Multi-modalitet bildebehandling er en verdifull tilnærming for å studere bakteriell kolonisering i små dyremodeller. Denne protokollen skisserer infeksjon hos mus med selvlysende<em> Citrobacter rodentium</em> Og den langsgående overvåking av bakteriell kolonisering med kompositt 3D diffust lys bildebehandling tomografi med μCT bildebehandling for å skape en 4D film<em> C. rodentium</em> Infeksjon.
Denne protokollen beskriver fremgangsmåten som kreves for å lengderetningen overvåke en selvlysende bakteriell infeksjon med kompositt 3D diffust lys bildebehandling tomografi med integrert μCT (DLIT-μCT) og påfølgende bruk av disse dataene til å generere en fire dimensjonale (4D) film av infeksjonen syklus. Å utvikle 4D infeksjon filmer og å validere DLIT-μCT bildebehandling for bakteriell infeksjon studier ved hjelp av en IVIS Spectrum CT, brukte vi infeksjon med selvlysende C. rodentium, noe som fører selvbegrensende kolitt i mus. I denne protokollen, skissere vi smitte av mus med selvlysende C. rodentium og ikke-invasiv monitorering av kolonisering av daglig DLIT-μCT bildebehandling og bakteriell telling fra avføring for 8 dager.
Bruken av IVIS Spectrum CT muliggjør sømløs co-registrering av optiske og μCT skanninger med en enkelt avbildning plattform. Den lave dose μCT modalitet gjør at avbildning av muspå flere tidspunkter i løpet av infeksjon, som gir detaljert anatomisk lokalisering av bioluminescent bakteriell foci i 3D uten å forårsake artefakter fra den kumulative stråling. Viktigst, 4D filmer av infiserte mus gi en kraftig analytisk verktøy for å overvåke bakteriekolonisering dynamikk in vivo.
Små dyremodeller, særlig de som benytter mus, blir rutinemessig brukt til å undersøke bakteriell patogenese eller for å teste intervensjon strategier for infeksjoner, for eksempel antibiotika, probiotika, prebiotika og vaksiner 1-7. De viktigste eksperimentelle avlesninger fra små dyr infeksjoner er patogen belastning, romlig og tidsmessig lokalisering av infeksjonen, og endringer i immunrespons av den infiserte organismen. In vivo optisk avbildning er et verdifullt verktøy for smittsomme sykdommer forskning og kan brukes til å overvåke flere eksperimentelle avlesninger gjennom bruk av reporter genene (luciferase, fluorescerende proteiner, beta-laktamase, osv), fluorescerende fargestoffer, nanopartikler eller kjemiluminescente prober rettet mot et protein, biologisk prosess, eller mikroorganismen 6..
Bioluminescence imaging (BLI) er en optisk avbildningsfunksjonalitet brukes til å overvåke kolonisering av små dyr, som mus og rotter, etter sykdomsfremkallende bakteria 3,6,8,9. Mus infiseres med rekombinante bakterier som uttrykker en luciferase, slik som lux operon fra CDABE Photorhabdus luminescens. Disse bakterier kan så detekteres ved deres lette produksjon ved hjelp av et CCD-basert in vivo avbildning system 3,6,9. Viktigere, bare metabolsk aktive mikroorganismer er bioluminescent (BL), noe som betyr bare levedyktige bakterielle celler oppdages av denne metodikken 10,11. Ved hjelp av 2D BLI, plasseringen av BL kilden utledes fra overflaten av dyret hvor signalet avgis 8.. Den nøyaktige anatomiske lokalisering av BL foci in vivo må fastsettes gjennom ex vivo analyse av organer 3,6,9 I kontrast, kan kompositt 3D diffust lys bildebehandling tomografi (DLIT) brukes til å lage en kvantitativ 3D rekonstruksjon av BL kilde 12.. DLIT utføres ved å samle BL bilder tatt ved hjelp av definerte smale band-pass optiske filtre ogderetter å skrive dem inn i en diffus optisk tomografi 3D rekonstruksjon algoritme 1,7,12,13.
For tiden, er multi-modalitet avbildning den eneste metoden som er tilgjengelig for å få ekte ikke-invasiv anatomisk lokalisering av bioluminescent foci in vivo uten behov for ex vivo analyse. Nylig, har vi brukt en kombinasjon av DLIT co-registrert med μCT bildebehandling for å evaluere Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisering dynamikk etter profylaktisk behandling med probiotiske bakterien 7. C. rodentium er et mus bestemt enteric patogen brukes til å modellere menneskelige infeksjon med enteropatogene og enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium infeksjon forårsaker kolitt, vanligvis assosiert med mild vekttap, diaré, polarisert Th1 immunforsvar og forskjellige patologiske forandringer, inkludert colonic krypten hyperplasi og feste og effacing lesjon formati14.. I tillegg til dette, C. rodentium patogenesen har blitt grundig studert ved hjelp BLI og dets kolonisering dynamikken i C57BL/6J mus er godt dokumentert, noe som gjør denne bakterien en ideell modell mikroorganisme for bruk med multi-modalitet bildebehandling 3,4,7.
Denne protokollen er den første til å skissere en metodikk for integrert DLIT-μCT avbildning av en bakteriell infeksjon med en enkelt multimodalitet bildebehandling plattform, IVIS Spectrum CT, og generering av en 4D film som viser den sanne dynamikken i denne infeksjonen ikke-invasiv.
4 D filmen av bakteriell infeksjon gir et nyttig verktøy for å visualisere og tolke store mengder multi-modalitet imaging data raskt og enkelt. Denne teknikk muliggjør en detaljert analyse av hvordan en infeksjon spres gjennom en individuell mus, og kan brukes til å undersøke hvordan delesjon av verten eller bakterielle gener eller særlig intervensjonsstrategiene virkning bakteriemengde, fordeling og lokalisering i løpet av studien 7.. Disse videoene også gi nyttige læremidler og et middel for å spre informasjon til publikum.
Det er flere viktige skritt i denne protokoll som kan påvirke kvaliteten på data innhentet fra DLIT-μCT bildebehandling og evnen til å lage en 4D video av infeksjon. Den viktigste delen av denne protokollen er vellykket og homogen infeksjon i mus med C. rodentium. Det er vesentlig at musene brukte for studien er mellom 18-20 g, og at den bakterial Inokulant tilberedes og ca 5 x 10 9 cfu, som beskrevet tidligere 2,3. Før infeksjon i mus er det viktig å sjekke at inokulatet er bioluminescent hjelp av Spectrum CT og en gang inokulatet er blitt fremstilt, må den stadig homogeniseres før hver mus blir gavaged å sikre at musene mottar tilsvarende infeksiøse doser. Den DLIT-μCT avbildning av mus har blitt optimalisert slik at den automatiske eksponeringen funksjon i levende bilde 4.3.1 programvaren automatisk bestemmer de optimaliserte bildebehandling parametere for at signalet skal være godt over støy. Men stoler auto eksponering funksjonen på brukerdefinerte innstillinger og parametere som må endres som beskrevet i prosedyren. Unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i dårlige bilder med et lavt antall fotoner samlet som ikke resulterer i en tydelig progresjon i infeksjonen, som Spectrum CT fabrikkinnstillinger for autoexposure er programmert for avbildning svulster uttrykkerFirefly luciferase. Rekonstruksjoner utført med 560-620 nm gir den beste avtalen mellom simulerte og målte data, og derfor er de mer pålitelige data for å inkludere i gjenoppbyggingen.
En begrensning i bruken av DLIT-μCT er at ioniserende stråling fra μCT skanning forårsaker subletale skader stråling som er akkumulert over en longitudinell 18.. Subletale stråling kan svekke immunforsvaret, føre til DNA-skader, og apoptose i indre organer 19. I siste instans kan kumulative subletale stråling skader forårsake død hvis LD 50/30 for ioniserende stråling er overskredet, som er mellom 5 til 7 Gy avhengig av mus belastning og alder av musene brukt 18,20,21. Selv om noen av molekylære skader fra ioniserende stråling kan helbrede, siden det overordnede prinsippet er å estimere dose konservativt, er dette vanligvis ikke redegjort for i studien planlegging. I stedet er målet å bo så langt below disse grensene som mulig samtidig å utføre studien mål. Dette er spesielt viktig i denne studien på grunn av den normale immunrespons på infeksjon, kan frekvensen av avbildning, og det faktum at transgene, immuno-består, eller sterkt infisert dyr være mer utsatt for ioniserende stråling.
Ved planlegging av eksperimentet for å generere en 4D-film av infeksjon, er det viktig å vurdere lengden av forsøket, skanner antall μCT nødvendig i løpet av denne perioden og LD 50/30 for ioniserende stråling for mus belastning som brukes. En annen potensiell begrensning til DLIT-μCT er styrken av reporteren uttrykk innenfor den bakteriestamme som benyttes, da dette vil påvirke bakterielle deteksjonsgrensene og tenkelig ganger. Det anbefales sterkt at forskerne bruke godkjente bakteriestammer som er fullt virulente, men optimalisert for maksimal lux operon uttrykk, som demonstrert tidligere for BLI2,3.
En påminnelse til dagens design av 4D bildebehandling er at hver film består av individuelle DLIT-μCT skanner som har forskjellige foton skalering. Dette kan gjøre bildene vanskelig å tolke om endringer i lokalisering av BL foci, eller intensiteten er subtile, eller hvis det er en intens BL fokus omgitt av flere svake fokus. Derfor, for langsgående visualiseringer, er det viktig å holde fargefeltene konsekvent på tvers av tidspunkter.
Konseptet med en 4D-film på infeksjon kan brukes på alle passende merket bakteriell patogen. Fremtidige utviklingen av denne teknikken vil ta sikte på å bruke fluorescens bildebehandling tomografi (smette) samt DLIT å lette etterforskningen av verten respons på infeksjon ved hjelp av en kombinasjon av selvlysende bakterier og injiserbare fluorescerende nær infrarøde følere for å undersøke vert respons på infeksjon. I tillegg til dette, i denne protokollen vi barebeskriver anvendelse av bioluminiserende bakterier for å skape 4D filmer av infeksjon. Men i noen tilfeller kan det være nødvendig å bruke fluorescens-merkede bakterier, for eksempel merket med IRFP, slik at bioluminescence reporter kan brukes for å undersøke genetikk vert under infeksjonen. Viktigere, vil bruk av multi-modalitet bildebehandling kombinere DLIT / smette-μCT tillate oss å non-invasiv undersøke flere parametere i løpet av en bakteriell infeksjon, noe som vil bidra betydelig til reduksjon, raffinement, og utskifting av bruk av dyr i forskning som skissert i NC3R initiativ ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
In vivo avbildning anlegget ved Imperial College ble finansiert av MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |