Summary
Мы описываем здесь точный, воспроизводимый и удобный биохимический метод титрования гликогена в пробирке. Этот метод использует набор для анализа Abcam гликогена и основан на последовательном гидролиза гликогена в глюкозу и глюкозы титрования по флуоресценции.
Abstract
Гликоген является основным энергичный полимер глюкозы в позвоночных животных и играет решающую роль во всей обмен веществ, а также в клеточном метаболизме. Многие методы для обнаружения гликогена уже существуют, но лишь немногие из них количественный. Мы описываем здесь метод, используя набор для анализа Abcam гликогена, который основан на определенной деградации гликогена в глюкозу по глюкоамилазой. Глюкоза затем окисляют в частности к продукту, который реагирует с зондом OxiRed для получения флуоресценции. Титрование является точным, чувствительным и может быть достигнуто на клеточных экстрактов или срезов тканей. Однако, в отличие от других методов, он не дает информацию о распределении гликогена в клетке. В качестве примера этого метода описаны здесь титрование гликогена в двух клеточных линий, китайского хомячка фибробластов легких CCL39 человека и LS174 карциномы толстой кишки, инкубированных в нормоксии (21% O 2) в сравнении с гипоксией (1% O 2). Мы предположили, что гипоксия является сигАнал, что готовит клетки синтезировать и хранить гликоген, чтобы выжить 1.
Introduction
Гликоген multibranched полимер из остатков глюкозы, который присутствует в цитоплазме многих типах клеток. Это один из основных форм накопления энергии в клетках и играет важную роль в метаболизме глюкозы. Большинство клеток млекопитающих способны производить и хранить гликоген, который можно быстро разлагается на глюкозу для продвижения гликолиза и производство АТФ при метаболическом стрессе. Гепатоциты производить огромное количество гликогена регулировать уровень сахара в крови, тем самым, обеспечивая непрерывную подачу глюкозы в организме. В противоположность этому, концентрация гликогена в других клетках (мышцы, клетки крови, и т.д.) является относительно низким. Тем не менее, на местном уровне, эти величины являются достаточными для обеспечения энергии в краткосрочной перспективе, когда клетки вдруг подвергается среде, лишенной питательных веществ.
Синтез гликогена и распад гликогена те же шаги во всех тканях (рис. 1). Во-первых, глюкозапроникает в клетку путем переносчиков глюкозы (излишкам), и быстро превращается из глюкозо-6-фосфата (G6P) в глюкозо-1-фосфата (G1P) по фосфоглюкомутазы. G1P затем модифицируется на UDP-глюкозы, и атом углерода, С1 UDP-глюкозы прикреплен к остатка тирозина, glycogenin анкерного белка гликогена. Эта молекула, считается гликогена грунтовка, продлевается на крепления UDP-глюкозы в терминал глюкозы с помощью α (1 → 4) облигаций через гликогенсинтазы. Наконец, когда линейной цепочки более 11 остатков глюкозы образуется, ветвления фермент передает терминала олигосахарид, образованную как минимум 6 глюкозных остатков глюкозы в другой цепи около через α (1 → 6) связей. Повторение этого процесса дает массивный фрактальной структуры, содержащий ветви, которые образуют спираль с 6,5 глюкозы на очереди. Гликоген может быть обратно гидролизованный до глюкозы согласованных действийиз обрезка сучьев ферменты, которые гидролиза α (1 → 6) связан и гликогенфосфорилазы, что гидролизует α (1 → 4) гликозидную грань между последним остатком глюкозы филиала и молекулы гликогена. Эта реакция называется гликогенолиз активируется за счет увеличения уровня АМФ (отражающие потребление АТФ), и ингибируется глюкозой и АТФ 2,3.
С помощью электронного микроскопа, молекулы гликогена были описаны во многих типах клеток, как β свободных частиц (или гликогена monoparticles) 15-30 нм в диаметре. В конкретных типов клеток, таких как гепатоцитов, β частицы могут быть собраны в комплексе с образованием розетки, также известный как α частиц, которые изменяются в диаметре от 80 нм до не более 200 нм 4 5, водородных связей, или даже через белок-белковых взаимодействий 6. Количество гликогена, запасенного в клетках зависит от многих параметров: (I) количество glycogenin в клетке, который инициирует синтез гликогена; (II) активность гликоген-синтазы и фосфорилазы, регулируемой фосфорилирования белка / дефосфорилирования; (III) концентрация глюкозы в клетках, который зависит от нескольких параметров, таких как поставку глюкозы из сосудистой системы и усвоения глюкозы клетками. Запасы гликогена жестко регулируется аллостерической регуляции биосинтеза гормонов через промежуточные метаболиты, гормонами, регулирующими энергетический обмен, а питательных зондирования сигнальных путей 7.
Важно бытьв состоянии определить количество гликогена в биологических образцах, чтобы лучше понять важность обмена гликогена в всего тела и клеточном уровне. Мы описываем здесь точное, воспроизводимое и удобный биохимические в анализе пробирке для гликогена. Этот метод основан на флуоресценции количественное глюкозы до и после определенного гидролиза гликогена.
Другие методы существуют, чтобы оценить уровень гликогена в клетках, но большинство из них не являются количественными. Одним из первых методов, описанных для количественного определения гликогена в клетках была основана на измерении [14 C]-глюкозы в гликоген включения 8,9. Использование радиоактивности делает этот процесс более сложным делом, но оно имеет преимущество в обеспечении скорости глюкозы в гликоген включения и в различении между распределением остатков глюкозы на внешних ветвей и в сердцевине молекулы (это также требует дополнительная β-amylolyсестра и хроматографический шаг). Другой метод был разработан в последнее время и основан на включении 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-окса-1 ,3-тиадиазол-4-ил] амино}-2-дезоксиглюкозы), 2-дезоксиглюкозы люминесцентные производная, в гликоген 10. Измеренная интенсивность флуоресценции отражает количество гликогена, полученный и может быть измерена с читателем флуоресценции. Распределение флуоресценции в клетке также может быть оценена с помощью конфокальной микроскопии.
Среди других неколичественных методов, Периодическая кислота-Шифф окрашивание (PAS) является, пожалуй, наиболее распространенным. Он может быть использован для обнаружения гликогена в фиксированных клеток, тканевых срезов в парафин, либо заморожены. Это гистологические цвета техника, не специально полисахариды, гликолипиды, гликопротеины, целлюлоза и нейтральные муцины в фиолетовый. Специфичность этого теста может быть увеличена путем обработки основных клеток или срезов ткани с диастаза, который специфически переваривает гликоген. После этогоуровень гликогена может быть качественно оценивается путем сравнения негидролизованной образцы (все углеводов изменение макромолекулы) гидролизованными образцов (углеводов изменение макромолекулы кроме гликогена). PAS окрашивания и микроскопический анализ, в отличие от биохимических анализов гликогена, предоставляет информацию о распределении гликогена в клетке, которая может быть рассеянный или сконцентрированных в определенной части клетки. Однако, даже если оценках окрашивания PAS различий в накоплении гликогена между различными условиях, это не количественный 11.
Мышиные моноклональные антитела первоначально с использованием нижнечелюстной мыщелкового хряща в качестве антигена было показано, реагируют с гликогена в клетках и очищенной гликогена в пробирке 12. Как это антитело специфически распознает гликогена, связанных сахарных цепей, это является полезным инструментом для выявления гликогена по иммуногистохимии в более конкретном способом, чем окрашивания PAS. Электронная микроскопия является другая техника, которая позволяет визуализировать зерен гликогена в клетках и оценки степени гликогена. На самом деле, гликогена β частицы легко узнаваемы с электронной микроскопии как электронных плотных гранул 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Биохимический Титрование гликогена
1. Лизиса клеток
- Семенной клетки в концентрации 0,5-2 × 10 6 на 100 мм диаметра блюдо.
- Лечение: инкубировать клетки 24, 48, или 72 часа в низкой концентрации кислорода (гипоксия) в Буг-Box анаэробной рабочей станции (Ruskinn Технология Biotrace International Plc, Bridgend, Великобритания), установленной на 1%, или на 0,1% O 2, 94% или 94,9% N 2, и 5% СО 2. Параллельно, инкубировать клетки в нормоксии (21% O 2, 5% СО 2). Изменение среды (25 мМ глюкозо-содержащую среду) каждые 24 ч, чтобы минимизировать изменения в концентрации глюкозы во время эксперимента.
- После обработки клетки мыть 2x с PBS, чтобы удалить следы глюкозы из культуральной среды. Очистите клеток в холодной PBS.
- Центрифуга решение при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин, отбросить супернатант и промывают осадок один раз ЗФР. Осадок могут быть заморожены при -20 ° С, прежде чем продолжить.
- Ресуспендируют осадок в 100 мкл дистиллированной воды. Добавить 100 мкл гликогена гидролиза буфера, поставляемые с гликогена Пробирной Kit (Abcam). Кипятите лизат при 95 ° С в течение 5 мин для инактивации ферментов.
- Vortex и центрифуга лизат при 13000 оборотах в минуту в течение 10 мин, чтобы удалить нерастворимые продукты. Держите супернатант.
- Для нормализации уровня гликогена в содержании белка между образцами, количественное определение белков может быть сделано с 25-35 мкл супернатанта с использованием анализа бицинхониновой кислоты (BCA-Interchim).
Некоторые из лизата может быть использован для измерения концентрации глюкозы в свободное внутри клеток.
2. Гидролиз гликогена
- Смешать 50 мкл супернатанта (шаг 1) с 1 мкл смеси ферментов гидролиза. Эта смесь содержит глюкоамилазу. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Подготовка калибровочной кривой путем разбавления стандартного гликоген (2 мг / мл) сupplied с комплектом к раствору 10 мкг / мл в буфере гидролиза. Далее, подготовить шесть отдельных трубок с 0, 4, 8, 12, 16 и 20 мкл 10 мкг / мл стандарта и регулировать каждую пробирку до конечного объема 50 мкл буфером гидролиза с получением концентрации гликогена из 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16 и 0,2 мкг / мл. Добавить 1 мкл смеси ферментов гидролиза в стандартах и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
Фон концентрация глюкозы из клеточной линии, задается значением для свободного концентрации глюкозы, необходимо вычесть из значения для общей концентрации глюкозы (глюкозы от гликогена гидролиза + свободного глюкозы) для определения уровня гликогена в клетке.
3. Разработка и чтение флуоресценции
- Для каждого состояния, готовить одну трубку (трубка 1) для измерения концентрации свободной глюкозы и две трубки (трубок 2 и 3) для измерения общей концентрации глюкозы (каждая трубка с домашнимха отличается объем гидролизованного гликогена).
- Добавить 15 мкл супернатанта, извлеченные в конце стадии 1 в трубке 1. Добавить 35 мкл буфера для завершения гидролиза до конечного объема 50 мкл. Полученные флуоресценции даст концентрацию свободной глюкозы.
- Добавить X мкл гликогена гидролизованного (полученного на стадии 2) в трубе 2. Регулировка до конечного объема 50 мкл. Объем пробы (Х мкл) должен быть отрегулирован в соответствии с плотностью клеток и / или типа клеток с целью получения флуоресценции значения, которые не выходят за рамки концентраций калибровочной кривой.
- Добавить 2 X мкл гидролизованного гликогена в трубке 3. Регулировка до конечного объема 50 мкл.
- Приготовьте раствор разработки для образцов и стандартов путем смешивания для каждой трубки 48,7 мкл буфера развития, 1 мкл развития ферментной смеси и 0,3 мкл OxiRed Probe (поставляется в гликоген Пробирной Kit). Например, в течение 2 условиях приготовить смесь в течение 12 трубкис (6 стандартов, 2 для свободной глюкозы и 4 на общую флуоресценции глюкозы).
- Добавить 50 мкл этой смеси в каждую пробирку и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
- Измерьте флуоресценции при длине волны возбуждения 535 нм, длине волны эмиссии 587 нм в соответствии с рекомендациями, и щель 3 нм для возбуждения и эмиссии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Низкий уровень кислорода (гипоксии) в опухолях сигналов к опухолевым клеткам нужно хранить энергию для обработки последующее истощение питательных веществ, таким образом, чтобы выжить. Как гликоген является основным энергичный полимер глюкозы в клетках млекопитающих, мы изучали регуляцию гликогена в гипоксии. Расчет и стандартизации концентрации гликогена в клеточных лизатах должны быть выполнены на необработанных данных флуоресценции, как показано в таблицах 1, 2 и 3. Биохимический анализ для гликогена подтвердил, что электронно-плотные агрегаты наблюдается на электронные микрофотографии CCL39 клеток (рис. 2А) были гликоген частицы (рис. 2В). Накопление гликогена в гипоксии зависит от фактора транскрипции Гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) (рис. 3), основным фактором транскрипции участвует в клеточном адаптации к гипоксии. Наконец, мы демонстрируем в различных рака иnoncancer клеточные линии, которые хранятся гликогена может быть быстро метаболизируются клеткой менее чем 6 часов (рис. 4А), и что использование гликогена защищает от гибели клеток в условиях голодания глюкозы (фиг.4В) 1.
Таблица 1.
| Glu. (Мкг) | 0 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0,2 | |
| Необработанных данных флуоресценции (RDF) | флуоресценции. | 60 | 88.8 | 106.7 | 121.8 | 148 | 172,1 |
| RDF - Фон (флуоресценция при 0 мкг в стандартной кривой) | коррекция | 0 | <сильный> 28.8 | 46.7 | 61.8 | 88 | 112,1 |
 | |||||||
| Raw Data Флуо. (RDF) | RDF - История | (Коррекция * 1000) / стандарт наклон кривой | Объем образца использовали для титрования гликоген | Сырой протеин данных концентрация | γ * объем образца | Глюкоза (нг) / общий белок | |
| Общая концентрация глюкозы 1 | флуоресценции. | коррекция | глюкозы (нг) | объем образца | | общий белок | глюкозы (нг / мкг Pr.) | |
| Образец 1 (CCL39-NX 1) | 65.8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0.07 | 1.4 | 7.5 |
| Образец 2 (CCL39-NX 2) | 64.1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0.11 | 2.2 | 3.4 |
| Образец 3 (CCL 39 HX 48 ч 1) | 177,3 | 117.3 | 211.5 | 4 | 0.22 | 0,88 | 240,3 |
Таблица 1.5.
| Образец 4 (CCL 39 HX 48 часов 2) | 174,2 | 114.2 | 205,9 | 4 | 0.24 | 0.96 | 214.5 |
| Образец 5 (CCL 39 HX 72 часа 1) | 164.7 | 104,7 | 188,8 | 2 | 0.22 | 0.44 | 429,1 |
| Образец 6 (CCL 39 HX 72 часа 2) | 174,7 | 114.7 | 206.8 | 2 | 0.24 | 0.48 | 430,9 |
| Raw Data Флуо. (RDF) | RDF - История | (Коррекция * 1000) / стандарт наклон кривой | Объем образца использовали для титрования гликоген | Сырой протеин данных концентрация | γ * объем образца | Глюкоза (нг) / белокобщий | |
| Общая концентрация глюкозы 2 | флуоресценции. | коррекция | глюкозы (нг) | объем образца | γ (мкг / мкл) | общий белок | глюкозы (нг / мкг Pr.) |
| Образец 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0.07 | 0.7 | 7.7 |
| Образец 2 (CCL39-NX 2) | 61.2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0.11 | 1.1 | 2.0 |
| Образец 3 (CCL 39 HX 48 ч 1) | 121,6 | 61.6 | 111.1 | 2 | 0.22 | 0.44 | 252,4 |
| Образец 4 (CCL 39 HX 48 часов 2) | 111.9 | 51.9 | 93.6 | 2 | 0.24 | 0.48 | 195.0 |
| Образец 5 (CCL 39 HX 72 часа 1) | 110.3 | 50.3 | 90.7 | 1 | 0.22 | 0.22 | 412,3 |
| Образец 6 (CCL 39 HX 72 часа 2) | 117.8 | 57.8 | 104.2 | 1 | 0.24 | 0.24 | 434.3 |
Таблица 2.
| бесплатно глюкозы | флуоресценции. | поправочного | глюкозы (нг) | объем образца | γ (мкг / мкл) | общий белок | глюкозы (нг / мкг Pr.) | отрицательные значения рассматриваются как 0 |
| Образец 1 (CCL39-NX 1) | 60.2 | 0,2 | 0,4 | 15 | 0.07 | 1.05 | 0.3 | 0.3 |
| Образец 2 (CCL39-NX 2) | 55.3 | -4.7 | -8.5 | 15 | 0.11 | 1.65 | -5.1 | 0 |
| Образец 3 (CCL 39 HX 48 ч 1) | 56.5 | -3.5 | -6.3 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.9 | 0 |
| Образец 4 (CCL 39 HX 48 часов 2) | 56.7 | -3.3 | -6.0 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.7 | 0 |
| Образец 5 (CCL 39 HX 72 часа 1) | 57.5 | -2.5 | -4.5 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.4 | 0 |
| Образец 6 (CCL 39 HX 72 часа 2) | 56.9 | -3.1 | -5.6 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.6 | 0 |
Таблица 3.
| Всего глюкозы концентрация 1 | Всего глюкозы концентрация 2 | Всего глюкозы концентра-tratioн среднем | Бесплатный глюкозы концентрация | Гликоген (нг / мкг Pr.) (Общая средняя глюкозы - бесплатно глюкоза) | Средний гликогена (между дубликаты) | Ошибка стандартной | |
| Образец 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0.3 | 7.3 | 5.0 | 3.3 |
| Образец 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2.0 | 2.7 | 0.0 | 2.7 | ||
| Образец 3 (CCL 39 HX 48 ч 1) | 240,3 | 252,4 | 246.4 | 0.0 | 246.4 | 225.6 | 29.5 |
| СэмPLE 4 (CCL 39 HX 48 часов 2) | 214.5 | 195.0 | 204,7 | 0.0 | 204,7 | ||
| Образец 5 (CCL 39 HX 72 часа 1) | 429,1 | 412,3 | 420,7 | 0.0 | 420,7 | 426.6 | 8.4 |
| Образец 6 (CCL 39 HX 72 часа 2) | 430,9 | 434.3 | 432.6 | 0.0 | 432.6 |
Таблицы 1, 2, 3. Представитель расчет и нормализация содержания гликогена в CCL39 клеток из флуоресцентных строк DATAS. Гликоген титруют CCL39 после инкубации в нормоксии (NX) или в гипоксии 1% О 2 (HX) для 48 часов или 72 часов. Измерения гликогена были сделаны в двух экземплярах для каждого условия. Верхняя часть
Рисунок 1. Метаболизме гликогена. Обзор синтеза и деградации гликогена глюкоза поступает в цитоплазму клетки через переносчиков глюкозы (излишкам) для превращения в глюкозо-6-фосфат с помощью гексокиназ 1 и 2 (HK). Глюкозо-6-фосфат (G6P) находится на стыке между гликолиза, пентозофосфатного пути и гликогенеза. Фосфоглюкомутазы (PGM) являетсяпервый фермент в гликогенеза, который катализирует превращение глюкозы в G6P 1-фосфата (G1P), который затем преобразуется в UDP-глюкозы глюкоза-1-фосфат urydylyltransferase (УГП). UDP-глюкоза используется гликогенсинтазы (GS), чтобы удлинить опоре молекулу, состоящую из glycogenin и остаток глюкозы, придаваемое ветвления фермента (BE). Гликогенсинтаз и разветвленные ферменты сотрудничать в формировании гликогена, также называемый гликогенез. Обратный процесс, который гидролизует гликоген в G1P через гликогенфосфорилазы (GP) и деветвящего ферментов (DBE) называется гликогенолиз. Взято из 3.
Рисунок 2. Накопление гликогена в гипоксии в не раковых клеток и раковых клеток. (А) Электронные микрографты из CCL39 в нормоксии (NX) (слева) и гипоксия 1% О 2 (Нг 1%60; 96 час) (правая панель). Стрелки обозначения комплекса гликогена частиц. (B) Количественный анализ количества гликогена в CCL39 (черные столбцы) и LS174 (белые столбики) клеток, выращенных в нормоксии (Nx) или гипоксии 1% O 2 (Hx 1%) в течение 48, 72 и 96 часов в 25 мМ глюкозо-содержащую среду.
Рисунок 3. Накопление гликогена в гипоксии зависит от HIF-1. Количественной оценки количества гликогена в LS174 pTerHIF-1α. Эти клетки индуцибельные клоны, экспрессирующие shRNA против HIF-1α в состоянии тетрациклина. В отсутствие (-) или присутствии (+) тетрациклина (TET) - клетки росли в нормоксии (NX) (белые столбики) или гипоксия 0,1% O 2 (черные полосы Hx 0,1%).
Рисунок 4. Гликоген StoraGE защищает от гибели клеток. (А), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF-7 (●) и MDA-MB231 (х) клетки подвергали 1% O 2 гипоксии в течение 96 ч и затем культивировали в среде без глюкозы в течение 6 ч. Концентрация гликогена было измерено непосредственно перед удалением глюкозы и составляет 100%. Гликоген Затем измеряли через 1, 3 и 6 час. Результаты являются репрезентативными по меньшей мере трех отдельных экспериментов. (B) Измерение клеточной гибели в CCL39 клеток. Клетки были подвергнуты либо нормоксии (-) хранения или гипоксии (+) для хранения 96 часов и инкубировали в среде без глюкозы в гипоксии в течение 24 часов перед измерением гибели клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Биохимический титрование гликогена в пробирке позволяет точно количественное клеток гликогена содержания. По сравнению с некоторыми другими методами (PAS, иммунофлюоресценции с гликогена антитела, и т.д..), Это титрования очень специфичен, чувствителен и воспроизводимым. Кроме того, метод удобен, поскольку он не требует радиоактивности, но флуоресцентного спектрометра. Однако этот метод является чисто количественный и не обеспечивает информацию о распределении гликогена в клетке.
Методике, описанной в этой рукописи достигается на клеточных экстрактов, но она также может быть достигнуто на срезах тканей с соответствующим способом для извлечения гликогена из тканей. Этот анализ используют для применения в пробирке и за счет косвенного измерения гликогена (после гидролиза в глюкозу), он не может быть разработан, чтобы следовать гликогена в естественных условиях.
PAS окрашивания уже широкоиспользуется для диагностики многих заболеваний накоплением гликогена (болезнь фон Гирке, болезнь Кори, болезнь Макардл, и т.д.). Он также используется для обнаружения грибковых инфекций или для различения разных подтипов опухолей. В теории, окрашивание PAS может быть соединен с помощью анализатора изображения для определения концентрации гликогена. На практике этот метод трудно выполнить и меньше подходящим, чем методом, описанным здесь по следующим причинам. Во-первых, как PAS положительное окрашивание (фиолетовый) перекрывается с отрицательным окрашиванием гематоксилином-(синий), технически трудно исключить отрицательный сигнал без удаления положительный сигнал. Кроме того, окрашивание PAS не достаточно воспроизводимый количественно гликогена, так как интенсивность цвета может зависеть от времени фиксации, эффективность окрашивания, промывки и др. Наконец, этот биохимический методика дает среднюю концентрацию гликогена для большого количества клеток, в то время как окрашивание PAS фокусируется на определенное поле и, следовательно, меньше представитель общей концентрации гликогена.
Биохимический анализ гликогена может обеспечить очень точные и информативные данные об уровне гликогена в ткани. Эти данные могут быть, например, гипотетически коррелирует с прогрессированием заболевания, или может помочь понять эффекты лечения на метаболизм гликогена. С другой стороны, этот метод требует нескольких шагов (белок количественного, гидролиза гликогена и минимум трех чтениях флуоресценции на образец), и, кажется, менее практичным, чем окрашивание PAS. Для лучшего понимания физиологической или патофизиологической метаболизма (рака и т.д.)., Важно дать точную количественную оценку глюкозы (АТФ) и представленную гликогена. Тем не менее, один гликоген количественное недостаточно, чтобы понять метаболизме гликогена и должны быть соединены с микроскопом, чтобы определить распределение гликогена в клетках.
нт "> Важно отметить, что, несмотря на точность и воспроизводимость этого анализа, небольшое изменение в содержании белка может привести к большим изменениям нормированных значений гликогена. Кроме того, хотя существует линейное увеличение флуоресценции с Концентрация гликогена, линейность не поддерживается при высокой концентрации в течение которого сигнал падает резко. Таким образом, мы рекомендуем не принимать во внимание флуоресценции значения за пределами концентраций калибровочной кривой. Поэтому мы рекомендуем выполнять два чтения с двумя разными объемами образца. В Таким образом флуоресценции отражает гликогена в клетках и не компенсируется уменьшением флуоресценции.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны доктору Тьерри Pourcher за предоставленную нам возможность использовать флуоресцентный спектрометр и за его помощь. Лаборатория финансируется Ligue Nationale Contre ле рака (Моя команда labellisée), Ассоциация Pour La Recherche Контр ле рака, Национальный институт дю Рак (Inca), Национальное агентство по Pour La Recherche, METOXIA (программа ЕС FP7), Центр А. Lacassagne, Национальный центр Научных Исследований, Национальный институт де-ла-Здоровье и де ла Recherche Médicale и Университета Ниццы ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Мы благодарим доктора M Кристиан Брахими-рог для критического чтения и редакционной коррекции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R.
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. "Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. Theory and practice of histotechnology. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
