Summary
אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.
Abstract
גליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בבעלי חיים בעלי חוליות וממלאים תפקיד מכריע בחילוף חומרים בגוף כולו, כמו גם בחילוף חומרים תאיים. שיטות רבות לאיתור גליקוגן כבר קיימות אבל רק מעטים הם כמוני. אנו מתארים כאן שיטת שימוש בערכת assay Abcam גליקוגן, אשר מבוססת על השפלה ספציפית של הגליקוגן לגלוקוז על ידי glucoamylase. גלוקוז אז במיוחד חמצון למוצר שמגיב עם חללית OxiRed לייצר הקרינה. כותרות היא מדויקות, רגישה ויכולות להיות מושגת על תמציות תא או חלקי רקמות. עם זאת, בניגוד לשיטות אחרות, זה לא נותן מידע על ההפצה של גליקוגן בתאים. כדוגמא לטכניקה זו, שאנו מתארים כאן טיטרציה של גליקוגן בשתי שורות תאים, CCL39 פיברובלסטים ריאות אוגר הסיני וLS174 קרצינומה של המעי הגס האנושי, מודגרות בnormoxia (O 21% 2) לעומת היפוקסיה (1% O 2). חוקרים שערנו כי היפוקסיה היא signal שמכין תאים לסנתז וגליקוגן חנות על מנת לשרוד 1.
Introduction
גליקוגן הוא פולימר multibranched של שאריות הגלוקוז, אשר שוהה בציטופלסמה של סוגי תאים רבים. זוהי אחת הצורות העיקריות של אחסון אנרגיה בתאים וממלא תפקיד חשוב בחילוף חומרים של הגלוקוז. רוב תאי היונקים מסוגלים לייצר וגליקוגן חנות, אשר יכול להיות מושפל במהירות לגלוקוז כדי לקדם את ייצור גליקוליזה ו-ATP בלחץ מטבולים. Hepatocytes לייצר כמויות מסיביות של גליקוגן כדי לווסת את רמת הסוכר בדם ובכך לספק אספקה רציפה של גלוקוז בגוף. לעומת זאת, הריכוז של גליקוגן בתאים אחרים (שרירים, תאי דם אדומים, וכו ') הוא נמוך יחסית. עם זאת, באופן מקומי, כמויות אלה מספיקות כדי לספק אנרגיה בטווח הקצר, כאשר התאים נחשפים פתאום לסביבה המקופחת של חומרים מזינים.
סינתזה של גליקוגן ופירוק גליקוגן כדלקמן את אותם צעדים בכל הרקמות (איור 1). ראשית, גלוקוזנכנס לתאים על ידי מובילי גלוקוז (עודפים), ומומר במהירות מglucose-6-phosphate (G6P) לגלוקוז-1-פוספט (G1P) על ידי phosphoglucomutase. G1P הוא שונה אז לUDP-גלוקוז, וC1 הפחמן של UDP-גלוקוז מחובר לשאריות טירוזין של glycogenin, חלבון העיגון של גליקוגן. מולקולה זו, הנחשבת לפריימר הגליקוגן, הוארכה על ידי צירופה של UDP-גלוקוז לגלוקוז המסוף ידי α (1 → 4) איגרות חוב באמצעות synthase הגליקוגן. לבסוף, כאשר שרשרת ליניארית של מעל 11 שאריות הגלוקוז נוצר, אנזים ההסתעפות מעביר oligosaccharide מסוף היווה ידי מינימום של 6 שאריות גלוקוז לגלוקוז אחר של השרשרת סמוכה באמצעות הצמדת α (1 → 6). חזרה על התהליך הזה נותן מבנה פרקטלית מאסיבי המכיל ענפים היוצרים סליל עם 6.5 גלוקוז בכל תור. הגליקוגן יכול להיות reversely הידרוליזה לגלוקוז על ידי הפעולה מתואמתשל debranching אנזימים שhydrolyze α (1 → 6) מחויב וphosphorylase גליקוגן שhydrolyzes α (1 → 4) glycosidic כבול בין השאריות האחרונות של גלוקוז של סניף ומולקולת גליקוגן. תגובה זו נקראת "גליקוגנוליסיס מופעלת על ידי הגדלת רמות של AMP (המשקף את צריכת ה-ATP), ומעוכבת על ידי גלוקוז ו-ATP 2,3.
על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, מולקולות גליקוגן תוארו בסוגי תאים רבים חלקיקי β כבחינם (או monoparticles גליקוגן) של 15-30 ננומטר בקוטר. בסוגי תאים ספציפיים, כגון hepatocytes, ניתן להרכיב חלקיקי β למורכבים ליצירת רוזטות, הידוע גם בחלקיקים α המשתנות בקוטר מ 80 ננומטר עד למקסימום של 4 200 ננומטר 5, מליטה מימן, או אפילו דרך אינטראקציות בין חלבונים 6. כמות הגליקוגן מאוחסן בתאים תלויים בפרמטרים רבים: (i) הסכום של glycogenin בתא שיוזם סינתזת הגליקוגן (ii) את הפעילות של synthase הגליקוגן וphosphorylase מוסדר על ידי זירחון חלבון / dephosphorylation; (שלישי) את הריכוז של גלוקוז בתאים, שהוא תלוי במספר פרמטרים כגון אספקת הגלוקוז ממערכת כלי הדם וספיגת הגלוקוז על ידי תאים. מאגרי הגליקוגן מוסדרים בחוזקה על ידי הרגולציה allosteric של הורמוני biosynthetic דרך מטבוליטים ביניים, על ידי הורמונים המסדירים את חילוף חומרים של אנרגיה, ועל ידי מסלולי איתות חישת מזין 7.
חשוב להיותמסוגל לכמת גליקוגן בדגימות ביולוגיות כדי להבין את החשיבות של חילוף חומרים של הגליקוגן בגוף כולו והרמה תאית טוב יותר. אנו מתארים כאן ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה בassay חוץ גופית לגליקוגן. טכניקה זו מבוססת על הקרינה גלוקוז הכימות לפני ואחרי הידרוליזה ספציפית של גליקוגן.
שיטות אחרות קיימות כדי להעריך את הרמה של גליקוגן בתאים, אבל רובם הם לא כמוני. אחת הטכניקות הראשונות שתוארו לכימות של גליקוגן בתאים התבסס על מדידת התאגדות [14 C]-גלוקוז לגליקוגן 8,9. השימוש בקרינה רדיואקטיבית עושה את התהליך הזה קשה יותר להתמודד אבל יש לו את היתרון של מתן שיעור התאגדות גלוקוז לגליקוגן ולהבחין בין ההפצה של שאריות הגלוקוז על הענפים החיצוניים ובליבה של המולקולה (זה גם דורש β-amyloly נוסףאחותי וצעד chromatographic). טכניקה נוספת שפותחה לאחרונה והוא מבוסס על השילוב של 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-י.ל.] אמינו}-2-deoxyglucose), נגזר 2-deoxyglucose ניאון, לגליקוגן 10. עוצמת הקרינה שנמדדה משקפת את כמות הגליקוגן מיוצרת וניתן למדוד עם קורא הקרינה. הפצה של הקרינה בתא גם יכולה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופיה confocal.
בין טכניקות nonquantitative האחרות, מכתים תקופתי חומצה שיף (PAS) הוא אולי הנפוץ ביותר. ניתן להשתמש בו לצורך זיהוי של גליקוגן בתאים קבועים, קטעי רקמה בפרפין או קפואים. צבעי טכניקה היסטולוגית זה לא במיוחד סוכרים, glycolipids, גליקופרוטאינים, תאית וmucins הניטרלי בסגול. הסגוליות של בדיקה זו יכולה להיות מוגבר על ידי טיפול בתאים קבועים או חלקי רקמות עם diastase, שדווקא מעכל גליקוגן. לאחר מכן,רמת הגליקוגן ניתן לאמוד באופן איכותי על ידי השוואת דגימות unhydrolyzed (כל מקרומולקולות הפחמימות שונה) לדגימות שעברו הידרוליזה (פחמימות שונה מקרומולקולות מלבד גליקוגן). צביעת PAS וניתוח מיקרוסקופי, בניגוד למבחנים ביוכימיים של גליקוגן, מספק מידע בנוגע להפצה של גליקוגן בתאים, אשר יכול להיות מפוזרת או מרוכזת בחלק מסוים של התא. עם זאת, אף על פי שהבדלי הערכות צביעת PAS בהצטברות גליקוגן בין תנאים שונים, זה לא כמוני 11.
נוגדן חד שבטי עכבר במקור נעשה באמצעות סחוס condylar mandibular כאנטיגן הוכח להגיב בגליקוגן בתאים ועם גליקוגן מטוהר במבחנה 12. כנוגדן זה דווקא מכיר בשרשרות סוכר הקשורות לגליקוגן, זה הוא כלי שימושי לזיהוי של הגליקוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באופן ספציפי יותר מאשר צביעת PAS. במיקרוסקופ אלקטרונים הוא טכניקה נוספת שמאפשרת הדמיה של דגנים של גליקוגן בתאים והערכה של מידת אחסון גליקוגן. למעשה, חלקיקי β גליקוגן הם קל לזיהוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים כגרגרים צפופים אלקטרון 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כותרות ביוכימית של גליקוגן
1. תמוגה תא
- תאי זרע בריכוז של 0.5-2 x 10 6 לכל 100 צלחת בקוטר מ"מ.
- טיפול: דגירה תאים 24, 48, או 72 שעות בריכוז הנמוך של חמצן (היפוקסיה) בתחנת באג-Box אנאירובי עבודה (הטכנולוגיה Biotrace Plc Ruskinn הבינלאומי, Bridgend, בריטניה) נקבעה על 1% או 0.1% O 2, 94% או 94.9% N 2, ו 5% CO 2. במקביל, תאי דגירה בnormoxia (21% O 2, CO 2 של 5%). שנה בינונית (מדיום המכיל גלוקוז 25 מ"מ) בכל שעה 24 כדי למזער את השינויים בריכוז הגלוקוז בתקופת הניסוי.
- לאחר טיפול, תאים לשטוף 2X עם PBS להסיר עקבות של גלוקוז ממדיום לתרבות. לגרד את התאים בקור PBS.
- צנטריפוגה הפתרון ב1,000 סל"ד במשך 5 דקות, לבטל את supernatant לשטוף את הכדור פעם אחת עם PBS. גלולה יכולה להיות קפוא ב -20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך הלאה.
- Resuspend את הכדור במים מזוקקים 100 μl. הוספה של גליקוגן הידרוליזה הצפת 100 μl מסופק עם גליקוגן ערכת Assay (Abcam). מרתיחים את lysate ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית אנזימים.
- וורטקס ו צנטריפוגות lysate ב13,000 סל"ד 10 דקות כדי להסיר את המוצרים לא מסיסים. שמור את supernatant.
- לנרמל רמות הגליקוגן לתכולת החלבון בין דגימות, כימות של חלבונים ניתן לעשות עם 25-35 μl של supernatant באמצעות assay Bicinchoninic חומצה (BCA-Interchim).
חלק מlysate ניתן להשתמש כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז החופשי בתוך התאים.
2. הידרוליזה של גליקוגן
- מערבבים 50 μl של supernatant (שלב 1) עם 1 μl של הידרוליזה אנזים המיקס. תערובת זו מכילה glucoamylase. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- הכן את עקומת הכיול על ידי דילול גליקוגן הסטנדרטי (2 מ"ג / מיליליטר) שלupplied עם הערכה לפתרון של 10 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר הידרוליזה. בשלב הבא, להכין שישה צינורות נפרדים עם 0, 4, 8, 12, 16, ו20 μl של 10 מיקרוגרם / מיליליטר סטנדרטי ולהתאים את כל צינור לנפח סופי של μl 50 עם חיץ הידרוליזה לתת ריכוז של גליקוגן של 0, 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, ו0.2 מיקרוגרם / מיליליטר. הוסף 1 μl של הידרוליזה אנזים מיקס בסטנדרטים ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
ריכוז הגלוקוז ברקע של הקו הסלולרי, שניתן על ידי ערך עבור ריכוז גלוקוז החופשי, זה חייב להיות מופחת הערך לריכוז המוחלט גלוקוז (גלוקוז מהידרוליזה גליקוגן + חופשי גלוקוז) כדי לקבוע את הרמה של גליקוגן בתאים.
3. פיתוח וקריאה של הקרינה
- עבור כל תנאי, להכין צינור אחד (צינור 1) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז חופשי ושני צינורות (צינורות 2 ו -3) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז בסך הכל (כל שנינות צינורחה נפח שונה של גליקוגן שעבר הידרוליזה).
- הוסף 15 μl של supernatant שחולץ בסופו של שלב 1 בצינור 1. הוסף 35 μl של חיץ הידרוליזה כדי להשלים לנפח סופי של μl 50. הקרינה המתקבלת תיתן את הריכוז הגלוקוז בחינם.
- הוספת μl X של גליקוגן שעבר הידרוליזה (שהושג בשלב 2) בצינור 2. להסתגל לנפח סופי של μl 50. נפח דגימה (X μl) צריך להיות מותאם על פי צפיפות תאים ו / או סוג תא על מנת לקבל ערכי הקרינה שאינם מעבר לריכוזים של עקומת הכיול.
- הוסף 2 μl X של גליקוגן שעבר הידרוליזה בצינור 3. להסתגל לנפח סופי של μl 50.
- הכן פתרון פיתוח לדגימות ולתקנים על ידי ערבוב לכל צינור 48.7 μl של פיתוח מאגר, μl 1 של פיתוח אנזים מיקס ו0.3 μl של OxiRed Probe (מסופק בערכת Assay גליקוגן). לדוגמא, עבור 2 תנאים, להכין תערובת לצינור 12s (6 לסטנדרטים, 2 לגלוקוז חופשי ו4 לסך הקרינה גלוקוז).
- הוסף 50 μl של תערובת זו על צינור אחד ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
- למדוד את הקרינה באורך גל עירור של 535 ננומטר, אורך גל פליטה של 587 ננומטר כפי שהומלץ, וחריץ של 3 ננומטר לעירור ופליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רמה נמוכה של חמצן (היפוקסיה) באותות גידולים לתאי גידול את הצורך לאחסן אנרגיה כדי להתמודד עם דלדול מזין שלאחר מכן, כדי לשרוד. כגליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בתאי יונקים, שחקרנו את ויסות אחסון הגליקוגן בהיפוקסיה. החישוב וסטנדרטיזציה של הריכוז של גליקוגן בlysates התא חייב להתבצע על הנתונים הגולמיים של הקרינה כפי שמוצגים בלוחות 1, 2, ו -3. Assay ביוכימי לגליקוגן אישר כי אגרגטים האלקטרונים צפופים נצפו על micrographs אלקטרונים של תאי CCL39 (איור 2 א) היו גליקוגן חלקיקים (איור 2). ההצטברות של גליקוגן בהיפוקסיה היא תלויה בגורם השעתוק היפוקסיה-העין מתנהלת Factor-1 (HIF-1) (איור 3), גורם שעתוק העיקרי מעורב בהסתגלות סלולרית להיפוקסיה. לבסוף, אנו מראים בסרטן שונה ושורות תאי noncancer שמאגרי הגליקוגן יכולים להיות חילוף חומרים במהירות על ידי התאים בפחות מ 6 שעות (איור 4 א), וכי השימוש בגליקוגן מגן מפני מוות של תאים בתנאים של רעב גלוקוז (איור 4) 1.
טבלת 1.
| Glu. (מיקרוגרם) | 0 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | |
| גלם נתוני הקרינה (RDF) | fluo. | 60 | 88.8 | 106.7 | 121.8 | 148 | 172.1 |
| RDF - רקע (הקרינה ל0 מיקרוגרם בעקומה סטנדרטית) | תיקון | 0 | <strong> 28.8 | 46.7 | 61.8 | 88 | 112.1 |
 | |||||||
| נתונים הגולמיים Fluo. (RDF) | RDF - רקע | (תיקון * 1000) / עקומת סטנדרט מדרון | נפח של מדגם המשמש כדי לכיל גליקוגן | חלבון נתונים גולמי ריכוז-טיפול במשפחה | γ * נפח דגימה | גלוקוז (ng) / סך הכל חלבון | |
| ריכוז הגלוקוז בסך הכל 1 | fluo. | תיקון | גלוקוז (ng) | נפח דגימה | | בסך הכל חלבון | גלוקוז (ng / מיקרוגרם Pr). | |
| לדוגמא 1 (CCL39-NX 1) | 65.8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0.07 | 1.4 | 7.5 |
| דוגמא 2 (CCL39-NX 2) | 64.1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0.11 | 2.2 | 3.4 |
| דוגמא 3 (CCL 39 HX 48 1 שעות) | 177.3 | 117.3 | 211.5 | 4 | 0.22 | 0.88 | 240.3 |
לוח 1.5.
| דוגמא 4 (CCL 39 48h HX 2) | 174.2 | 114.2 | 205.9 | 4 | 0.24 | 0.96 | 214.5 |
| לדוגמא 5 (CCL 39 HX 72 1 שעות) | 164.7 | 104.7 | 188.8 | 2 | 0.22 | 0.44 | 429.1 |
| לדוגמא 6 (CCL 39 HX 72 שעות 2) | 174.7 | 114.7 | 206.8 | 2 | 0.24 | 0.48 | 430.9 |
| נתונים הגולמיים Fluo. (RDF) | RDF - רקע | (תיקון * 1000) / עקומת סטנדרט מדרון | נפח של מדגם המשמש כדי לכיל גליקוגן | חלבון נתונים גולמי ריכוז-טיפול במשפחה | γ * נפח דגימה | גלוקוז (ng) / חלבוןסך הכל | |
| ריכוז הגלוקוז בסך הכל 2 | fluo. | תיקון | גלוקוז (ng) | נפח דגימה | γ (מיקרוגרם / μl) | בסך הכל חלבון | גלוקוז (ng / מיקרוגרם Pr). |
| לדוגמא 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0.07 | 0.7 | 7.7 |
| דוגמא 2 (CCL39-NX 2) | 61.2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0.11 | 1.1 | 2.0 |
| דוגמא 3 (CCL 39 HX 48 1 שעות) | 121.6 | 61.6 | 111.1 | 2 | 0.22 | 0.44 | 252.4 |
| דוגמא 4 (CCL 39 HX 48 שעות 2) | 111.9 | 51.9 | 93.6 | 2 | 0.24 | 0.48 | 195.0 |
| לדוגמא 5 (CCL 39 HX 72 1 שעות) | 110.3 | 50.3 | 90.7 | 1 | 0.22 | 0.22 | 412.3 |
| לדוגמא 6 (CCL 39 HX 72 שעות 2) | 117.8 | 57.8 | 104.2 | 1 | 0.24 | 0.24 | 434.3 |
טבלה 2.
| גלוקוז החופשי | fluo. | correc-tion | גלוקוז (ng) | נפח דגימה | γ (מיקרוגרם / μl) | בסך הכל חלבון | גלוקוז (ng / מיקרוגרם Pr). | ערכים שליליים נחשבים 0 |
| לדוגמא 1 (CCL39-NX 1) | 60.2 | 0.2 | 0.4 | 15 | 0.07 | 1.05 | 0.3 | 0.3 |
| דוגמא 2 (CCL39-NX 2) | 55.3 | -4.7 | -8.5 | 15 | 0.11 | 1.65 | -5.1 | 0 |
| דוגמא 3 (CCL 39 HX 48 1 שעות) | 56.5 | -3.5 | -6.3 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.9 | 0 |
| דוגמא 4 (CCL 39 HX 48 שעות 2) | 56.7 | -3.3 | -6.0 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.7 | 0 |
| לדוגמא 5 (CCL 39 HX 72 1 שעות) | 57.5 | -2.5 | -4.5 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.4 | 0 |
| לדוגמא 6 (CCL 39 HX 72 שעות 2) | 56.9 | -3.1 | -5.6 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.6 | 0 |
לוח 3.
| גלוקוז סה"כ ריכוז-1 טיפול במשפחה | גלוקוז סה"כ ריכוז-טיפול במשפחה 2 | גלוקוז סה"כ ריכוז-tratioממוצע n | גלוקוז חינם ריכוז-טיפול במשפחה | גליקוגן (ng / מיקרוגרם Pr.) (גלוקוז הממוצע הכולל - גלוקוז חינם) | גליקוגן הממוצע (בין Dupli-קייטס) | שגיאת סטן גודארד | |
| לדוגמא 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0.3 | 7.3 | 5.0 | 3.3 |
| דוגמא 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2.0 | 2.7 | 0.0 | 2.7 | ||
| דוגמא 3 (CCL 39 HX 48 1 שעות) | 240.3 | 252.4 | 246.4 | 0.0 | 246.4 | 225.6 | 29.5 |
| סםple 4 (CCL 39 HX 48 שעות 2) | 214.5 | 195.0 | 204.7 | 0.0 | 204.7 | ||
| לדוגמא 5 (CCL 39 HX 72 1 שעות) | 429.1 | 412.3 | 420.7 | 0.0 | 420.7 | 426.6 | 8.4 |
| לדוגמא 6 (CCL 39 HX 72 שעות 2) | 430.9 | 434.3 | 432.6 | 0.0 | 432.6 |
לוחות 1, 2, 3. חישוב ונורמליזציה של תוכן הגליקוגן של תאי CCL39 מdatas שורת הקרינה נציג. גליקוגן היה טיטרציה בCCL39 לאחר הדגירה בnormoxia (NX) או בחוסר החמצן 1% O 2 (Hx) ל48 שעות או 72 שעה. מדידות גליקוגן נעשו בשני עותקים עבור כל תנאי. חלק עליון של
איור 1. חילוף חומרים של הגליקוגן:. סקירה של הסינתזה והפירוק של גליקוגן הגלוקוז נכנס לתוך הציטופלסמה של התאים דרך מובילי גלוקוז (עודפים) להפיכה לגלוקוז-6-phosphate ידי hexokinases 1 ו -2 (HK). Glucose-6-phosphate (G6P) הוא בצומת בין גליקוליזה, מסלול פנטוז פוספט וglycogenesis. Phosphoglucomutase (PGM) הואהאנזים ראשון בglycogenesis שמזרז את ההמרה של G6P לגלוקוז 1 פוספט (G1P), אשר הפך לאחר מכן לתוך UDP-גלוקוז על ידי urydylyltransferase גלוקוז 1 פוספט (UGP). UDP-גלוקוז משמש synthase הגליקוגן (GS) כדי להאריך את מולקולת מעגן היוותה של glycogenin ושאריות הגלוקוז מחוברות על ידי אנזים הסתעפות (BE). synthase הגליקוגן ואנזימי הסתעפות לשתף פעולה ביצירת גליקוגן, שנקראו גם glycogenesis. התהליך ההפוך שhydrolyzes גליקוגן לG1P באמצעות phosphorylase גליקוגן (GP) ואנזימי debranching (DBE) נקרא "גליקוגנוליסיס. מעובד מתוך 3.
איור 2. הצטברות של גליקוגן בהיפוקסיה בתאים סרטניים שאינם ותאים סרטניים. Micrografts אלקטרונים של CCL39 בnormoxia (NX) (פנל משמאל) (א) ו היפוקסיה O 1% 2 (1% Hx60; 96 שעה) (פנל מימין). חיצים מציינים מצרפים של חלקיקי גליקוגן. Quantitation (ב ') מהסכום של גליקוגן בCCL39 (פסים שחורים) וLS174 תאים (פסים לבנים) גדלו בnormoxia (NX) או היפוקסיה O 1% 2 (1% Hx) ל48, 72, ו96 שעות ב25 בינוני המכיל גלוקוז מ"מ.
איור 3. הצטברות של גליקוגן בהיפוקסיה תלויה בHIF-1. כימות של כמות הגליקוגן בLS174 pTerHIF-1α. תאים אלה הם שיבוטים מושרה להביע shRNA נגד HIF-1α במצב של טטרציקלין. תאים גדלו בnormoxia (NX) (פסים לבנים) או היפוקסיה O 0.1% 2 (Hx 0.1% - פסים שחורים) בהעדר (-) או הנוכחות (+) של טטרציקלין (ט).
איור 4. גליקוגן Storage מגן מפני מוות של תאים. (א), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF-7 (●), ומד"א-MB231 (x) תאים היו נתונים ל1% היפוקסיה 2 O ל96 שעה ולאחר מכן בתרבית בינונית ללא גלוקוז ל6 שעות. ריכוז הגליקוגן נמדד רק לפני ההסרה של גלוקוז ומייצג 100%. גליקוגן נמדד מכן בבית 1, 3, ו 6 שעות. התוצאות הן נציג של לפחות שלושה ניסויים נפרדים. מדידה (ב ') למוות של תאים בתאי CCL39. תאים היו נתונים או normoxia (- אחסון) או היפוקסיה (+ אחסון) ל96 שעה וטופחו במדיום נטול גלוקוז בהיפוקסיה ל24 שעות לפני מדידת מוות של תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיטרציה ביוכימית של גליקוגן במבחנה מאפשרת כימות מדויק של תוכן גליקוגן בתאים. השוואה לכמה טכניקות אחרות (PAS, immunofluorescence עם נוגדן גליקוגן, וכו '.), טיטרציה זו היא ספציפית מאוד, רגישה ושחזור. יתר על כן, השיטה היא נוחה שכן הוא לא דורש רדיואקטיביות אבל ספקטרומטר הקרינה. עם זאת, טכניקה זו היא אך ורק כמוני ואינה מספקת מידע על חלוקת גליקוגן בתאים.
הטכניקה המתוארת בכתב היד הזה מושגת על תמציות תא אבל זה גם יכול להיות מושגת על סעיפי רקמות עם שיטה מתאימה לחילוץ של גליקוגן מרקמות. assay זה נמצא בשימוש במבחנת יישומים ובשל מדידה עקיפה של גליקוגן (לאחר הידרוליזה לגלוקוז), זה לא יכול להיות שפותח כדי לעקוב אחר מאגרי הגליקוגן בגוף חי.
צביעת PAS היא כבר נרחבתמשמש לאבחון מחלות אגירת גליקוגן רבות (מחלת פון Gierke, מחלת קורי, מחלת מקארדל, וכו '). כמו כן הוא משמש לאיתור זיהומים פטרייתיים או להפלות בין תת השונים של גידולים. בתאוריה, צביעת PAS יכולה להיות יחד למנתח תמונה כדי לקבוע את ריכוז הגליקוגן. בפועל, טכניקה זו היא קשה לביצוע והוא פחות מתאים מאשר בשיטה שתוארה כאן מהסיבות הבאות. ראשית, כפי שמכתים PAS חיובי (סגולה) חופף עם מכתים השלילי (הכחול Hematoxylin), זה קשה מבחינה טכנית להוציא את האיתות השלילית מבלי להסיר את האיתות החיובית. בנוסף, צביעת PAS היא לא לשעתק מספיק כדי לכמת גליקוגן, בגלל האינטנסיביות של הצבע יכולה להיות תלויה בזמן של קיבעון, יעילות של צבע, כביסה, וכו '. לבסוף, המתודולוגיה ביוכימיים זה נותנת ריכוז הגליקוגן ממוצע למספר גדול של תאים, ואילו צביעת PAS מתמקדת תחום ספציפי ולכן הוא פחות מייצג של ריכוז הגליקוגן בכללותה.
Assay ביוכימיים של גליקוגן יכול לספק נתונים מדויקים מאוד ואינפורמטיבי על רמת הגליקוגן ברקמות. נתונים אלה יכולים למשל להיות מתואמים באופן היפותטי עם התקדמות מחלה, או עשוי לסייע להבין את ההשפעות של טיפול על חילוף חומרים של הגליקוגן. מצד השני, טכניקה זו דורשת מספר שלבים (quantitation חלבון, הידרוליזה של גליקוגן ומינימום של שלוש קריאות הקרינה לדגימה), ונראית פחות מעשי מאשר צביעת PAS. להבנה טובה יותר של חילוף החומרים הפיסיולוגיים או pathophysiological (הסרטן, וכו '.), חשוב לכמת את רמת הסוכר (וה-ATP) המסופקת על ידי גליקוגן בדיוק. עם זאת, כימות גליקוגן לבדו אינה מספיק כדי להבין את חילוף החומרים של הגליקוגן וחייבת להיות בשילוב עם מיקרוסקופ כדי לקבוע את ההתפלגות של גליקוגן בתאים.
NT "> חשוב לציין שלמרות הדיוק והשחזור של assay זה, שינויים קלים בתכולת החלבון יכולים להוביל לשינויים גדולים של ערכים מנורמלים של גליקוגן. בנוסף, למרות שיש גידול ליניארי בקרינה עם ריכוז הגליקוגן, ליניאריות לא נשמר בריכוז גבוה שלאות יורדת באופן דרמטי. לכן, אנו ממליצים שלא לקחת בחשבון את ערכי הקרינה מעבר לריכוזים של עקומת הכיול. לכן אנו ממליצים לבצע שתי קריאות עם שני כרכי מדגם שונים. ב בדרך זו הקרינה משקפת את גליקוגן בתאים ולא קוזזה על ידי ירידה בקרינה.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר טיירי Pourcher על שאפשר לנו להשתמש בספקטרומטר הקרינה ועל עזרתו. המעבדה ממומנת על ידי Ligue Nationale Contre le הסרטן (labellisée Equipe), האיגוד לשפוך la משוכלל ונדיר contre le סרטן, המכון הלאומי du הסרטן (Inca), Nationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר, METOXIA (תכנית האיחוד האירופי FP7), המרכז א Lacassagne, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique, Institut National de la סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale ואוניברסיטת ניס (http://www.unice.fr/isdbc/). אנו מודים לד"ר M כריסטיאן Brahimi-הורן לקריאה ביקורתית ועריכת תיקון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. "Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. Theory and practice of histotechnology. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
