Nous décrivons ici une méthode biochimique précis, reproductible et pratique pour le titrage de glycogène in vitro. Cette technique utilise la trousse de dosage Abcam glycogène et est basé sur l'hydrolyse successive du glycogène en glucose et glucose titrage par fluorescence.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Le glycogène est le principal polymère énergétique de glucose chez les animaux vertébrés et joue un rôle essentiel dans le métabolisme du corps tout entier, ainsi que dans le métabolisme cellulaire. Beaucoup de méthodes de détection glycogène existent déjà, mais seulement quelques-uns sont d'ordre quantitatif. Nous décrivons ici un procédé utilisant la trousse de dosage Abcam glycogène, qui est basé sur la dégradation spécifique du glycogène en glucose par la glucoamylase. Le glucose est ensuite oxydé spécifiquement à un produit qui réagit avec la sonde OxiRed pour produire la fluorescence. Le titrage est précise, sensible et peut être réalisé sur des extraits cellulaires ou des coupes de tissus. Cependant, contrairement à d'autres techniques, elle ne donne pas d'informations sur la distribution de glycogène dans la cellule. Comme exemple de cette technique, nous décrivons ici le titrage de glycogène dans les deux lignées cellulaires, les Chinois CCL39 de fibroblastes de poumon de hamster et LS174 de carcinome du côlon humain, incubées en normoxie (21% O 2) par rapport à l'hypoxie (1% d'O 2). Nous émettons l'hypothèse que l'hypoxie est un signalnal qui prépare les cellules à synthétiser et stocker du glycogène pour survivre 1.
Introduction
Le glycogène est un polymère multibranche de résidus de glucose, qui est présent dans le cytoplasme de nombreux types de cellules. Elle est l'une des principales formes de stockage d'énergie dans les cellules et joue un rôle important dans le métabolisme du glucose. La plupart des cellules de mammifères sont capables de produire et stocker du glycogène, qui peut être rapidement dégradé en glucose pour promouvoir la glycolyse et de l'ATP production au cours du stress métabolique. Les hépatocytes produisent des quantités massives de glycogène pour réguler le niveau de sucre sanguin fournissant ainsi une alimentation continue en glucose dans le corps. En rev....
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Protocole
Titration biochimique de glycogène
Une. Lyse cellulaire
- cellules de semences à une concentration de 0,5-2 x 10 6 par boîte de 100 mm de diamètre.
- Traitement: incuber les cellules 24, 48, ou 72 heures de la concentration d'oxygène basse (hypoxie) dans un Bug-Box station de travail anaérobie (Ruskinn technologie Biotrace International Plc, Bridgend, UK) fixé à 1% ou 0,1% O 2, 94% ou 94,9% de N 2 et 5% de CO 2. En parallèle, les cellules incuber à la normoxie (21% O 2, 5% CO 2). Changer le milieu (milieu 25 mM contenant du glucose) toutes les 24 heures a....
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Résultats
Un faible niveau d'oxygène (hypoxie) dans les signaux de tumeurs à cellules de tumeur de la nécessité de stocker de l'énergie pour gérer la suite épuisement des nutriments, de façon à survivre. Sous forme de glycogène est la principale polymère énergétique du glucose dans les cellules de mammifères, nous avons étudié la régulation de stockage de glycogène dans l'hypoxie. Le calcul et la normalisation de la concentration de glycogène dans les lysats cellulaires doivent être réalisées sur les données brutes de.......
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Discussion
Titrage biochimique de glycogène in vitro permet une quantification précise des cellules contenu glycogène. Comparé à d'autres techniques (PAS, immunofluorescence avec un anticorps de glycogène, etc.), Ce titrage est très spécifique, sensible et reproductible. En outre, le procédé est commode car il ne nécessite pas de radioactivité, mais un spectromètre à fluorescence. Cependant, cette technique est purement quantitative et ne fournit pas d'informations sur la distribution de glycogène dans la.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants au Dr Thierry Pourcher pour nous permettre d'utiliser le spectromètre de fluorescence et pour son aide. Le laboratoire est financé par la Nationale Contre le Cancer le Ligue (Equipe de labellisée), l'Association pour la Recherche contre le cancer, l'Institut National du Cancer (INCa), l'Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programme FP7), le Centre A. Lacassagne, le Centre National de la Recherche Scientifique, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale et l'Université de Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Nous remercions le Dr Christ....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Spectromètre de fluorescence | PerkinElmer | LS 50B |
Références
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J<....
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Réimpressions et autorisations
