Multi-метод визуализации является ценным подход к изучению бактериальной колонизации в малых животных моделях. Этот протокол описывает инфекции мышей с биолюминесцентного<em> Citrobacter rodentium</em> И продольный мониторинг бактериальной колонизации использованием композитных 3D рассеянный свет томографии с μCT визуализации для создания фильма из 4D<em> C. rodentium</em> Инфекцией.
Этот протокол описывает шаги, необходимые для контроля продольно биолюминесцентное бактериальной инфекции использованием композитных 3D рассеянный свет томографии с интегрированным μCT (DLIT-μCT) и последующее использование этих данных для создания четырехмерной (4D) фильм инфекции цикла. Разработать фильмы 4D инфекции и для проверки DLIT-μCT визуализации для исследования бактериальной инфекции, используя IVIS Спектр CT, мы использовали инфицирование биолюминесцентными C. rodentium, что приводит к самоограничения колита у мышей. В этом протоколе, мы наметим заражение мышей с биолюминесцентными C. rodentium и неинвазивного мониторинга колонизации ежедневно DLIT-μCT изображений и численности бактерий из фекалий в течение 8 дней.
Использование IVIS Спектр КТ облегчает бесшовных совместного регистрации оптических и μCT сканирований с использованием одной платформы визуализации. Низкой модальности μCT дозы позволяет изображениями мышейв различные моменты времени во время инфекции, предоставление подробной анатомической локализации биолюминесцентных бактериальных очагов в 3D, не вызывая артефакты из полезных излучения. Важно отметить, что 4D фильмы зараженных мышей обеспечивают мощный аналитический инструмент для мониторинга динамики бактериальной колонизации в естественных условиях.
Малые животных моделей, в частности тех, которые используют мышей, которые обычно используются для исследования бактериальных патогенез или для проверки стратегии вмешательств на инфекции, такие как антибиотики, пробиотиков, пребиотиков и вакцины 1-7. Основные экспериментальные показания от небольших инфекций животного патогенов, пространственной и временной локализации инфекции и изменений в иммунной реакции зараженного организма. В естественных оптических изображений представляет собой ценный инструмент для исследования инфекционных заболеваний и может быть использовано для контроля нескольких экспериментальные считывания с использованием репортерных генов (люциферазы, флуоресцентные белки, бета-лактамазы, и т.д.), флуоресцентные красители, наночастицы или хемилюминесцентного зондов, направленных на белок, биологических процессов или микроорганизм 6.
Биолюминесценции изображений (BLI) является оптический метод визуализации используется для контроля колонизации мелких животных, таких как мыши и крысы, патогенными бактериРИА 3,6,8,9. Мышей инфицировали рекомбинантными бактерий, экспрессирующих люциферазы, такие, как оперон люкс CDABE от Photorhabdus luminescens. Эти бактерии могут быть обнаружены с помощью их свет производства с использованием CCD основанный в естественных изображений система 3,6,9. Важно отметить, что только метаболически активные микроорганизмы биолюминесцентными (BL), а это означает только жизнеспособные бактериальные клетки обнаруживаются этой методологии 10,11. Использование 2D БЛИ, расположение источника BL выводится из поверхности животного, где сигнал испускается 8. Точная анатомическая локализация очагов BL в естественных условиях должна быть определена через экс анализа естественных органов 3,6,9 В отличие от композитных 3D рассеянный свет томографии (DLIT) могут быть использованы для составления количественного 3D-реконструкция BL Источник 12. DLIT осуществляется путем сбора BL съемка с использованием определен узких полосовых оптических фильтров иВпоследствии ввода их в диффузионной оптической томографии 3D алгоритм реконструкции 1,7,12,13.
В настоящее время, мульти-метода визуализации является единственной методологии доступны, чтобы получить истинный неинвазивной анатомической локализации биолюминесцентного очагов в естественных условиях без необходимости бывший анализ естественных условиях. В последнее время мы использовали комбинацию DLIT совмещались с изображениями μCT оценить Citrobacter rodentium (C. rodentium) колонизации динамику после профилактического лечения с пробиотические бактерии 7. C. rodentium является мышиным конкретного возбудителя кишечных использоваться для моделирования инфицирования человека энтеропатогенных enterhemorrhagic и кишечная палочка 14. C. rodentium инфекция вызывает колит, обычно связанных с мягким потеря веса, диарея, поляризованные Th1 иммунного ответа и различные патологические изменения, в том числе толстой гиперплазии крипт и присоединение и скромный поражения formatiна 14. В дополнение к этому, C. rodentium патогенезе была хорошо изучена благодаря использованию BLI и ее динамика колонизации у мышей C57BL/6J хорошо документированы, что делает эту бактерию идеальным микроорганизмов модель для использования с несколькими метода визуализации 3,4,7.
Этот протокол является первым наметить методика комплексного DLIT-μCT изображений бактериальной инфекции с помощью одной платформы визуализации комплексного, IVIS Спектр CT, и поколение 4D кино показывает истинную динамику этой инфекции неинвазивным.
4D кино бактериальной инфекции представляет собой полезный инструмент для визуализации и интерпретации больших объемов многорежимные данные изображения быстро и легко. Эта техника облегчает подробный анализ того, как инфекция распространяется через индивидуальный мыши и может быть использован для исследования как удаление хоста или бактериальные гены или конкретных стратегий вмешательства эффект бактериальной нагрузки, распределения и локализации во время продольного исследования 7. Эти видео также предоставить полезные учебные пособия и средства распространения информации для общественности.
Есть несколько важных шагов в этом протоколе, которые могут повлиять на качество данных, полученных из DLIT-μCT изображений и возможность компилировать видео 4D инфекции. Наиболее важной частью этого протокола является успешным и однородной инфекции мышей с C. rodentium. Важно, что у мышей, используемых для исследования, в возрасте 18-20 г и что бактеририал посевного свежеприготовленный примерно 5 х 10 9 КОЕ, как описано выше 2,3. До инфекции мышей важно, чтобы проверить, что инокулята биолюминесцентного использованием спектра КТ и один раз инокулята было подготовлено, оно должно непрерывно гомогенизировали перед каждой мыши через желудочный зонд для того, чтобы мыши получают аналогичный инфекционных доз. DLIT-μCT изображений мышей были оптимизированы так, чтобы функция автоматической экспозиции в живых программного обеспечения 4.3.1 Изображение автоматически определяет оптимизированные параметры визуализации для сигнала, который будет значительно выше шум. Тем не менее, функция автоматической экспозиции зависит от пользовательских настроек и параметров, которые должны быть изменены, как описано в процедуре. Неспособность сделать это приведет к плохим изображения с более низким числом фотонов собрано, что не приводит к очевидным прогрессирования инфекции, как Спектр КТ заводские настройки автоэкспозиции запрограммированы для работы с изображениями опухоли, экспрессирующиелюциферазы светляков. Реконструкция осуществляется с использованием 560-620 нм дать лучшее согласование между смоделированных и измеренных данных и, следовательно, являются более надежных данных для включения в реконструкции.
Ограничение на использование DLIT-μCT в том, что ионизирующее излучение из проверки μCT вызывает сублетальных радиационных повреждений, что является кумулятивным над продольное исследование 18. Сублетальные радиационное облучение может ослабить иммунную реакцию, вызывают повреждение ДНК и апоптоз во внутренних органах 19. В конечном счете, совокупный сублетальных радиационное повреждение может привести к смерти, если LD 50/30 за ионизирующим излучением превышении которого от 5 до 7 Гр, в зависимости от штамма мыши и возраста мышей, используемых 18,20,21. Хотя некоторые из молекулярных ущерба от ионизирующего излучения может излечить, так как главным принципом является оценить дозу консервативно, это обычно не учитывается в исследовании планирования. Вместо этого, цель состоит в том, чтобы остаться, насколько белой эти пределы, как это возможно, но достижение цели исследования. Это особенно важно в данном исследовании из-за нормального иммунного ответа на инфекцию, частоту изображений, и тот факт, что трансгенные, иммуно-состоят или сильно зараженные животные могут быть более чувствительны к ионизирующей радиации.
При планировании эксперимента, чтобы генерировать 4D кино инфекции, важно рассмотреть длины эксперимента, количество μCT сканирует требуется в течение этого периода и LD 50/30 для ионизирующего излучения для мыши штамма используется. Другим потенциальным ограничением DLIT-μCT является сила экспрессии репортерного в бактериальный штамм используется, как это повлияет на бактериальный пределы обнаружения и обработки изображений раза. Настоятельно рекомендуется, что исследователи используют подтверждены бактериальных штаммов, которые полностью вирулентных, но оптимизированы для максимального выражения Lux оперона, как показали ранее для BLI2,3.
Одно предостережение к текущим дизайном 4D изображений является то, что каждый фильм состоит из отдельных DLIT-μCT сканирований, которые имеют разные фотона масштабирования. Это может сделать изображения трудности в случае изменений в локализации очага BL, или его интенсивность являются тонкими, или, если таковой имеется интенсивное внимание BL окруженный несколькими слабые очаги. Таким образом, при визуализации продольной, важно сохранить цветовых полос последовательно через моменты времени.
Концепция 4D кино инфекции могут быть применены к любому соответствующую маркировку бактериальным патогеном. Дальнейшее развитие этой техники будет направлена на использование флуоресценции томографии (ФЛИТ), а также DLIT чтобы облегчить исследование реакции хозяина к инфекции с использованием комбинации биолюминесцентного бактериальных патогенов и инъекционные флуоресцентный ближнего инфракрасного зондов для исследования реакции хозяина к инфекции. В дополнение к этому, в этом протоколе мы толькоописывают использование биолюминесцентного бактерии для создания 4D кино инфекции. Тем не менее, в некоторых случаях может возникнуть необходимость в использовании меченных флуоресцентными бактерии, например, с меткой IRFP, так что биолюминесценции репортер может быть использован для исследования хост генетики во время инфекции. Важно отметить, что использование нескольких метода визуализации объединения DLIT / Флит-μCT позволит нам неинвазивно исследовать несколько параметров при бактериальной инфекции, которая внесет значительный вклад в сокращение, изысканность, и замены использования животных в научных исследованиях как это предусмотрено в инициативе NC3R (в http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
В естественных изображений объекта в Имперском колледже была профинансирована MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |