4D Multimodalitet Imaging af Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50450

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

James William Collins¹, Jeffrey A Meganck², Chaincy Kuo², Kevin P Francis², Gad Frankel¹

¹MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Division of Cell & Molecular Biology, Imperial College London, ²Preclinical Imaging, Caliper- A PerkinElmer Company

Summary

Multi-modalitet billeddannelse er en værdifuld metode til at studere bakteriel kolonisering i små dyremodeller. Denne protokol skitserer infektion af mus med bioluminiscerende

Abstract

Denne protokol beskriver de nødvendige skridt til at længderetningen overvåge en bioluminescerende bakteriel infektion med komposit 3D diffust lys imaging tomografi med integreret μCT (DLIT-μCT), og den efterfølgende anvendelse af disse data til at generere en fire dimensional (4D) film af infektionen cyklus. At udvikle 4D infektion film, og at validere DLIT-μCT billeddannelse til bakteriel infektion undersøgelser ved hjælp af en IVIS Spectrum CT, vi brugte infektion med bioluminiscerende C. rodentium, som forårsager selvbegrænsende colitis hos mus. I denne protokol, skitsere vi infektion af mus med selvlysende C. rodentium og non-invasiv monitorering af kolonisering ved daglig DLIT-μCT billedbehandling og bakteriel tælling fra afføring i 8 dage.

Brugen af ​​IVIS Spectrum CT letter problemfri co-registrering af optiske og μCT scanninger med en enkelt imaging platform. Den lave dosis μCT modalitet muliggør billeddannelse af muspå forskellige tidspunkter i løbet af infektion, der giver detaljeret anatomisk lokalisering af bioluminescerende bakteriel foci i 3D uden at forårsage artefakter fra den kumulative stråling. Vigtigere, 4D film af inficerede mus giver et kraftfuldt analytisk værktøj til at overvåge bakteriekolonisering dynamik in vivo.

Introduction

Små dyremodeller, især de udnytter mus, anvendes rutinemæssigt til at undersøge bakteriel patogenese eller for at teste interventionsstrategier for infektioner, såsom antibiotika, probiotika, præbiotika og vacciner ^1-7. De vigtigste eksperimentelle udlæsninger fra små dyr infektioner er patogen belastning, rumlig og tidsmæssig lokalisering af infektionen, og ændringer i immunresponset af inficerede organisme. In vivo optisk billeddannelse er et værdifuldt redskab til infektionssygdomme forskning og kan bruges til at overvåge flere eksperimentelle aflæsning ved brug af reportergener (luciferase, fluorescerende proteiner, beta-lactamase, etc.), fluorescerende farvestoffer, nanopartikler eller kemiluminescerende prober rettet mod et protein, biologisk proces, eller mikroorganisme ^6..

Bioluminescens imaging (BLI) er en optisk afbildningsmodalitet anvendes til at overvåge koloniseringen af ​​små dyr, såsom mus og rotter, med patogene bakterieria ^3,6,8,9. Mus inficeret med rekombinante bakterier, der udtrykker luciferase, såsom lux CDABE operonen fra Photorhabdus luminescens. Disse bakterier kan derefter påvises gennem deres lysproduktion ved hjælp af en CCD baseret in vivo imaging system ^3,6,9. Vigtigere er det kun metabolisk aktive mikroorganismer er bioluminescerende (BL), hvilket kun levedygtige bakterieceller påvises ved denne metode ^10,11. Ved hjælp af 2D BLI, placeringen af BL kilde udledes fra overfladen af dyret, hvor signalet udsendes ^8.. Den nøjagtige anatomiske lokalisering af BL foci in vivo skal bestemmes gennem ex vivo analyse af organer ^3,6,9 kan derimod sammensatte 3D diffust lys imaging tomografi (DLIT) blive brugt til at udarbejde en kvantitativ 3D rekonstruktion af BL kilde ^12. DLIT udføres ved at indsamle BL taget billeder med definerede smalle band-pass optiske filtre ogefterfølgende indlæst dem i en diffus optisk tomografi 3D rekonstruktion algoritme ^1,7,12,13.

I øjeblikket kombiterapi billeddannelse er den eneste metode til rådighed til at få ægte non-invasiv anatomisk lokalisering af bioluminescerende foci in vivo uden behov for ex vivo-analyse. For nylig brugte vi en kombination af DLIT co-registrerede med μCT imaging at evaluere Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisering dynamik efter profylaktisk behandling med en probiotisk bakterie ^7.. C. rodentium er en murin specifik enterisk patogen bruges til at modellere menneskelig infektion med enteropatogene og enterhemorrhagic Escherichia coli ^14. C. rodentium infektion forårsager colitis, typisk forbundet med mild vægttab, diarré, polariseret Th1 immunrespons og distinkte patologiske forandringer, herunder colon krypt hyperplasi og fastgørelse og effacing læsion formati^14.. Ud over dette, C. rodentium patogenese er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af BLI og dets kolonisering dynamik i C57BL/6J-mus er veldokumenteret, hvilket gør denne bakterie en ideel model mikroorganisme til brug med multimodalitet billeddannelse ^3,4,7.

Denne protokol er den første til at skitsere en metode til integreret DLIT-μCT billeddannelse af en bakteriel infektion ved hjælp af en enkelt multimodalitet billeddannelse platform, IVIS Spectrum CT, og frembringelsen af ​​en 4D film viser den sande dynamik denne infektion non-invasivt.

Protocol

1.. Mus Forberedelse

1. Købe eller avle nok 18-20 g C57BL/6J-mus nødvendige for undersøgelsen.
2. Hvis mus er købt fra en ekstern leverandør efter transport til anlægget, vænne musene for 1 uge på autoklaveres mad og vand for at stabilisere tarmens mikrobiota.
3. Afvejes, øre hak, og adskille det ønskede antal mus pr bur.
4. Dagen før infektion, før der foretages anæstesi, kontrollere, at der er tilstrækkelig ilt og isofluran for varigheden af ​​proceduren. Hvis det er nødvendigt, tilføje mere isofluoran eller udskift iltflaske. Efterfølgende tjek vægten af ​​de bedøvende skraldemanden, hvis de har fået mere end 50 g siden deres første brug, kassere dem og erstatte med friske skraldemanden.
5. Bedøve mus ved anvendelse af 3% isofluoran i XGI-8 Anæstesi System og fjerne hår ved hjælp af Veet for 7 min.
6. Bemærkninger:
   • Grundig hårfjerning er afgørende, især isorte mus som melanin i pelsen markant dæmper bioluminescerende signal ^3,15.
   • Depilation af mus varer normalt 8-10 dage før pelsen begynder at regrow. For at udføre 4D multimodalitet billeddannelse over længere perioder, fjerne hår mus, når det kræves, så det område af interesse er nøgen for de billeddannende sessioner.
   • Mus er opstaldet i en biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) indeslutning facilitet.

2.. Bakteriecelle Forberedelse

1. Forbered nok Luria Burtani bouillon og agarplader suppleret med kanamycin [50 ug ^ml-1] kræves til undersøgelse og opbevares ved 4 ° C, indtil der.
2. Dagen før infektionen tø en cryovial C. rodentium stammen ICC180 og straks tilføje cryobead til 15 ml LB-suppe suppleret med kanamycin [50 pg ml ^-1] og kultur natten over ved 220 rpm, 37 ° C. Som en kontrol for mellemstore kontaminering forberedes en ekstrainokuleret 15 ml LB-bouillon suppleret med kanamycin [50 ug ^ml-1] og ved 220 rpm, 37 ° C.
3. Den næste morgen (~ 16 timer), skal du kontrollere medium kontrol turbiditet som et tegn på bakteriel vækst. Hvis kontrollen er klart, overføre ICC180 kultur til en falk rør og centrifugeres ved 4.000 rpm. Efterfølgende vaskes bakteriepelleten i PBS. Derefter resuspenderes i 1,5 ml PBS (1/10 ^th af den oprindelige mængde af LB suppleret med kanamycin) og blandes grundigt for at skabe den bakterielle inokulum.
4. At kontrollere, at ICC180 er blevet dyrket ordentligt og er selvlysende før infektion af musene, billede inokulum i IVIS Spectrum CT hjælp BLI og auto indstilling i Living Billede 4.3.1 guiden som beskrevet tidligere ^1..
   Note:
   • Stamme ICC180 er en bioluminescerende derivat af vildtype C. rodentium ICC169 ^2.. Denne bakteriestamme har lux CDABE operonen, herunder en Kanamycin resistens gen indsat i en pseudogen af xylE i kromosomet ^2..
   • Gennemfør alle bakterielle dyrkning ved hjælp af standard aseptisk teknik og om nødvendigt enten købe sterile forbrugsvarer / reagenser eller autoklavere før brug.
   • I trin 2.4, kan bioluminescens læsning (p / s / cm ² / sr) anvendes til at estimere antallet af bakterier før infektion af mus.

3.. Infektion af Mus med Bioluminescent C. rodentium og Vurdering af bakteriekolonisering

1. Forud for infektion, kontrollere, at der er tilstrækkelig ilt og isofluran for varigheden af ​​proceduren. Hvis det er nødvendigt, tilføje mere isofluoran eller udskift iltflaske. Efterfølgende tjek vægten af ​​de bedøvende skraldemanden, hvis de har fået mere end 50 g siden deres første brug, kassere dem og erstatte med friske skraldemanden.
2. Bedøve mus med 3% isofluoran hjælp af en XGI-8 anæstesisia System til at give human tilbageholdenhed.
3. Bland bakterielle inokulum grundigt og trække 0,2 ml (ca. 5 x 10 ⁹ cfu ICC180) i sprøjten.
4. Tag mus fra anæstesi-systemet én ad gangen og Scruff dem ved fast greb i huden bag nakken med tommel-og pegefinger.
5. Skub sonde nål mod taget af munden over tungen, og ned i spiserøret og injicere den bakterielle inokulum i maven.
6. Efter oral tvangsfodring af musene, deres gangart og vejrtrækning for tegn på lidelse, som kan være et tegn på, at den bakterielle inokulum er blevet leveret i lungerne overvåge. Aflive alle mus, der er blevet podet i lungerne.
7. Sonde inficerede mus med 200 pi PBS som et køretøj kontrol som beskrevet i trin 3,1-3,6.
8. At bekræfte, at oral sonde blev udført korrekt, billed smittede og mock inficerede mus i IVIS Spectrum CT hjælp BLI og auto indstilling i LivingBillede 4.3.1 guiden som beskrevet tidligere ^1..
9. Bestemme antallet af levedygtige bakterier i podestoffet ved seriel fortynding i PBS og spotting in triplo på LB-agar suppleret med kanamycin [50 ug ^ml-1].
10. Beregne antallet af ICC180 cfu / ml ved at finde en fortynding, hvor der er ca 5-50 kolonier og tælle antallet af kolonier fra hver plet på at fortynding og registrere fortynding at kolonierne blev talt på. Efterfølgende beregne det gennemsnitlige antal cfu (fra de tre pletter) og gange denne værdi med fortyndingsfaktoren 50 (hver plet er 20 ul af den oprindelige 1 ml prøve) og fortyndingen kolonierne blev talt på, giver cfu / ml.
11. Overvåg kolonisering af musene dagligt ved at indsamle afføring fra hver mus i en tareret Eppendorf-rør (vejet på en fin balance) og fortyndes 1/10 i PBS baseret på vægten af prøven (0,1 g ml ^-1).
12. Bestem antallet af levedygtige bakterier ifæces ved seriel fortynding i PBS og spotting in triplo på LB-agar suppleret med kanamycin [50 ug ^ml-1].
13. Beregne antallet af levedygtige bakterier per gram af afføring ved at følge trin 3.9, og derefter multiplicere antallet af cfu / ml af den fækale fortyndingsfaktor i PBS (trin 3.10) på 0,1 g ml ^-1 til opnåelse cfu / g..
14. At fastslå, at mus blev inokuleret med en ren ICC180 kultur og at alle kolonierne er bioluminescerende. Tag agarplader fra trin 3.8, vurderer bakteriekoloni morfologi enten ved øjet eller vælge en repræsentativ koloni fra pladen og analysere ved lysmikroskopi. Hvis det er nødvendigt, kan bakteriel identifikation udføres ved stamme specifik koloni-PCR for at vurdere kultur renhed. Efterfølgende billede pladerne i IVIS Spectrum CT hjælp BLI som beskrevet i trin 3.7 og kontrollere, at 100% af de kolonier på pladen er selvlysende.
    Bemærkninger:
    • I trin 3.4, når du indsætter sondeernæring nålHvis du føler modstand ikke tvinge sonde nål, da dette forårsager inokulum til at gå ned i lungerne. I stedet igen kanylen og forsigtigt prøve igen.
    • Trin 3.1 er valgfri og mus kan være mundtlig sondeernæret uden bedøvelse afhængig af institutterne dyrevelfærdspolitik.
    • Taburetter skal udsået den dag, de er indsamlet. C. rodentium vil vokse, selvom venstre ved 4 ° C natten over i PBS og vil forårsage kvantificering af cfu / g afføring at være forkert.

4.. Daglig Composite 3D Diffuse Light Imaging Tomography med μCT Imaging (DLIT-μCT) i inficerede mus

Dyrevelfærd: DLIT-μCT involverer DLIT optisk billeddannelse integreret med en hurtig, lav stråledosis μCT scanning (~ 23 MGY for en to mus scan, ~ 53 MGY for en enkelt mus scanning) af en immobiliseret dyr. Denne dosis akkumuleres med hver billeddannelse session, så målet er at holde dosis som low som muligt (og altid et godt stykke under LD _50/30), mens den stadig udføre undersøgelsen. I nogle tilfælde, hvis der ikke er nogen tegn på infektion i en konventionel BLI scanning af mus kan μCT scanning undgås yderligere at minimere dosis. Selvom dosis holdes så lav som muligt i længerevarende studier, hvis der er nogen bekymring stråling, vil musene slås ned ved det første tegn på skadelige symptomer eller ved afslutningen af ​​μCT imaging periode.

1. Forud for billedbehandling, initialisere IVIS Spectrum CT og kontrollere, at X-ray sikkerhedsaflåsninger fungerer, og at den opvarmede fase er ved den korrekte temperatur (37 ° C) til billeddannelse. Efterfølgende kontrollere niveauet af isoflourane i anæstesi-systemet og vægten af ​​de bedøvende skraldemanden. Hvis det er nødvendigt, tilføje mere isofluoran og hvis skraldemanden har fået mere end 50 g siden deres første brug, kassere dem og erstatte med friske skraldemanden.
2. Opstil Spectrum CT, så de billeddannende parametre,køre automatisk eksponering indslag i Living Billede 4.3.1 er optimeret til billeddannelse bakteriel luciferase. Vælg Rediger> Indstillinger> Køb og Auto Exposure vindue. Og vælg derefter> Range Værdier> Exp. (Sekunder), og indstil> Max. til 300s. Endelig skal du vælge> Target Count (minimum)> Selvlysende og sat til 10.000 tæller.
3. Sæt en mus imaging platform i Spectrum CT og lod det i anæstesi.
4. Tænd røntgen sikkerhedsblokeringskredsløb og initialisere IVIS.
5. Når IVIS Spectrum CT er initialiseret, bedøve musene med 3% isofluoran hjælp af en XGI-8 Anæstesi System til at give human tilbageholdenhed.
6. At afgøre, om det er nødvendigt at foretage en DLIT-μCT scanning, præ-billede musene med BLI som beskrevet tidligere ^1, i den ene mus billeddannelse platform. Hvis en robust signal opnås musen er egnet til DLIT billeddannelse. Lad bedøvede mus i en mus imaging platform efter BLI scanningen klar til DLIT-μCT.
7. Brug Imaging Wizard i Living Billede software 4.3.1 til opsætte DLIT-μCT scanning. Den Imaging Wizard automatisk bestemmer FOV, eksponeringstid, F-stop og udsmidningen for DLIT og FOV, eksponeringstid, filtersæt og udsmidningen for μCT billedbehandling for at give det bedste signal støjforhold. Når du bliver bedt af Imaging Wizard, omfatter kun de 560, 580, 600 og 620 nm emission filtre, og vælg en mus μCT scanning. Klik derefter på> Acquire at starte billeddannelse.
8. Retur bedøvede mus til sit bur efter billedbehandling, skal du fjerne en mus imaging platform fra Spectrum CT og desinficere bruge 1% Tri-genet. Hvis det er nødvendigt, udskiftes skumpuden at musen er placeret på at minimere risikoen for krydskontaminering mellem mus.
9. Billede mus dagligt op til dag 8 efter infektion (PI) ved hjælp DLIT-μCT, som beskrevet i trin fra 4,1 til 4,8, for at frembringe de langsgående imaging nødvendige data til at foretage en 4D mokappes for infektion.
   Note:
   • I trin 4.7, anbefaler vi brug af de 560-620 nm emission filtre på billedet bakteriel bioluminescens. Skønt toppen af ​​bakteriel bioluminescens er omkring 485 nm på grund af væv optik (den signifikant svækkelse af blå / grøn fotoner ved murin væv), er det vigtigt at bruge de orange / røde fotoner for 3D rekonstruktioner de lette beregningen af ​​signal dybde .
   • 'AUTO' eksponering indstillinger i Living Billede 4.3.1 for DLIT skal justeres for at optimere mængden af ​​opfangede fotoner og den maksimale imaging tid, der bruges til hvert filter sæt.
   • Det er kun nødvendigt at udføre BLI pre-imaging beskrevet i trin 4.6, når forskeren er ikke sikker, hvis der er et påviseligt bioluminescerende signal, for eksempel ved brug af en ny infektion model.

5.. 3D Rekonstruktion af DLIT-μCT billeddata

1. Open Living Billede software 4.3.1 og vælg>, Gennemse og åbne mappen med de DLIT-μCT filer.
2. Åbn DLIT-μCT fil i Living Image Browser, for eksempel C. rodentium Dag 1 PI ved at klikke på Load.
3. I værktøjspalet select> overfladetopografi> Nude mus, justere tærskelværdien, og klik derefter på> Generer Surface. Hvis overfladen genopbygning er vellykket en overflade omrids vises i 3D-visningen vinduet.
4. For at se det afsmeltede μCT scanning i 3D-visning vinduet skjule overfladens omrids (Klik> 3D optiske værktøjer og fravælge> Display Surface Object) eller sænke overfladen opacitet (Klik> 3D optiske redskaber og juster> opacitet skyderen).
5. At give detaljerede anatomiske lokalisering af 3D DLIT rekonstruktion, er det nødvendigt at ændre de 3D volumetriske data (μCT scanning), så kun musens skelet er synlig, og at det har den bedste kontrast. Klik> 3D Multimodalitet værktøjer og vælg> Logaritmisk histogram Gradient Illumination, kvalitet og denoise. Endelig justere Histogram skyderen til højre og se 3D volumetriske data ændre kontrast. Hold justere dataene, indtil kun de knogler er klart synlige. Hvis det ønskes, ændre farven for overførsel funktion punkter på histogrammet.
6. Vælg dernæst> DLIT 3D Genopbygning i værktøjskassen, og sørg for, at kun de 560, har 580, 600 og 620 nm filter sæt, som er nødvendige for billeddannelse bakteriel luciferase in vivo, er blevet valgt. Klik> Start. Data Eksempel menuen Vindue vises nu viser spektralt filtrerede BL-signaler fra mus, der blev afbildet i 2D. Disse signaler automatisk tærsklingsbehandles af softwaren, men kan justeres manuelt om nødvendigt ved hjælp faner nederst i menuen. Tærsklen bestemmer minimum data intensitet (repræsenteret som en procentdel af den maksimale signal i billedet), som vil indgå som data i genopbygningen.
7. Vælg dernæst> DLIT 3D Genopbygning i værktøjskassen, og kontrollere, at de optiske egenskaber, der anvendes til DLIT genopbygning er korrekte. Vælg> fanen Egenskaber, og sørg for, at indstillingerne for Tissue Properties er indstillet til musevæv er Source Spectrum sat til bakterier.
8. Klik> Genskab at udføre DLIT genopbygning.
9. For at generere den DLIT-μCT 3D-film på> Funktioner> 3D-animation og vælg> Preset Animationer> CCW Y-aksen og> Samlet varighed> 10 sek (25 frames per sekund). Når indstillingerne for 3D-animation er korrekte presse> Optag og gem DLIT-μCT 3D rekonstruktioner som. Avi filer mærket med eksperimentet, gruppe og tidspunkt i en separat mappe.
   Note:
   • Det er vigtigt, når du udfører 3D rekonstruktioner af DLIT-μCT data til at bruge en pc med Living Billede 4.3.1 og service-pakke 1 installeret, og at pc'en har et grafikkort egnet til at køre Multi-modalitet imaging software. Ther softwaren kan downloades og GPU specifikationer er indeholdt i release notes ( http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
   • Hvis DLIT-μCT 3D rekonstruktioner vises baglæns efter at være blevet reddet, er din computer kører en gammel version af sin grafikdriver og dette kan afhjælpes ved at downloade en opdatering fra fabrikanternes hjemmeside.
   • I trin 5 præsenterer vi vores foretrukne indstillinger til generering af 3D DLIT-μCT rekonstruktioner. Men der er flere punkter i løbet af de 3D-rekonstruktioner, hvor parametre, der ikke omtales i denne protokol kan ændres. For en omfattende guide til 3D-rekonstruktioner ved hjælp Living Billede 4.3.1 henvises til fabrikanternes brugsanvisning.
   • Det er vigtigt at skabe 3D-rekonstruktioner brug af samme indstillinger i multimodalitet billedbehandling værktøj, så de er sammenlignelige. Ud overdette, når du opretter DLIT-μCT 3D rekonstruktioner, er det vigtigt at gøre videoer ved hjælp af det samme antal billeder pr sekund og samlede varighed (længde), ellers timingen af ​​4D video er ikke homogen.

6.. Generering af en 4D film C. rodentium Infektion

1. Det er klart mærke alle de DLIT-μCT 3D rekonstruktioner med det rigtige eksperiment tidspunkt og gruppe i en let tilgængelig mappe.
2. Opret en ny fil i Windows Live Movie Maker og indsæt de DLIT-μCT rekonstruktioner i kronologisk rækkefølge fra dag 1 PI ved hjælp af værktøjer fanen fra mappen forberedt i trin 6.1.
3. Tilføj billedtekster til starten af ​​hver video beskriver tidspunkt, for eksempel Dag 1 PI ved at vælge passende DLIT-μCT video og derefter vælge Hjem> Tilføj Billedtekst. En tekstboks vises på skærmen, når den rette legenden er tilføjet. Justere skriftstørrelsen, stil, farve og begrundelse desIRED anvendelse af identiske faner til Microsoft Word i software værktøjslinjen. Endelig flytte billedtekst til øverste venstre hjørne af videoen.
4. Gentag trin 7.3 for alle de DLIT-μCT videoer.
5. Tilføj en titel side, f.eks C. rodentium infektion dage 1-8 ved at klikke på Hjem> Titel. En tekstboks vises på skærmen, hvor den passende titel føjes til et tomt dias. Justere skriftstørrelsen, stil, farve og begrundelse som ønsket ved hjælp af identiske faner til Microsoft Word i software værktøjslinjen.
6. Gem projektet som en film maker projekt * MMP i en passende mappe med titlen på filmen. Dette trin er afgørende, hvis du ønsker at ændre filmen.
7. Gemme filmen som en. Wmv-fil. Klik på Movie maker menu> Gem film> for computer.
8. Konverter Movie Maker-fil ved hjælp af en fil konverter til. Avi eller et andet egnet filtype kompatibel med din computer.
   Bemærkninger:
   • Det anbefales, at de 4D-filmgenereres på en PC med Windows Live Movie Maker installeret ( http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) og en god multi-media program kan afspille. wmv eller. avi filtyper.

Representative Results

Infektion af C57BL/6J-mus med 5 x 10 ⁹ cfu C. rodentium er en velbeskrevet bakterieinfektion model og resulterer i en selvbegrænsende gastrointestinal infektion, toppe mellem dage 6-8 efter infektion og varer mellem 3 til 4 uger ^2,14. Infektionen er begrænset til det intestinale lumen af ​​det murine immunsystem og som en konsekvens, bakterier løbende udskilt i fæces. Kolonisering af mus ved C. rodentium kan overvåges non-invasivt ved direkte bakteriel tælling fra afføring, eller bioluminescens billeddannelse ^2,3.

Dette håndskrift skitserer en optimeret protokol til udførelse 3D og 4D multimodalitet billeddannelse af C. rodentium i mus til at overvåge bakterieindhold og lokalisering under infektion. Resultaterne i figur 1 viser den kontrol, der kræves for en vellykket 4D billeddannelse. Forud for infektion i mus er det vigtigt at afskrækkeminen at den bakterielle anvendte inokulum bioluminescerende (figur 1A), og at der efter oral sonde af en mus med selvlysende C. rodentium, at signalet kan observeres i maven af dyret og ikke i lungerne (figur 1B) ^16.

Ud over at overvåge bakteriel kolonisering ved hjælp bioluminescens billeddannelse, er det god praksis at kvantificere antallet af bakterier i fæces, der anvendes som en indirekte måling af bakteriel kolonisering af den gastrointestinale slimhinde Figur 2 viser den typiske bakterier i fæces taget fra 8 C57BL6 / J. mus, der er blevet inficeret med ~ 5 x 10 ⁹ cfu ICC180 og overvåges i 8 dage PI Colonization stiger fra dag 2 PI indtil dag 6-7, hvor infektionen toppe ved ~ 5 x 10 ¹⁰ cfu / g, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter ^2,3,17.

For at understrege betydningen af ​​evalueTing spredning af infektion i en enkelt mus, figur 1b og 3 samt Video 1 er blevet genereret fra samme mus efter C. rodentium infektion som beskrevet ovenfor. Daglig DLIT-μCT blev anvendt til at evaluere den rumlige fordeling af bioluminescerende bakterier i denne mus, ved hjælp af skelettet som en anatomisk henvisning. Figur 3 viser den DLIT-μCT rekonstruktion af en C57BL/6J mus inficeret med ICC180 på tasten 3 tid point PI På dag 3 PI lille bioluminiscerende foci kan observeres i tyktarmen, som udviser en moderat stigning i bioluminescence intensiteten ved dag 5 PI med lille ændring i den geografiske fordeling. På dag 7 PI vi observeret en betydelig stigning i bioluminescens og bioluminescerende foci spredt over hele tyktarmen.

Video 1 er en samling af 3D DLIT-μCT rekonstruktioner fra dage 1-8 PI med ICC180 og illustrerer C.rodentium i den proximale mave-tarmkanalen mellem dage 1-2 PI der spreder til tyktarmen på dag 3 PI Fra dage 4-6 PI de bakterielle numre i tyktarmen ekspandere indtil toppede på dag 7 PI hvor den bakterielle foci dækker hele tyktarmen. På dag 8 PI kun to forskellige bakterielle foci er til stede i den proximale og distale colon. Evnen til at se den fulde 3D-rekonstruktion på hvert tidspunkt i kronologisk rækkefølge er et effektivt redskab til at analysere vært patogen interaktioner, og er lettere at fortolke end en 3D stadig af samme datasæt.

Figur 1.. 2D bioluminescens billeddannelse af A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 inokulum og B) en mus efter oral sondeernæring med 200 ul af podestoffet. Arrowhead (>) illustrerer bioluminescerende C. rodentium em> i maven.

Figur 2.. C. rodentium kolonisering dynamik. kvantificeres C. rodentium kolonidannende enheder fra afføring i 8 dage PI

Figur 3. Diffust lys imaging tomografi-μCT scanning af bioluminiscerende C. rodentium smitte fra en mus overvåges på dag 3, 5 og 7 PI Arrowhead (>) illustrerer colon kolonisering. Klik her for at se større figur .

Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Klik her for at se video. 4D film C. rodentium smitte fra én mus overvåget fra dage 1-8 PI

Discussion

4D film for bakteriel infektion giver et nyttigt værktøj til at visualisere og fortolke store mængder af multi-modalitet billeddata hurtigt og nemt. Denne teknik gør det lettere at detaljeret analyse af, hvordan en infektion spredes gennem en individuel mus og kan bruges til at undersøge, hvordan sletning af vært eller bakterielle gener eller særlige indgreb strategier effekt bakteriemængde, distribution og lokalisering i løbet af en forløbsundersøgelse ^7.. Disse videoer giver også nyttige undervisningsmidler og et middel formidling af oplysninger til offentligheden.

Der er flere kritiske trin i denne protokol, der kan påvirke kvaliteten af ​​oplysningerne fra DLIT-μCT imaging og evnen til at udarbejde en 4D video af infektion. Den vigtigste del af denne protokol er den vellykket og homogen infektion af mus med C. rodentium. Det er vigtigt, at de anvendte mus til undersøgelsen er mellem 18-20 g, og at bakterierial inoculums er frisklavet og cirka 5 x 10 ⁹ cfu, som beskrevet tidligere ^2,3. Før infektion af musene er det vigtigt at kontrollere, at inokulum bioluminescerende hjælp Spectrum CT og når podestoffet er fremstillet, skal det kontinuerligt homogeniseres før hver mus sondeernæret at sikre, at musene modtager lignende infektiøse doser. Den DLIT-μCT billeddannelse af mus er blevet optimeret, så den automatiske eksponering funktion i Living Billede 4.3.1 software bestemmer automatisk de optimerede imaging parametre for signalet til at være et godt stykke over støjen. Men auto eksponering funktion er betinget af brugerdefinerede indstillinger og parametre, der skal ændres, som beskrevet i proceduren. Undladelse af at gøre dette vil resultere i dårlige billeder med et lavt antal fotoner indsamlet som ikke resulterer i en indlysende progression i infektionen, da Spectrum CT fabriksindstillinger for AE er programmeret til billeddannelse tumorer udtrykkerildflueluciferase. Rekonstruktioner udføres ved hjælp af 560-620 nm give den bedste aftale mellem simulerede og målte data, og derfor er de mere pålidelige data til at omfatte i genopbygningen.

En begrænsning for anvendelsen af DLIT-μCT er, at ioniserende stråling fra μCT scanning medfører subletale stråleskader, der er kumulativ over en forløbsundersøgelse ^18. Subletale bestråling kan svække immunforsvaret, forårsager DNA-skader, og apoptose i indre organer ^19. I sidste ende kan kumulativ subletal stråleskader medføre døden, hvis LD _50/30 for ioniserende stråling overskrides, som er mellem 5 til 7 Gy afhængigt af musestamme og alder af musene anvendte ^18,20,21. Selv om nogle af den molekylære skader fra ioniserende stråling kan helbrede, da det overordnede princip er at estimere dosis konservativt, er dette ikke typisk tegnede sig for i studie planlægning. I stedet er målet at holde sig så langt below disse grænser som muligt, mens du stadig varetagelse undersøgelsens mål. Dette er særligt vigtigt i denne undersøgelse, fordi den normale immunrespons på infektion, kan hyppigheden af ​​billedbehandling, og at transgene, immuno-omfattede, eller stærkt inficeret dyr være mere modtagelige for ioniserende stråling.

Ved planlægning af eksperimentet til at generere en 4D film af infektion, er det vigtigt at overveje længden af eksperimentet, antallet af μCT scanninger nødvendig i denne periode, og LD _50/30 for ioniserende stråling til musestamme, der anvendes. En anden potentiel begrænsning til DLIT-μCT er styrken af ​​reporter ekspression i den bakterielle stamme, der anvendes, da dette vil påvirke bakterielle detektionsgrænser og billedbehandling gange. Det anbefales stærkt, at forskere bruger valideret bakteriestammer, der er fuldt virulente, men optimeret til maksimal lux operon udtryk som demonstreret tidligere for BLI2,3.

En advarsel til den nuværende udformning af 4D billedbehandling er, at hver film består af individuelle DLIT-μCT scanninger, som har forskellig foton skalering. Dette kan gøre billederne svære at fortolke, om ændringerne i lokaliseringen af ​​BL foci eller dens intensitet er subtile, eller hvis der er en intens BL fokus omgivet af flere svage brændpunkter. Derfor, for langsgående visualiseringer, er det vigtigt at holde farvelinjerne konsistent på tværs af tidspunkter.

Begrebet en 4D film af infektion kan anvendes på enhver passende mærket bakterielt patogen. Fremtidige udvikling af denne teknik vil sigte mod at bruge fluorescensimagografi tomografi (FLIT) samt DLIT at lette efterforskningen af ​​værtsresponser for infektion ved hjælp af en kombination af bioluminiscerende bakterielle patogener og injicerbare fluorescerende nærinfrarøde sonder til at undersøge værtsresponser for infektion. Ud over dette, i denne protokol vi kunbeskriver anvendelsen af ​​bioluminescerende bakterier til at skabe 4D film på infektion. Men i nogle tilfælde kan det være nødvendigt at anvende fluorescerende mærkede bakterier, for eksempel mærket med IRFP, således at bioluminescens reporteren kan anvendes til at undersøge host genetik under infektion. Vigtigere er det, vil brugen af ​​multi-modalitet imaging kombinerer DLIT / FLIT-μCT tillade os at non-invasivt undersøge flere parametre i løbet af en bakteriel infektion, som vil bidrage væsentligt til reduktionen, forfining og erstatning af brugen af ​​dyr til videnskabelig forskning som skitseret i NC3R initiativ ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent C. rodentium	Frankel lab	ICC180	Wiles et al., 2004
Veet	Boots		Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.
Isofluorane (100% v/v)	Abbott	B506
Medical Oxygen	BOC Medical		Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.
Luria Bertani broth	Merck	1.10285.0500	25 g in 1L Demineralised water.
Luria Bertani agar	Merck	1.10283.0500	37 g in 1L Demineralised water.
Kanamycin sulphate	Sigma (Fluka)	60615
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes	BD (Falcon)	352070
Universals	Corning (Gosselin)	E5633-063
1 ml syringe	BD (Plastipak)	300013
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved	Vet Tech	DE005
Microbanks (Cryovial)	Pro-Lab Diagnostics	PL.170/Y
IVIS Spectrum CT	Caliper- a PerkinElmer Company	133577 Rev A/ Spectrum CT
6kVA UPS	Caliper- a PerkinElmer Company
XGI-8 anesthesia system	Caliper- a PerkinElmer Company	118918
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal	Caliper- a PerkinElmer Company	118999/00
Living Image v4.3.1 SP1	Caliper- a PerkinElmer Company
Benchtop shaking incubator	New Brunswick Scientific	Innova 44