Çok yöntemi görüntüleme küçük hayvan modellerinde bakteri kolonizasyonu eğitim için değerli bir yaklaşımdır. Bu protokol bioluminescent ile farelerin enfeksiyonu özetliyor<em> Citrobacter rodentium</em> Ve bakteriyel kolonizasyonu boyuna izlenmesi bir 4D film oluşturmak için μCT görüntüleme ile kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi<em> C. rodentium</em> Enfeksiyon.
Bu protokol boyuna enfeksiyon döngüsünün dört boyutlu (4D) film oluşturmak için entegre μCT (DLIT-μCT) ile kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi ve bu verilerin sonraki kullanım kullanarak biyolüminesens bakteriyel enfeksiyon izlemek için gereken adımları açıklar. 4D enfeksiyon film geliştirmek ve bir IVIS Spectrum CT kullanarak bakteriyel enfeksiyon çalışmaları için DLIT-μCT görüntüleme doğrulamak için, biz bioluminescent C ile enfeksiyon kullanılan Farelerde kendini sınırlayan kolit neden rodentium. Bu protokol, biyolüminesans C ile farelerin enfeksiyon anahat rodentium ve günlük DLIT-μCT görüntüleme ve 8 gün boyunca dışkı bakteriyel numaralandırma tarafından kolonizasyon non-invazif izleme.
IVIS Spectrum BT kullanımı tek bir görüntüleme platformu kullanarak optik ve μCT taramaları kesintisiz ortak kayıt kolaylaştırır. Düşük doz μCT yöntemi farelerin görüntüleme sağlarkümülatif radyasyon eserler neden olmadan 3 boyutlu olarak bioluminescent bakteri odaklarının ayrıntılı anatomik lokalizasyonu sağlayan enfeksiyon sırasında birden fazla zaman noktalarında. Önemlisi, enfekte farelerin 4D film in vivo bakteriyel kolonizasyon dinamikleri izlemek için güçlü bir analitik araç sağlar.
Küçük hayvan modellerinde, özellikle bu kullanarak farelerde, rutin bakteriyel patogenezi araştırılması veya antibiyotikler, probiyotikler, prebiyotikler ve aşılar 1-7 gibi enfeksiyonlar, için müdahale stratejileri test etmek için kullanılır. Küçük hayvan enfeksiyonlarından ana deneysel okuma. Patojen yük, enfeksiyon mekansal ve zamansal lokalizasyonu ve enfekte organizmanın immün yanıt değişiklikler in vivo optik görüntülemede bulaşıcı hastalık araştırmaları için değerli bir araçtır ve birden fazla izlemek için kullanılabilir haberci genlerin kullanımı (lusiferaz, floresan proteinler, beta-laktamaz, vb) aracılığı ile deneysel okuma, floresan boyalar, nanopartiküller ya da kemiluminesan probları, bir protein, biyolojik bir süreci veya mikroorganizma 6'ya hedeflemiştir.
Biyoparlaklık görüntüleme (BLI) patojenik bakterileri tarafından, örneğin, fare ve sıçan gibi küçük hayvanlar, bir kolonizasyon izlemek için kullanılan optik bir görüntüleme yöntemidirria 3,6,8,9. Fareler böyle Photorhabdus luminescens lüks CDABE operonunun olarak, lusiferaz. Bu bakteriler daha sonra in vivo görüntüleme sistemi 3,6,9 merkezli bir CCD kullanarak hafif üretim yoluyla tespit edilebilir ifade rekombinant bakteri bulaşmış. Önemlisi, sadece metabolik olarak aktif mikro-organizmaların tek uygun bakteri hücrelerinin bu yöntem 10,11 ile tespit edilir, yani biyolüminesens (BL) bulunmaktadır. 2B, BLI BL kaynağının konumunu kullanarak sinyali 8 yayılan hayvanın yüzey anlaşılmaktadır. In vivo BL odaklar kesin anatomik lokalizasyon aksine organların 3,6,9 ve ex vivo analizi ile belirlenmelidir, kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi (DLIT) BL bir nicel 3D rekonstrüksiyon derlemek için kullanılabilir kaynak 12. DLIT alınan BL görüntüleri toplayarak gerçekleştirilir tanımlanan dar bant-geçiş optik filtreleri kullanarak vedaha sonra bir yaygın optik tomografi 3 boyutlu rekonstrüksiyon algoritması 1,7,12,13 içine giren.
Şu anda, çok modalite görüntüleme ex vivo analizi için gerek kalmadan in vivo bioluminescent odaklarının gerçek non-invaziv anatomik lokalizasyon almak için kullanılabilen tek yöntemdir. Son zamanlarda, DLIT bir arada bir probiyotik bakteri 7 ile koruyucu tedavi sonrasında Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonizasyon dinamikleri değerlendirmek için μCT görüntüleme ile birlikte kayıtlı kullanılır. C rodentium enteropatojenik E. coli ve enterhemorrhagic 14 model insan enfeksiyonu için kullanılan bir sıçangil özel enterik patojendir. ° C. rodentium enfeksiyon genellikle hafif kilo kaybı, ishal, polarize Th1 immün yanıt ve kolon kript hiperplazisi de dahil olmak üzere ve bağlama farklı patolojik değişiklikler ve silen lezyon Formatı ile ilişkili kolit, neden14. Bu, ek olarak, C. rodentium patogenezi iyice Bu bakteri çok yöntem görüntüleme 3,4,7 ile kullanım için ideal bir model mikroorganizma yapma, iyi belgelenmiştir C57BL/6J farelerde BLI ve kolonizasyon dinamikleri kullanılarak incelenmiştir.
Bu protokol tek bir multimodalite görüntüleme platformu, IVIS Spektrum BT ve non-invaziv bu enfeksiyonun gerçek dinamiklerini gösteren bir 4D filmin nesil kullanarak bir bakteriyel enfeksiyon entegre DLIT-μCT görüntüleme için bir metodoloji anahat ilk.
Bakteriyel enfeksiyon 4D film çok yöntemi görüntüleme büyük miktarda veri hızlı ve kolay görselleştirmek ve yorumlamak için bir araç sağlar. Bu teknik bir enfeksiyon tek bir fare aracılığıyla yayılır nasıl detaylı analiz kolaylaştırır ve araştırmak için kullanılabilir nasıl ev sahibi ya da bakteri genleri veya uzunlamasına çalışma 7 sırasında özellikle müdahale stratejilerinin etkisi bakteri yükü, dağıtım, ve yerelleştirme silinmesi. Bu videolar da yararlı öğretim yardımcıları ve kamuoyuna bilgi yaymak için bir araç sağlar.
DLIT-μCT görüntüleme ve enfeksiyon 4D Video derlemek yeteneği elde edilen verilerin kalitesini etkileyebilecek bu protokolde pek çok kritik adım vardır. Bu protokolün en önemli parçası C ile farelerin başarılı ve homojen bir enfeksiyondur rodentium. Bu çalışma için kullanılan fareler 18-20 g arasında ve esastır bakteriyelarteriyel mikroorganizma taze hazırlanmış ve yaklaşık 5 x 10 9 CFU, daha önce 2,3 açıklanmıştır. Önce farelerin enfeksiyona bu inokulum Spektrum BT kullanarak ve bir kez aşı hazırlanmıştır biyolüminesens olup olmadığını kontrol etmek önemlidir her fare fareler benzer bulaşıcı dozlarda aldığınızdan emin olmak için zorla ağız yolundan verilmiştir önce, sürekli homojenize edilmelidir. Farelerin DLIT-μCT görüntüleme Yaşam Resim 4.3.1 yazılımında otomatik pozlama fonksiyonu otomatik olarak iyi gürültü üzerinde olması sinyal için optimize edilmiş görüntüleme parametreleri belirler, böylece optimize edilmiştir. Ancak, otomatik pozlama fonksiyonu yordamda açıklandığı gibi değiştirilmesi gerekir kullanıcı tanımlı ayarları ve parametreleri dayanır. Bu takdirde seçerler için Spectrum CT fabrika ayarlarını görüntüleme tümör ifade etmek için programlanmış gibi, enfeksiyon belirgin bir ilerleme neden olmadığını toplanan fotonların az sayıda yoksul görüntüleri neden olacaktırateşböceği lusiferaz. Rekonstrüksiyon 560-620 nm, bu nedenle yeniden dahil etmek daha güvenilir veriler, simüle ve ölçülen veri arasındaki en iyi anlaşma vermek ve kullanıldı.
DLIT-μCT kullanımına ilişkin bir sınırlama μCT tarama gelen bu iyonize radyasyon uzunlamasına bir çalışma 18 kümülatif bir alt ölümcül radyasyon hasarı neden olur. Alt öldürücü radyasyona maruz kalma DNA hasarı ve iç organlarda 19 apoptozise yol, bağışıklık yanıtı zayıflatabilir. Iyonize radyasyon için LD 50/30 farelerin fare gerginlik ve yaşa bağlı olarak 5 ila 7 Gy arasında 18,20,21 kullanıldığı, aşılırsa Sonuçta, kümülatif alt ölümcül radyasyon hasarı ölüme neden olabilir. Kapsayıcı ilke konservatif doz tahmin etmek olduğu iyonize radyasyondan moleküler hasar bazı, iyileşmek de, bu genellikle çalışma planlama muhasebeleştirilir değildir. Bunun yerine, amacı çok bel olarak kalmaktırmümkün olduğunca ow bu sınırları hala çalışma hedeflerine ulaşma süre. Bunun nedeni, enfeksiyon için normal bir bağışıklık tepkisinin Bu çalışmada özellikle önemlidir, görüntüleme ve transgenik hayvanlarda bağışıklık gibidir, ya da ağır enfekte olmasından sıklığı iyonlaştırıcı radyasyona karşı daha duyarlı olabilir.
Enfeksiyon 4D film oluşturmak için deney planlama, bu deney uzunluğu dikkate alınması önemlidir, μCT sayısı kullanılan fare suşu için iyonizan radyasyon için bu süre sırasında gerekli tarar ve LD 50/30. Bu bakteri tespit sınırları ve görüntüleme kez etkileyecek gibi DLIT-μCT bir başka potansiyel sınırlama, kullanılan bakteri suşu içinde muhabir ifade gücüdür. BLI için daha önce gösterdiği gibi son derece, araştırmacılar tamamen kışkırtıcı bakteri türleri geçerli kullanmanız önerilir, ama maksimum lux operon'u ifade için optimize edilmiştir2,3.
4D görüntüleme mevcut tasarım için bir uyarı her film farklı foton ölçekleme sahip bireysel DLIT-μCT taramalar oluşur olmasıdır. BL odaklar lokalizasyonu, ya da yoğunluğu değişiklikleri ince ise bu yorumlamak görüntüleri zorlaştırabilir veya birden fazla zayıf odaklar çevrili bir yoğun BL odak varsa. Bu nedenle, boyuna görsel için, bu zaman noktalarında renk çubukları tutarlı tutmak için önemlidir.
Enfeksiyon 4D film kavramı her bir uygun şekilde etiketlenmiş bakteriyel bir patojene karşı uygulanabilir. Bu tekniğin gelecekteki gelişimi enfeksiyon ev sahipliği yanıtları incelemektir kızılötesi prob yakın floresan biyolüminesens bakteriyel patojenler ve enjektabl bir arada kullanarak enfeksiyonu ev sahipliği yanıtların soruşturma kolaylaştırmak için floresan görüntüleme tomografi (dolaşmak) yanı sıra DLIT kullanmak hedefleyecektir. Buna ek olarak bu, bu protokolde sadeceenfeksiyon 4D filmleri oluşturmak için biyolüminesans bakterilerin kullanımını tarif eder. Bununla birlikte, bazı durumlarda, biyolüminesans muhabir enfeksiyon sırasında ana genetik araştırmak için de kullanılabilir, böylece iRFP ile etiketlendi örneğin, floresan etiketli bakteriler kullanmak gerekli olabilir. Önemlisi, DLIT / Flit-μCT birleştirerek çok yöntemi görüntüleme kullanımı bize non-invaziv azaltılması, arıtma, ve bilimsel araştırmalarda hayvanların kullanımı yerine önemli ölçüde katkı sağlayacak olan bir bakteriyel enfeksiyon sırasında birden çok parametre araştırmak sağlayacak olarak NC3R girişimi (özetlenen http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
Imperial College in vivo görüntüleme tesiste MRC tarafından finanse edildi.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |