Summary
Vi beskriver her en præcis, reproducerbar og bekvem biokemisk metode til titrering af glykogen in vitro. Denne teknik bruger Abcam glykogen assaykittet og er baseret på successiv hydrolyse af glykogen til glukose og glukose titrering med fluorescens.
Abstract
Glycogen er den vigtigste energisk polymer af glucose i hvirveldyr og spiller en afgørende rolle i hele kroppen stofskifte samt i cellulær metabolisme. Der findes mange metoder til påvisning glykogen allerede, men kun få er kvantitativ. Vi beskriver her en fremgangsmåde, ved hjælp af Abcam glykogen assay kit, som er baseret på specifikke nedbrydning af glycogen til glucose med glucoamylase. Glucose derefter specifikt oxideres til et produkt, der reagerer med OxiRed proben til at producere fluorescens. Titrering er præcis, følsom og kan opnås på celleekstrakter eller vævssnit. Men i modsætning til andre teknikker, er det ikke at give information om fordelingen af glykogen i cellen. Som et eksempel på denne teknik, vi beskriver her titrering af glykogen i to cellelinier, kinesisk hamster lungefibroblast CCL39 og human coloncarcinom LS174, inkuberet i normoxi (21% O 2) versus hypoxi (1% O 2). Vi antager, at hypoxi er en væsentnal, der forbereder celler til at syntetisere og lagre glycogen for at overleve 1.
Introduction
Glycogen er et multibranched polymer af glucoserester der er til stede i cytoplasmaet i mange celletyper. Det er en af de vigtigste former for energilagring i celler og spiller en vigtig rolle i glukosemetabolismen. De fleste pattedyrceller er i stand til at producere og opbevare glykogen, som kan nedbrydes hurtigt til glukose for at fremme glykolyse og ATP produktion i metabolisk stress. Hepatocytter producerer enorme mængder af glycogen til at regulere blodsukker, hvorved der tilvejebringes en kontinuerlig forsyning af glucose til kroppen. I modsætning hertil er koncentrationen af glykogen i andre celler (muskler, røde blodlegemer, osv.) er forholdsvis lav. Men lokalt, disse mængder er tilstrækkelige til at give energi på kort sigt, når cellerne pludselig udsættes for et miljø frataget næringsstoffer.
Glycogensyntese og glycogennedbrydning følger de samme trin i alle væv (figur 1). For det første, glucosetrænger ind i celler ved glukosetransportører (gluts), og hurtigt omdannes fra glucose-6-phosphat (G6P) til glucose-1-phosphat (G1P) ved phosphoglucomutase. G1P modificeres derefter i UDP-glucose og carbon C1 UDP-glucose er bundet til en tyrosinrest af glycogenin, forankring proteinet af glykogen. Dette molekyle, som en glycogen primer forlænges ved fastgørelse af UDP-glucose til terminalen glucose af en α (1 → 4)-binding via glycogensyntase. Endelig skal en lineær kæde af over 11 glucoserester er dannet, forgreningsenzymet overfører en terminal oligosaccharid udgøres af mindst 6 glucoserester anden glucose af kæden i nærheden via en α (1 → 6)-binding. Gentagelsen af denne proces giver en massiv fraktal struktur, der indeholder grene, der danner en spiral med 6,5 glucose pr tur. Glykogen kan være omvendt hydrolyseres til glucose af den samordnede aktionaf afgrening enzymer, der hydrolyserer den α (1 → 6) bundne og glycogenphosphorylase der hydrolyserer α (1 → 4)-glycosidisk bundet mellem den sidste rest af glucose af en filial og glykogen molekyle. Denne reaktion kaldes glycogenolyse aktiveres ved at øge niveauet af AMP (afspejler ATP forbrug) og hæmmes af glucose og ATP 2,3.
Ved elektronmikroskopi har glycogen-molekyler blevet beskrevet i mange celletyper β frie partikler (eller glykogen monopartikler) på 15-30 nm i diameter. I særlige celletyper såsom hepatocytter, kan β partikler samlet til et sammensat til at danne rosetter, også kendt som α-partikler, der varierer i diameter fra 80 nm til et maksimum på 200 nm 4 5, hydrogenbinding, eller selv gennem protein-protein interaktioner 6. Mængden af glykogen lagret i cellerne afhænger af mange parametre: (I) mængden af glycogenin i den celle, der initierer glykogen syntese (II) aktivitet glykogensyntase og phosphorylase reguleret af proteinphosphorylering / defosforylering, (III) koncentrationen af glucose i cellerne, hvilket er afhængig af flere parametre, såsom levering af glucose fra det vaskulære system og glukoseoptagelse af celler. Glykogen butikker er stramt reguleret af allosterisk regulering af biosyntetiske hormoner gennem mellemliggende metabolitter, af hormoner, der regulerer stofskiftet, og ved næringsstoffer sensing signalveje 7.
Det er vigtigt at værestand til at kvantificere glykogen i biologiske prøver til bedre at forstå vigtigheden af glycogenmetabolisme på hele kroppen og celleniveau. Vi beskriver her en præcis, reproducerbar og bekvem biokemisk in vitro assay for glykogen. Denne teknik er baseret på kvantificering glucosefluorescens før og efter specifikke hydrolyse af glykogen.
Der findes andre metoder til at anslå størrelsen af glykogen i cellerne, men de fleste af dem er ikke kvantitativ. En af de første teknikker beskrevet til kvantificering af glykogen i celler baseret på måling af [14 C]-glucose inkorporering i glycogen 8,9. Anvendelsen af radioaktivitet gør denne proces mere vanskeligt at håndtere, men det har den fordel, at hastigheden af glucose inkorporering i glycogen, og at skelne mellem fordelingen af glucoserester på de ydre grene og i kernen af molekylet (det kræver også en yderligere β-amylolysis og et kromatografisk trin). En anden teknik blev udviklet for mere nylig og er baseret på inkorporering af 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-yl] amino}-2-deoxyglucose), en 2-deoxyglucose fluorescerende derivat i glycogen 10. Den målte fluorescensintensitet afspejler mængden af glycogen, der produceres og kan måles med et fluorescens-læser. Fordeling af fluorescens i cellen kan også evalueres ved konfokal mikroskopi.
Blandt de øvrige nonquantitative teknikker, Periodic Acid-Schiff-farvning (PAS) er måske den mest almindelige. Det kan bruges til påvisning af glykogen i fikserede celler, vævssnit i paraffin eller frosset. Denne histologiske teknik farver ikke specifikt polysaccharider, glycolipider glycoproteiner, cellulose og neutrale muciner i lilla. Specificiteten af denne test kan øges ved behandling af faste celler eller vævssnit med diastase, der specifikt fordøjer glykogen. Derefterniveauet af glykogen kvalitativt kan skønnes ved at sammenligne ikke-hydrolyserede prøver (alle kulhydrat modificerede makromolekyler) for at hydrolyserede prøver (kulhydrat modificerede makromolekyler undtagen glykogen). PAS farvning og mikroskopisk analyse, i modsætning til biokemiske analyser af glykogen, giver oplysninger om fordelingen af glykogen i cellen, hvilket kan diffust eller koncentreret i en bestemt del af cellen. , Selvom PAS farvnings skøn forskelle i glycogenakkumulering mellem forskellige betingelser, er det imidlertid ikke kvantitativ 11.
Et monoklonalt muse-antistof oprindeligt fremstillet ved anvendelse af mandibular kondylær brusk som antigenet har vist sig at reagere med glycogen i celler og oprenset glycogen in vitro 12. Da dette antistof specifikt genkender glykogen-relaterede sukker kæder, det er et nyttigt redskab til påvisning af glykogen ved immunhistokemi på en mere specifik måde end PAS farvning. Elektronmikroskopi er en anden teknik, der tillader visualisering af korn af glykogen i celler og vurdering af graden af glycogen storage. Faktisk glykogen β-partikler er let genkendelige med en elektronmikroskopi som elektrondonorer tætte granulat 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biokemisk Titrering af glykogen
1.. Cellelyse
- Seed-celler i en koncentration på 0,5-2 x 10 6 pr diameter på 100 mm skål.
- Behandling: inkuberes cellerne 24, 48 eller 72 timer i lav iltkoncentration (hypoxi) i en Bug-Box anaerob arbejde station (Ruskinn Technology Biotrace International Plc, Bridgend, UK) fastsat til 1% eller 0,1% O 2, 94% eller 94,9% N2 og 5% CO2. Parallelt inkuberes celler i normoxi (21% O2, 5% CO 2). Skift medium (25 mM glucose-holdigt medium) hver 24 timer for at minimere variationer i koncentrationen af glucose i den tid af eksperimentet.
- Efter behandlingen udvaskede celler 2x med PBS for at fjerne spor af glucose fra dyrkningsmediet. Skrabe cellerne i kold PBS.
- Centrifugeres opløsningen ved 1000 rpm i 5 min, supernatanten og vask pellet én gang med PBS. Pillen kan fryses ved -20 ° C før du går videre.
- Pellet resuspenderes i 100 pi destilleret vand. Tilsæt 100 ul af glykogen Hydrolyse Buffer følger med glykogen Assay Kit (Abcam). Kog lysatet ved 95 ° C i 5 minutter for at inaktivere enzymer.
- Vortex og centrifugeres lysatet ved 13.000 rpm i 10 minutter for at fjerne de uopløselige produkter. Opbevar supernatanten.
- At normalisere glycogenniveauerne proteinindholdet mellem prøverne, kan kvantificering af proteiner gøres med 25-35 ul af supernatanten ved hjælp af bicinchoninsyre-assay (BCA-Interchim).
Nogle af lysatet kan anvendes til at måle den glucosekoncentration inde i cellerne.
2. Hydrolyse af glykogen
- Bland 50 ul af supernatanten (trin 1) med 1 pi af Hydrolyse Enzyme Mix. Denne blanding indeholder glucoamylase. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered kalibreringskurven ved fortynding af glykogen (2 mg / ml) supplied med kittet til en opløsning af 10 ug / ml i hydrolyse buffer. Dernæst forberede seks separate rør med 0, 4, 8, 12, 16, og 20 pi af 10 ug / ml standard og justere hvert rør til et endeligt volumen på 50 pi med hydrolyse-buffer til en koncentration af glycogen på 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16, og 0,2 ug / ml. Tilsæt 1 pi Hydrolyse Enzyme Mix i standarderne og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
Glucosekoncentration Baggrunden for cellelinie givet ved værdien for fri glucose koncentration skal trækkes fra værdien for den samlede koncentration af glucose (glucose fra glycogen hydrolyse + fri glucose) at bestemme indholdet af glykogen i cellen.
3. Udvikling og læsning af fluorescens
- For hver betingelse, forberede et rør (reagensglas 1) til måling af frit glucosekoncentration og to rør (rør 2 og 3) til måling af total glucosekoncentration (hvert rør witha andet volumen af hydrolyseret glykogen).
- Der tilsættes 15 ul af supernatanten ekstraheret ved afslutningen af trin 1 i røret 1. Tilføj 35 pi hydrolyse buffer for at fuldføre en slutvolumen på 50 pi. Opnået fluorescens vil give fri glucose koncentration.
- Tilføj X pi hydrolyseret glykogen (opnået i trin 2) i røret 2. Justér til et endeligt volumen på 50 pi. Prøvevolumen (X ul) skal justeres i forhold til celle tæthed og / eller celletype for at få fluorescens værdier, der ikke over koncentrationer af kalibreringskurven.
- Tilsæt 2 X pi af hydrolyseret glykogen i rør 3. Justér til et endeligt volumen på 50 pi.
- En udvikling løsning til prøver og standarder klargøres ved at blande for hvert rør 48,7 ul Development Buffer, 1 pi Udvikling Enzyme Mix og 0,3 pi OxiRed Probe (leveres i glykogen Assay Kit). For eksempel, for 2 betingelser, forberede et mix for 12 rørs (6 for standarder, 2 for fri glucose og 4 for total glucosefluorescens).
- Der tilsættes 50 ul af denne blanding til hvert rør og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Mål fluorescens ved en excitationsbølgelængde på 535 nm, en emission bølgelængde på 587 nm som anbefalet, og en slids på 3 nm for excitation og emission.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et lavt niveau af oxygen (hypoxia) i tumorer signaler til tumorceller behovet for at lagre energi til at håndtere efterfølgende næringsstof udtynding, således at overleve. Som glykogen er det vigtigste energisk polymer af glukose i pattedyrceller, studerede vi regulering af glykogen lagring i hypoxi. Beregningen og standardisering af koncentrationen af glykogen i cellelysater skal udføres på de rå data for fluorescens, som vist i tabel 1, 2 og 3. Det biokemiske assay for glycogen bekræftede, at elektron-tætte aggregater observeret på elektronmikrofotografier af CCL39-celler (figur 2A) blev glycogen partikler (figur 2B). Ophobningen af glykogen i hypoxi er afhængig af transkriptionsfaktoren hypoxi-inducerende faktor-1 (HIF-1) (figur 3), er den største transskriptionsfaktor involveret i cellulær tilpasning til hypoxi. Endelig vil vi vise i forskellige kræft ognoncancer cellelinjer, der er lagret glykogen hurtigt kan metaboliseres af cellen i mindre end 6 timer (figur 4A), og at anvendelsen af glykogen beskytter mod celledød under betingelser af glukose sult (figur 4B) 1..
Tabel 1.
| glu. (Pg) | 0 | 0,04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | |
| Rådata Fluorescens (RDF) | fluo. | 60 | 88.8 | 106,7 | 121,8 | 148 | 172,1 |
| RDF - Baggrund (fluorescens til 0 ug i standardkurve) | korrektion | 0 | <strong> 28,8 | 46.7 | 61,8 | 88 | 112,1 |
 | |||||||
| Rådata Fluo. (RDF) | RDF - Baggrund | (Korrektion * 1000) / hældning standardkurve | Volumen af prøve, der bruges til at titrere glykogen | Rå data protein-koncentration | γ * prøvevolumen | Glukose (ng) / protein i alt | |
| Samlet glucosekoncentration 1 | fluo. | korrektion | glucose (ng) | prøvevolumen | | totalprotein | glucose (ng / ug Pr). | |
| Prøve 1 (CCL39-NX 1) | 65.8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0.07 | 1.4 | 7.5 |
| Prøve 2 (CCL39-NX 2) | 64.1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0.11 | 2.2 | 3.4 |
| Prøve 3 (CCL 39 HX 48 timer 1) | 177,3 | 117,3 | 211,5 | 4. | 0,22 | 0,88 | 240,3 |
Tabel 1.5.
| Prøve 4 (CCL 39 HX 48h 2) | 174,2 | 114,2 | 205,9 | 4. | 0,24 | 0,96 | 214,5 |
| Prøve 5 (CCL 39 HX 72 timer 1) | 164,7 | 104,7 | 188.8 | 2 | 0,22 | 0,44 | 429,1 |
| Prøve 6 (CCL 39 HX 72 timer 2) | 174,7 | 114,7 | 206,8 | 2 | 0,24 | 0,48 | 430,9 |
| Rådata Fluo. (RDF) | RDF - Baggrund | (Korrektion * 1000) / hældning standardkurve | Volumen af prøve, der bruges til at titrere glykogen | Rå data protein-koncentration | γ * prøvevolumen | Glucose (ng) / proteinsamlede | |
| Samlet glucosekoncentration 2 | fluo. | korrektion | glucose (ng) | prøvevolumen | γ (pg / pl) | totalprotein | glucose (ng / ug Pr). |
| Prøve 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0.07 | 0.7 | 7.7 |
| Prøve 2 (CCL39-NX 2) | 61,2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0.11 | 1.1 | 2,0 |
| Prøve 3 (CCL 39 HX 48 timer 1) | 121,6 | 61.6 | 111,1 | 2 | 0,22 | 0,44 | 252,4 |
| Prøve 4 (CCL 39 HX 48 timer 2) | 111,9 | 51,9 | 93,6 | 2 | 0,24 | 0,48 | 195,0 |
| Prøve 5 (CCL 39 HX 72 timer 1) | 110,3 | 50.3 | 90,7 | 1 | 0,22 | 0,22 | 412,3 |
| Prøve 6 (CCL 39 HX 72 timer 2) | 117,8 | 57,8 | 104,2 | 1 | 0,24 | 0,24 | 434,3 |
Tabel 2.
| fri glucose | fluo. | korrektion | glucose (ng) | prøvevolumen | γ (pg / pl) | totalprotein | glucose (ng / ug Pr). | negative værdier betragtes som 0 |
| Prøve 1 (CCL39-NX 1) | 60.2 | 0.2 | 0.4 | 15 | 0.07 | 1.05 | 0.3 | 0.3 |
| Prøve 2 (CCL39-NX 2) | 55,3 | -4.7 | -8.5 | 15 | 0.11 | 1.65 | -5.1 | 0 |
| Prøve 3 (CCL 39 HX 48 timer 1) | 56,5 | -3.5 | -6.3 | 15 | 0,22 | 3.3 | -1.9 | 0 |
| Prøve 4 (CCL 39 HX 48 timer 2) | 56.7 | -3.3 | -6.0 | 15 | 0,24 | 3.6 | -1.7 | 0 |
| Prøve 5 (CCL 39 HX 72 timer 1) | 57,5 | -2.5 | -4.5 | 15 | 0,22 | 3.3 | -1.4 | 0 |
| Prøve 6 (CCL 39 HX 72 timer 2) | 56,9 | -3.1 | -5.6 | 15 | 0,24 | 3.6 | -1.6 | 0 |
Tabel 3.
| Samlet glukose-koncentration 1 | Samlet glukose-koncentration 2 | Totalglucose koncen-tration gennemsnit | Fri glucose koncentration | Glykogen (ng / ug Pr.) (Samlede gennemsnitlige glukose - fri glucose) | Gennemsnitlig glykogen (mellem dobbeltarbejde kater) | Stan-dard fejl | |
| Prøve 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0.3 | 7.3 | 5,0 | 3.3 |
| Prøve 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2,0 | 2.7 | 0,0 | 2.7 | ||
| Prøve 3 (CCL 39 HX 48 timer 1) | 240,3 | 252,4 | 246.4 | 0,0 | 246.4 | 225,6 | 29.5 |
| Sample 4 (CCL 39 HX 48 timer 2) | 214,5 | 195,0 | 204,7 | 0,0 | 204,7 | ||
| Prøve 5 (CCL 39 HX 72 timer 1) | 429,1 | 412,3 | 420,7 | 0,0 | 420,7 | 426,6 | 8.4 |
| Prøve 6 (CCL 39 HX 72 timer 2) | 430,9 | 434,3 | 432,6 | 0,0 | 432,6 |
Tabel 1, 2, 3. Repræsentant beregning og normalisering af glykogen indholdet af CCL39 celler fra fluorescens række datamængde. Glykogen blev titreret i CCL39 efter inkubation i normoxi (Nx), eller i hypoxi 1% O 2 (Hx) i 48 timer eller 72 timer. Glykogen målinger er udfærdiget i to eksemplarer for hver betingelse. Øverste del af
Figur 1. Glycogenmetabolisme:. Overblik over syntese og nedbrydning af glykogen Glucose ind i cellen cytoplasma gennem glukosetransportører (gluts) til omdannelse til glucose-6-fosfat ved hexokinaser 1 og 2 (HK). Glucose-6-phosphat (G6P) er ved krydset mellem glycolysen, pentosephosphat pathway og glycogenese. Phosphoglucomutase (PGM) er denførste enzym i glykogenese, der katalyserer omdannelsen af G6P til glucose 1-phosphat (G1P), som derefter omdannes til UDP-glucose fra glucose-1-phosphat urydylyltransferase (UGP). UDP-glucose anvendes af glycogen synthase (GS) for at forlænge en forankring molekyle bestående af glycogenin og en glucoserest fastgjort ved et forgreningsenzym (BE). Glykogensyntase og forgreningsenzymer samarbejder i dannelsen af glykogen, også kaldet glycogenese. Den omvendte proces, der hydrolyserer glykogen i G1P via glycogenphosphorylase (GP) og afgrening af enzymer (DBE) kaldes glycogenolyse. Tilpasset fra 3..
Figur 2. Ophobning af glykogen i hypoxi i ikke kræftceller og cancerceller. (A) Elektron micrografts af CCL39 i normoxi (Nx) (venstre panel) og hypoxi 1% O 2 (Hx 1%60, 96 timer) (højre panel). Pile angiver aggregater af glykogen partikler. (B) Kvantificering af mængden af glykogen i CCL39 (sorte søjler) og LS174 (hvide søjler) celler dyrket i normoxi (Nx) eller hypoxi 1% O 2 (Hx 1%) for 48, 72 og 96 timer i en 25 mM glucose-holdigt medium.
Figur 3. Ophobning af glykogen i hypoxi er afhængig af HIF-1. Kvantificering af glykogen beløb i LS174 pTerHIF-1α. Disse celler er inducerbare kloner, der udtrykker et shRNA mod HIF-1α i tilstand tetracyclin. Celler voksede i normoxi (Nx) (hvide søjler) eller hypoxi 0,1% O 2 (Hx 0,1% - sorte bjælker) i fravær (-) eller tilstedeværelse (+) af tetracyclin (Tet).
Figur 4.. Glykogen storage beskytter mod celledød. (A), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF-7 (●) og MDA-MB231 (x)-celler blev udsat for 1% O 2 hypoxi i 96 timer og derefter dyrket i glucose-medium i 6 time. Koncentrationen af glycogen blev målt lige før fjernelse af glucose og udgør 100%. Glycogen blev derefter målt ved 1, 3 og 6 timer. Resultaterne er repræsentative for mindst tre separate forsøg. (B) Måling af celledød i CCL39-celler. Celler blev udsat for enten normoxi (- opbevaring) eller hypoxi (+ opbevaring) i 96 timer og inkuberet i glucose-frit medium i hypoxi i 24 timer før måling celledød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biokemisk titrering af glykogen in vitro muliggør en nøjagtig kvantificering af celler glycogenindhold. Sammenligning til nogle andre teknikker (PAS, immunfluorescens med en glykogen antistof osv.), Denne titrering er meget specifik, følsom og reproducerbar. Desuden er fremgangsmåden praktisk, da det kræver ingen radioaktivitet, men en fluorescensspektrometer. Men denne teknik er rent kvantitativ og giver ikke oplysninger om glykogen distribution i cellen.
Teknikken er beskrevet i dette manuskript er opnået på celleekstrakter, men det kan også opnås på vævssnit med en hensigtsmæssig metode til udvinding af glykogen fra væv. Dette assay anvendes til in vitro anvendelser og på grund af en indirekte måling af glykogen (efter hydrolyse til glucose), kan det ikke blive udviklet til at følge glykogen butikker in vivo.
PAS farvning er allerede i vid udstrækninganvendes til at diagnosticere mange glykogen lagring sygdomme (von Gierke sygdom, Cori sygdom, McArdle sygdom, mv.) Det er også anvendes til at detektere svampeinfektioner eller diskriminere mellem forskellige undertyper af tumorer. I teorien kunne PAS farvning kobles til et billede analysator til bestemmelse af glykogen koncentration. I praksis er denne teknik vanskelig at udføre og er mindre hensigtsmæssig end den, der er beskrevet her af følgende grunde metode. Det første, som PAS positiv farvning (violet) overlapper med negativ farvning (Hæmatoxylin-blå), er det teknisk vanskeligt at udelukke negative signal uden at fjerne det positive signal. Desuden PAS farvning er ikke reproducerbar nok til at kvantificere glycogen, idet intensiteten af farven kan afhænge af tidspunktet på fiksering, effekten af farvning, vask, osv.. Endelig giver denne biokemiske metode en gennemsnitlig koncentration af glykogen til et stort antal celler, medens PAS farvning fokuserer på et bestemt felt, og derfor er mindre repræsentativ for den samlede glykogen koncentration.
Den biokemiske analyse af glykogen kunne levere meget præcise og informative data om niveauet af glykogen i væv. Disse data kunne f.eks hypotetisk korreleret med sygdomsprogression eller kan hjælpe til at forstå effekten af behandling på glycogenmetabolisme. På den anden side, denne teknik kræver flere trin (protein kvantificering hydrolyse af glykogen og et minimum af tre Fluorescensaflæsninger per prøve), og synes mindre praktisk end PAS farvning. For en bedre forståelse af den fysiologiske eller patofysiologiske metabolisme (kræft osv.), Er det vigtigt præcist at kvantificere glucose (og ATP), som glykogen. Men glykogen kvantificering alene ikke er tilstrækkelig til at forstå glycogenmetabolisme og skal kombineres med mikroskopi for at fastlægge fordelingen af glykogen i celler.
nt "> Det er vigtigt at påpege, at på trods af nøjagtigheden og reproducerbarheden af denne assay kan en lille variation i proteinindholdet føre til store variationer af normaliserede værdier af glykogen. Endvidere, selvom der er en lineær forøgelse i fluorescensen med glykogen koncentration er linearitet ikke vedligeholdes i høj koncentration, som signalet falder drastisk. Således anbefaler vi ikke at tage hensyn til de fluorescens værdier uden koncentrationer af kalibreringskurven. Vi anbefaler derfor at udføre to behandlinger med to forskellige prøvestørrelser. I denne måde fluorescens afspejler glykogen i cellerne og ikke opvejes af en nedgang i fluorescens.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Dr. Thierry Pourcher for at lade os bruge fluorescensspektrometer og for hans hjælp. Laboratoriet er finansieret af Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), Sammenslutningen pour la Recherche contre le Cancer, Institut National du Cancer (INCA), Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU-program FP7), Center A. Lacassagne, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale og University of Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Vi takker Dr. M Christiane Brahimi-Horn til kritisk læsning og redaktionel rettelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R.
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. "Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. Theory and practice of histotechnology. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
