos de Mgm101 são clivados após a importação para mitocôndrias 19. Para expressão em Escherichia coli, a grelha de leitura aberta MGM101 faltam os primeiros 22 codões é amplificado por PCR e colocados a jusante da sequência malE que codifica a proteína de ligação à maltose (MBP) com uma versão modificada do vector de expressão pMAL-C2E. Isto gera a fusão MBP-Mgm101 com um ligante contendo um local de clivagem para a protease PreScission (Figura 3). O plasmídeo foi construído pela primeira vez através da selecção E. transformantes coli sem IPTG e seleção azul / branco Xgal. O plasmídeo resultante pMAL-C2E-MGM101 é então introduzido na E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL seleccionando ampicilina e colônias resistentes cloranfenicol.
1. Expressão, indução, Lise celular e DNase I Tratamento
- Inocular transformantes fresco em 10 ml de meio LB (1% de Bacto-triptona, extracto de levedura 0,5%, NaCl a 1%) suplementado com glucose (0,2%), ampicilina (100 ug / ml) e cloranfenicol (50 mg / ml). Incubar a 37 ° CO / N com agitação a 200 rpm.
- Inocular os 10 ml de pré-cultura em 2 litros de meio LB suplementado como acima. Crescer as células a 37 ° C com agitação até DO600 atinge 0,5.
- Induzir a expressão da proteína de fusão MBP-Mgm101 adicionando isopropílico β-1-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a uma concentração final de 0,3 mM. Crescer as células com agitação a 30 ° C durante 5 horas.
- Recolher as células por centrifugação utilizando uma Beckman JA-10 do rotor (5500 xg, a 4 ° C, 10 min). Depois de deitar fora o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 30 ml de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 e EDTA 1 mM, pH 7,4) contendo inibidores de proteases (leupeptina a 25 uM, 1 uM de pepstatina A e PMSF 1 mM).
- Sonicate suspensão de células em gelo por 20seg utilizando um processador ultra-sónico (Sistemas de Calor, Modelo W-385) a 50% do ciclo, deixa-se arrefecer em gelo durante 30 segundos, e repetir 2x.
- Adicionar 1 ml de DNAse um estoque de 2 mg / ml. Balance o ligado celular a 4 ° C durante 2 horas.
- Ajuste de NaCl a uma concentração final de 500 mM.
- Remover os detritos celulares por centrifugação a 10.000 xg, a 4 ° C durante 30 min.
2. Purificação com amilose Affinity Chromatography
- Equilibrar 1,5 ml de resina de amilose (50% de pasta) no tampão de lise. Adicionar a resina de amilose equilibrada ao lisado celular. Balançar suavemente a 4 ° CO / N.
- Coloque a mistura lisado-resina sobre uma coluna de cromatografia de coluna Econo-instalado em uma sala fria. Permitir que as proteínas não ligadas a passar da coluna por gravidade.
- Lava-se a resina de amilose com 300 ml de tampão de lavagem I (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 400 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM).
- Repetir a lavagem com 150 ml de tampão de lavagem II (T 20 mMris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM).
- Adicionam-se 5 ml de tampão de eluição (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM, maltose a 10 mM), para a coluna, incubar a 4 ° C durante 10 minutos, recolher eluato e repita para mais vezes.
- Combina-se os eluatos, determinar o rendimento e a pureza da MBP-Mgm101 por carregamento de uma aliquota de eluato num gel de SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie (Figura 4).
3. PreScission Cleavage Protease e cromatografia de troca catiônica
- Adicionar 50 unidades de protease PreScission ao eluato MBP-Mgm101. Realizar a clivagem, a 4 ° CO / N e permitir que ele continue durante a diálise contra o tampão de diálise (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 100 mM; DTT 2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM)
- Verificar a eficiência da clivagem num gel de SDS-PAGE (Figura 5A).
- Carregue o clivada MBP-Mgm101 por vários injetariões sobre um cartucho Mini Macro-Prep S alta Bio-Scale ligada a um sistema FPLC de fluxo duplo biológica da Bio-Rad.
- Iniciar a cromatografia de permuta catiónica por aplicação de um gradiente por passos de sal de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM e 1000 mM de NaCl que é criado através da mistura de tampão (NaCl a 5 mM, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2, 1 PMSF mM) e tampão B (NaCl 1 M, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2, 1 mM de PMSF). Ajuste a velocidade de fluxo de 0,5 ml / min. Recolher a fracção Mgm101 e verificar a pureza da proteína num gel de SDS-PAGE (Figura 5B).
4. Cromatografia de Exclusão por Tamanho
- Combine as frações protéicas de cromatografia de troca catiônica. Dializar a proteína em tampão de equilíbrio GF (MOPS 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, 5 mM de 2-mercaptoetanol, PMSF 0,2 mM).
- Concentra-se a proteína com VIVASPIN coluna de spin 15R ultrafiltração para reduzir o volume de ~ 1 ml por centrifugação a 3000 xg, a 4 ° C.
- Coloque o Mgm101nd calibrado coluna de Superose 6 de grau prep equilibrada com o tampão de cromatografia (20 mM de MOPS, pH 7,0, NaCl 150 mM, 5 mM de mercaptoetanol; β-EDTA 1 mM, pH 7,4, PMSF 0,2 mM).
- Iniciar a exclusão de tamanho com o tampão de cromatografia correr a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min.
- Recolha as frações dos purificados Mgm101 picos. Carregar alíquotas das fracções em 12% SDS-PAGE para verificar a qualidade final da proteína.
- Concentra-se a proteína com VIVASPIN 6, em seguida, congelar rapidamente as amostras em N2 líquido e armazenam-se a -80 ° C.
- Use as Mgm101 amostras dentro de 6-12 meses para o ensaio de ligação de ADNcs (Figura 8) e para visualização estrutural por microscopia electrónica de transmissão (Figura 9).
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Representative Results
Mgm101 é uma proteína de recombinação RAD52 relacionada nas mitocôndrias. RAD52 tem sido extensivamente estudada pelo seu papel na recombinação do ADN mitocondrial (Figura 1). Mgm101 recombinante podem ser preparados por um procedimento em três passos (Figura 2). Isto é facilitado pela utilização da estratégia de MBP-marcação permite que Mgm101 a ser expresso numa forma solúvel e subsequentemente libertado a partir da etiqueta por clivagem proteolitica (Figura 3).
Numa preparação típica, aproximadamente 2-3 mg de MBP-Mgm101 fusão pode ser recuperado a partir de 1 litro de cultura bacteriana após cromatografia de afinidade de amilose. Em um gel de SDS-PAGE, MBP-Mgm101 é detectado como uma banda principal de ~ 70 kDa (Figura 4). A contaminação com outras proteínas é mínima, se a resina é lavada de forma adequada antes da eluição. Após a clivagem por protease PreScission, MBP e Mgm101 são separados e apresentados como bandas de 42 kDa e 28 kDa, respectivamente,SDS-PAGE (Figura 5A). No caso da digestão incompleta, tal como indicado pela presença de uma banda de ~ 70 kDa, uma digestão prolongada com protease PreScission adicional é aconselhada.
Para a cromatografia de clivada MBP-Mgm101 de permuta catiónica, de MBP não é retido pela coluna antes da aplicação do sal (Figura 6). Tipicamente, Mgm101 é eluida com 500 mM de sal, sem contaminação notável por MBP (Figura 5B). Um pequeno pico a 300 mM é por vezes visível, o que corresponde a uma quantidade vestigial de fusão não clivada MBP-Mgm101. É possível que Mgm101 nesta fracção é ligado por meio da contaminação do ADN, o que reduz a afinidade de ligação à coluna. Assim, a troca de cátions é um passo necessário para minimizar a contaminação por DNA.
A Figura 7 mostra o passo final de Mgm101 purificação por cromatografia de exclusão de tamanho. Os oligómeros Mgm101 tipicamente eluir num pico monodispersade ~ 400 kDa. Algumas formas mutantes de Mgm101 são muitas vezes vistos com tamanhos maiores entre V0 (volume de vazios) eo pico de 400 kDa. A razão para isto é desconhecida. As mutações que afectam a oligomerização de Mgm101 podem induzir a formação de agregados que eluíram nas fracções V0. No entanto, nunca vimos picos correspondentes a Mgm101 monoméricas. Mgm101 monómeros são susceptíveis instável em solução.
A purificada Mgm101 tem uma elevada afinidade de ligação para ssDNA (Figura 8). A afinidade de ligação para ssDNA pode ser estimada a partir da titulação da ssDNA livre no gel. O complexo Mgm101/ssDNA migra mal para fora dos poços. Uma possível explicação é que Mgm101 é carregada positivamente e a ligação de múltiplos subunidades de Mgm101 a ssDNA neutraliza suas cargas negativas, que faz com que os complexos de proteína / ADN imobilizado sob as condições de electroforese. Quando devidamente preparada, Mgm101 liga ADNcs com uma Kd de aproximadamente 200 nM.
Figura 9 mostra a visualização estrutural direto da Mgm101 purificado por microscopia eletrônica de transmissão mancha negativa. Mgm101 preparada está presente principalmente como grandes anéis oligoméricas com um diâmetro de ~ 20 nm. Em vez disso, as amostras envelhecidas Mgm101 formar filamentos comprimidos. Estes filamentos não são formados pelo empilhamento dos anéis simples. Existe claramente um padrão helicoidal nos filamentos. As condições que modulam o processo filamentação estão atualmente sob investigação. É aconselhável que a qualidade da proteína é verificada em SDS-PAGE após a incubação a 4 ° C para as amostras envelhecidas antes de serem analisadas por microscopia electrónica.
Figura 1. Diagrama esquemático simplificado mostrando rad52 que serve como um mediador para o carregamento da Rad51 recombinase no local de recombinação, em um canonical via recombinação homóloga (painel à esquerda), e promove o único fio de recozimento independente de Rad51 (painel direito).
Figura 2. Esquema geral para a preparação de Mgm101 recombinante. Mgm101 é expressa pela primeira vez em E. coli na forma de MBP-fundido. As células bacterianas são lisadas por sonicação. ADNase I de digestão é aplicado para reduzir a contaminação do ADN. A fusão MBP-Mgm101 é então purificada a partir do lisado de ADN-empobrecido usando uma coluna de amilose. Após a clivagem proteolítica, Mgm101 é libertado e separada de MBP por cromatografia de permuta catiónica. Esta etapa é necessária para reduzir ainda mais a contaminação pelo ADN. A fracção eluida Mgm101 é então purificado até à homogeneidade por passagem através de uma coluna de Superose 6 de grau prep.
Figura 3. Mapa físico do Mgm101 expressando plasmídeo pMAL-C2E-MGM101. O sítio de clivagem para a protease PreScission entre MBP e Mgm101 é indicado. A clivagem proteolítica rendimentos Mgm101 MBP e com um peso molecular de 42 e 28 kDa, respectivamente.
Figura 4. SDS-PAGE demonstrando a pureza da proteína de fusão MBP-Mgm101 após cromatografia de afinidade de amilose. A concentração de proteína é determinada por medição da absorvância a 280 nm, e cerca de 5 ug de Mgm101 é carregado no gel. O gel é corado com azul de Coomassie.
Figura 5. Análise de SDS-PAGE de Mgm101. A) A libertação de Mgm101 a partir da proteína de fusão MBP-Mgm101 após a clivagem com a protease PreScission. Após a digestão com a protease de O / N, uma alíquota contendo cerca de 5 ug de proteína é carregada no gel. O gel é corado pelo azul de Coomassie. Mgm101 migra ligeiramente mais lento do que o seu tamanho esperado de 28 kDa, devido a carga positiva global da proteína sob a condição padrão de SDS-PAGE. B) após a separação do Mgm101 MBP por cromatografia de troca catiónica.
Figura 6. Cromatograma que mostra a separação de Mgm101 de MBP por cromatografia de troca catiónica. A MBP-clivada Mgm101 é injectado num bio-Escala Mini Macro-Prep S alta cartucho várias vezes. Um gradiente de passo de sal de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mm e 1000 mm de NaCl é então aplicada. Clique aqui para ver a figura larer .
Figura 7. Cromatograma que mostra o perfil de eluição dos oligómeros Mgm101 numa coluna de Superose 6 de grau prep calibrado. A cromatografia é realizada a um caudal de 0,5 ml / min. O Mgm101 eluída é observada como um pico de ~ 400 kDa. V0: volume vazio. Clique aqui para ver a figura larer .
Figura 8. Ensaio de deslocamento da mobilidade electroforética que mostra que o Mgm101 purificada tem uma actividade de ligação robusta a ssDNA. A 1,25 x 10 -3 2; EDTA 1 mM, pH 8,0, 10% de glicerol; DTT 1 mM, 50 ug / ml de BSA, e 1 mM de PMSF. Após incubação à temperatura ambiente durante 30 min, as amostras são carregadas num gel de acrilamida 6% nativo e executados em tampão TBE 0,5 X, a 4 ° C.
Figura 9. Eletromicrografias mostrando que a organização estrutural de fresco (painel à esquerda) e idade (painel à direita) Mgm101. A microscopia electrónica de transmissão de coloração negativa é efectuada utilizando um JEM-2100 microscópio electrónico de transmissão (Jeol) funcionando a 200 kV. Para a mancha de idade negativo Mgm101, a proteína é armazenada a 4 ° C no tampão de GF (20 mM de MOPS, pH 7,0, 150 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 1 mM de EDTA, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM), durante 4 semanas, antes de serem analisadas. (Cortesia do Dr. Stephan Wilkens).
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Discussion
Foi um desafio para a produção de um estábulo, nativo da proteína recombinante a partir de E. Mgm101 coli, possivelmente devido à sua insolubilidade em células bacterianas. Neste relatório, que mostram que a estratégia de fusão MBP-permite que a proteína seja expressa com um nível razoavelmente elevado. Por meio da coloração de microscopia electrónica de transmissão negativo e cromatografia de exclusão de tamanho, mostrámos previamente que a proteína de fusão MBP-forma oligómeros uniformes in vitro 18. É possível que a dobragem e oligomerização de Mgm101 pode ser mais lenta em células de bactérias em comparação com a matriz mitocondrial. O unoligomerized Mgm101 podem formar rapidamente agregados que são tóxicas in vivo. MBP-tagging pode manter Mgm101 em uma conformação solúvel que permite oligomerization produtivo e diminui sua toxicidade.
Um critério importante para uma boa qualidade Mgm101 preparação é ter o mínimo de contaminação por ADN. O A 280 / A
Nós mostramos anteriormente que o armazenamento de Mgm101 a 4 ° C, durante algumas semanas, induz a formação de longos filamentos helicoidais 17. O mecanismo de formação de filamentos não é bem compreendida. Mais-filamentação afecta a solubilidade da proteína. Portanto, é altamente recomendável que alíquotas de recém-preparado proteína Mgm101 são rapidamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ° C. A actividade de ligação ao ADN da proteína permanece inalterada após 6-12 meses de armazenamento under estas condições.
Este protocolo pode também ser utilizada para preparar proteínas mutantes de Mgm101. O estado de oligomerização ea estabilidade do Mgm101 são frequentemente afetados pelas mutações. Mutações leves podem causar uma precipitação parcial das proteínas purificadas mediante a clivagem da MBP. Nestes casos, o aumento do volume de cultura de 6 litros, pode permitir que o rendimento suficiente das proteínas purificadas estáveis a partir de cromatografia de exclusão de tamanho. Mutações graves que afectam a oligomerização pode permitir que a produção das proteínas de uma forma de MBP-fundidos, mas sim a proteína pode não ser estável após remoção da MBP.
Em resumo, o protocolo actual é fiável, que permite a expressão de alto nível de grandes Mgm101 anéis oligoméricos em E. coli. Este protocolo pode ser adaptado para a produção de Mgm101 ortólogos 20, 21 e de outras proteínas oligoméricas, em especial quando a solubilidade dessas proteínas é reduzida nas células bacterianas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos Stephan Wilkens ajuda para microscopia eletrônica de transmissão. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant R01AG023731.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
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