Summary
Wir beschreiben hier eine genaue, reproduzierbare und bequem biochemische Methode zur Titration von Glykogen in vitro. Diese Technik nutzt die Abcam Glykogen-Assay-Kit und ist auf aufeinander folgende Hydrolyse von Glykogen durch Fluoreszenz Glukose und Glukose-Titration.
Abstract
Glycogen ist das Haupt energetische Polymer von Glucose in Wirbeltieren und spielt eine entscheidende Rolle bei der Ganzkörper-Stoffwechsels als auch im Zellstoffwechsel. Viele Verfahren zur Glykogen erkennen existieren bereits, aber nur wenige sind quantitativ. Wir beschreiben hier eine Methode mit dem Abcam Glykogen-Assay-Kits, die auf spezifischen Abbau von Glykogen basiert, um durch Glucoamylase Glucose. Glukose wird dann speziell auf ein Produkt, das mit dem OXIRED Sonde an Fluoreszenz zu erzeugen reagiert oxidiert. Die Titration ist präzise, empfindlich und kann auf Zellextrakten oder Gewebeschnitten erreicht werden. Im Gegensatz zu anderen Techniken, es nicht geben Informationen über die Verteilung von Glykogen in der Zelle. Als ein Beispiel für diese Technik, beschreiben wir hier die Titration von Glykogen in beiden Zelllinien des Chinesischen Hamsters CCL39 Lungenfibroblasten und menschlichen Kolonkarzinom LS174, in Normoxie inkubiert (21% O 2) in Abhängigkeit von Hypoxie (1% O 2). Wir vermuten, dass Hypoxie ist eine signal, dass bereitet Zellen, um zu überleben 1 zu synthetisieren und zu speichern Glykogen.
Introduction
Glycogen ist ein mehrfach verzweigten Polymer von Glucose-Resten, die im Zytoplasma von vielen Zelltypen vorhanden ist. Es ist eine der Hauptformen der Energiespeicher in Zellen und spielt eine wichtige Rolle in den Glukosestoffwechsel. Die meisten Säugetierzellen sind in der Lage, und speichern Glykogen, die schnell in Glukose abgebaut können Glykolyse und ATP-Produktion während der metabolischen Stress fördern zu produzieren. Hepatozyten produzieren riesige Mengen von Glykogen, um den Blutzuckerspiegel, wodurch eine kontinuierliche Zufuhr von Glucose, um den Körper zu regulieren. Im Gegensatz dazu ist die Konzentration von Glykogen in anderen Zellen (Muskeln, rote Blutkörperchen, etc.) relativ gering. Jedoch lokal ausreichend sind, um Energie in der kurzfristigen, wenn die Zellen einmal in eine Umgebung von Nährstoffen entzogen ausgesetzt sind diese Mengen.
Glykogen-Synthese und Glykogen-Abbau folgt den gleichen Schritten in allen Geweben (Abbildung 1). Erstens Glucosetritt Zellen durch Glucose-Transporter (GLUTs), und wird schnell von der Glucose-6-Phosphat (G6P) in Glucose-1-phosphat (G1P) durch Phosphoglucomutase umgewandelt. G1P wird dann in UDP-Glucose geändert, und das C-C1 von UDP-Glucose auf einen Tyrosinrest glycogenin, dem Verankerungsprotein von Glykogen befestigt. Dieses Molekül, als ein Primer Glykogen wird durch die Befestigung des UDP-Glucose an die terminale Glucose durch eine α (1 → 4)-Bindung über die Glykogensynthase verlängert. Schließlich wird, wenn eine lineare Kette von mehr als 11 Glucoseresten gebildet wird, das Verzweigungsenzym trägt ein Endgerät Oligosaccharid von einem Minimum von 6 Glucosereste an einer anderen Zuckerkettensuche durch eine α (1 → 6)-Bindung gebildet wird. Die Wiederholung dieses Prozesses gibt eine massive fraktalen Struktur, die Zweige, die eine Helix mit 6,5 Glukose pro Runde bilden. Glykogen kann umgekehrt hydrolysiert werden, um durch die konzertierte Aktion Glucosevon entzweigenden Enzymen, die α (1 → 6) verbunden und Glykogen Phosphorylase, die die α (1 → 4)-glycosidisch gebundene zwischen dem letzten Rest von Glucose aus einem Zweig und dem Glykogenmoleküls hydrolysiert hydrolysieren. Diese Reaktion nennt Glycogenolyse durch die Erhöhung von AMP (reflektierende ATP-Verbrauch) aktiviert und durch Glukose und ATP 2,3 gehemmt.
Durch Elektronenmikroskopie wurden Glykogen Moleküle in vielen Zelltypen als freie Teilchen β (oder Glykogen Monopartikel) von 15-30 nm im Durchmesser beschrieben. In bestimmten Zelltypen, wie Hepatozyten, können β-Teilchen in eine komplexe zusammengebaut werden, um Rosetten, auch bekannt als α-Teilchen, die im Durchmesser variieren von 80 nm zu einem Maximum von 200 nm 4 bilden 5, Wasserstoffbrücken oder auch durch Protein-Protein-Wechselwirkungen 6 verklebt werden. Die Menge von Glykogen in den Zellen gespeichert ist abhängig von vielen Parametern: (I) die Menge des glycogenin in der Zelle, die Glykogensynthese initiiert, (ii) die Aktivität von Glykogen-Synthase-Phosphorylase und durch Protein-Phosphorylierung / Dephosphorylierung reguliert, (iii) die Konzentration Glucose in den Zellen, die abhängig von verschiedenen Parametern wie beispielsweise die Bereitstellung von Glucose aus dem Gefäßsystem und die Glucoseaufnahme durch die Zellen ist. Glykogenspeicher sind eng durch allosterische Regulation der Biosynthese Hormone über Zwischenmetabolite reguliert durch Hormone regulieren den Energiestoffwechsel und durch Nährstoffsensorsignalwege 7.
Es ist wichtig,Lage, Glykogen in biologischen Proben zu quantifizieren, um die Bedeutung der Glykogen-Stoffwechsel im ganzen Körper und zellulärer Ebene zu verstehen. Wir beschreiben hier eine präzise, reproduzierbare und bequem biochemischen in vitro-Assay für Glykogen. Diese Technik beruht auf der Quantifizierung Glucose Fluoreszenz vor und nach der spezifischen Hydrolyse von Glykogen basiert.
Es gibt andere Methoden, um das Niveau von Glykogen in den Zellen zu schätzen, aber die meisten von ihnen sind nicht quantitativ. Eine der ersten für die Quantifizierung von Glykogen in den Zellen beschriebenen Verfahren wurde der Messung der [14 C]-Glucose in Glykogen Einbau 8,9 basiert. Die Verwendung von Radioaktivität macht dieses Verfahren schwieriger zu handhaben, sondern es den Vorteil, dass die Rate der Glukose in Glykogen Einbau und bei der Unterscheidung zwischen der Verteilung der Glucosereste an den äußeren Ästen und in dem Kern des Moleküls (es erfordert auch eine zusätzliche β-amylolysis und einem chromatographischen Schritt). Eine andere Technik wurde in jüngerer Zeit entwickelt und beruht auf dem Einbau von 2-NBDG basiert (2 - {N-[7-Nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazolon-4-yl] amino}-2-Desoxyglucose), ein 2-Desoxyglucose fluoreszierendes Derivat, in Glykogen 10. Die gemessene Fluoreszenzintensität spiegelt die Menge an Glykogen hergestellt und kann mit einem Fluoreszenzlesegerät gemessen werden. Fluoreszenzverteilung in der Zelle kann durch konfokale Mikroskopie ausgewertet.
Unter den anderen nicht-quantitative Techniken ist Periodic Acid-Schiff-Färbung (PAS) vielleicht die häufigste. Es kann für den Nachweis von Glykogen in fixierten Zellen, Gewebeschnitte in Paraffin oder gefroren werden. Diese histologischen Technik Farben nicht speziell Polysaccharide, Glykolipide, Glykoproteine, Zellulose und neutrale Muzine in Lila. Die Spezifität des Tests kann durch Behandlung der fixierten Zellen oder Gewebeschnitten mit Diastase, die spezifisch verdaut Glykogen erhöht werden. Danachdas Niveau von Glykogen kann qualitativ durch den Vergleich nicht hydrolysierten Proben (alle Kohlenhydrat modifizierter Makromoleküle) zu hydrolysierten Proben (Kohlenhydrat-modifizierten Makromolekülen außer Glykogen) geschätzt werden. PAS-Färbung und mikroskopische Analyse, im Gegensatz zu biochemischen Assays von Glykogen, enthält Informationen über die Verteilung von Glykogen in der Zelle, die diffundiert oder in einem bestimmten Teil der Zelle konzentriert werden können. Obwohl PAS-Färbung Schätzungen Unterschiede in Glykogen Akkumulation zwischen verschiedenen Bedingungen ist es jedoch nicht quantitativ 11.
Ein monoklonaler Maus-Antikörper, ursprünglich unter Verwendung Kiefer Kondylenknorpels als Antigen wurde gezeigt, dass mit Glykogen in den Zellen und mit gereinigtem Glykogen in vitro 12 reagieren. Da diese Antikörper spezifisch Glykogen-verwandte Zuckerketten, ist es ein nützliches Werkzeug für den Nachweis von Glykogen durch Immunhistochemie in einer spezifischeren Weise als die PAS-Färbung. Elektronenmikroskopie ist eine weitere Technik, die Visualisierung von Körnern von Glykogen in den Zellen und die Bewertung des Grades der Glykogen-Speicher ermöglicht. In der Tat sind Glykogen β-Teilchen leicht mit einem Elektronenmikroskop als elektronendichtes Granulat 1 erkennbar.
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Protocol
Biochemische Titration von Glykogen
1. Zelllyse
- Samenzellen in einer Konzentration von 0,5-2 x 10 6 pro 100 mm Schale.
- Behandlung: inkubieren Zellen 24, 48 oder 72 Stunden in niedriger Sauerstoffkonzentration (Hypoxie) in einem Bug-Box anaerobe Arbeitsstation (Ruskinn Technologie Biotrace International Plc, Bridgend, UK) bei 1% oder 0,1% O 2, 94% oder eingestellt 94,9% N &sub2; und 5% CO 2. Parallel inkubieren Zellen in Normoxie (21% O 2, 5% CO 2). Mediumwechsel (25 mM Glucose-haltigem Medium) alle 24 h auf Schwankungen in der Glukosekonzentration während der Zeit des Experiments zu minimieren.
- Nach der Behandlung, Wasch Zellen 2x mit PBS, um Spuren von Glukose aus dem Kulturmedium zu entfernen. Kratzen Sie die Zellen in kaltem PBS.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 rpm für 5 min, den Überstand verwerfen und waschen das Pellet einmal mit PBS. Das Pellet bei -20 ° C eingefroren, bevor weiter fortgefahren werden.
- Resuspendieren des Pellets in 100 ul destilliertem Wasser. 100 l des Glykogen-Hydrolyse-Puffer mit der Glykogen-Assay Kit (Abcam) vorgesehen ist. Man kocht das Lysat bei 95 ° C für 5 min, um Enzyme zu inaktivieren.
- Vortex-Zentrifuge und das Lysat bei 13.000 rpm für 10 min, um die unlöslichen Produkte zu entfernen. Halten Sie den Überstand.
- Glykogen Ebenen auf den Proteingehalt zwischen den Proben zu normalisieren, kann die Quantifizierung von Proteinen mit 25-35 ul des Überstands unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Assays (BCA-Interchim) erfolgen.
Einige der Lysat kann verwendet werden, um die freie Glucose-Konzentration in den Zellen zu messen.
2. Hydrolyse von Glykogen
- Mischungs 50 ul des Überstands (Schritt 1) mit 1 &mgr; l der Hydrolyse Enzyme Mix. Dieses Gemisch enthält Glucoamylase. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie das Kalibrierungskurve durch Verdünnen der Standard Glykogen (2 mg / ml) smit dem Kit zu einer Lösung von 10 ug / ml in dem Puffer upplied Hydrolyse. Als nächstes bereiten sechs getrennten Röhrchen mit 0, 4, 8, 12, 16 und 20 ul von 10 ug / ml-Standard und justieren Sie jedes Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 50 ul mit Hydrolyse-Puffer auf eine Konzentration von Glykogen von 0 zu geben, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16 und 0,2 ug / ml. 1 ul Enzym-Hydrolyse-Mischung in den Standards und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
Der Hintergrund Glukosekonzentration der Zelllinie, nach Wert für die freie Glucose-Konzentration gegeben werden, aus dem Wert für die Gesamtglucosekonzentration (Glukose aus dem Glykogen Hydrolyse + free-Glucose), um das Niveau von Glykogen in der Zelle bestimmen, subtrahiert werden.
3. Entwicklung und Lesen von Fluoreszenz
- Für jeden Zustand, bereiten ein Rohr (Rohr 1) in freie Glucose-Konzentration und zwei Röhren zu messen (Rohre 2 und 3) Gesamtglucosekonzentration (jedes Rohr Witz messenha verschiedenen Volumen von hydrolysierten Glykogen).
- Hinzufügen von 15 &mgr; l Überstand am Ende von Schritt 1 in Rohr 1 extrahiert. Hinzufügen von 35 &mgr; l Puffer, um die Hydrolyse bis zu einem Endvolumen von 50 ul zu vervollständigen. Erhalten Fluoreszenz gibt die freie Glucose-Konzentration.
- In X ul hydrolysierten Glykogen (in Schritt 2) erhalten, auf Rohr 2. Einstellen, um ein Endvolumen von 50 ul. Probenvolumen (X ul) ist entsprechend der Zelldichte und / oder Zelltyp, um Fluoreszenzwerte, die nicht über die Konzentrationen der Kalibrierungskurve zu erhalten eingestellt werden.
- In 2 X ul hydrolysierten Glykogen in Röhre 3. Einstellen, um ein Endvolumen von 50 ul.
- Bereiten Sie eine Entwicklungslösung für Proben und Standards, indem man für jedes Rohr 48,7 ul Entwicklung Buffer, 1 ul der Entwicklung Enzyme Mix und 0,3 ul OXIRED Probe (in der Glykogen-Assay Kit geliefert). Zum Beispiel für zwei Bedingungen, bereiten Sie einen Mix für 12 Rohrs (6-Standards, 2 für freie Glucose und 4 für die Gesamtglucose Fluoreszenz).
- Dann werden 50 ul dieser Mischung zu jedem Röhrchen und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Messung der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 535 nm, einer Emissionswellenlänge von 587 nm, wie empfohlen, und einen Schlitz von 3 nm für die Anregung und Emission.
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Representative Results
Ein niedriger Gehalt an Sauerstoff (Hypoxie) in Tumoren Signale an Tumorzellen die Notwendigkeit, Energie zu speichern, um nachfolgende Nährstoffverarmung verarbeiten, um zu überleben. Glycogen ist das Haupt energetische Polymer von Glucose in Säugerzellen, untersuchten wir die Regulierung der Glykogen-Speicherung im Hypoxie. Die Berechnung und die Standardisierung der Konzentration von Glykogen in Zelllysaten müssen auf den Rohdaten der Fluoreszenz durchgeführt werden, wie in den Tabellen 1, 2 und 3 gezeigt. Die biochemischen Assay für Glykogen bestätigt, dass die Elektronendichte Aggregate elektronenmikroskopische Aufnahmen von CCL39-Zellen beobachtet (Fig. 2A) wurden Glykogen Partikel (Fig. 2B). Die Anhäufung von Glykogen in Hypoxie ist abhängig von der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbaren Faktor 1 (HIF-1) (Fig. 3), der Haupttranskriptionsfaktor in Zell Anpassung an Hypoxie beteiligt. Schließlich zeigen wir in verschiedenen Krebs undnoncancer Zelllinien, die gespeicherte Glykogen schnell von der Zelle in weniger als 6 Stunden (4A) metabolisiert werden, und dass die Verwendung von Glykogen schützt gegen Zelltod unter Bedingungen von Glucose Verhungern (4B) 1.
Tabelle 1.
| glu. (Ug) | 0 | 0,04 | 0,08 | 0,12 | 0,16 | 0,2 | |
| Raw Data Fluoreszenz (RDF) | Fluo. | 60 | 88,8 | 106,7 | 121,8 | 148 | 172,1 |
| RDF - Hintergrund (Fluoreszenz für 0 ug in Standardkurve) | Korrektur | 0 | <strong> 28,8 | 46,7 | 61,8 | 88 | 112,1 |
 | |||||||
| Raw Data Fluo. (RDF) | RDF - Hintergrund | (Korrektur * 1000) / Steigung Standardkurve | Volumen der Probe zu Glykogen titriert | Raw-Daten-Protein-Konzentration | γ * Volumen Proben | Glucose (ng) / Protein-Gesamt | |
| Gesamtglukosekonzentration ein | Fluo. | Korrektur | Glukose (ng) | Volumen Proben | | Proteingesamt | Glukose (ng / ug Pr.) | |
| Probe 1 (CCL39-NX 1) | 65,8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0,07 | 1.4 | 7.5 |
| Probe 2 (CCL39-NX 2) | 64,1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0,11 | 2.2 | 3.4 |
| Probe 3 (CCL 39 HX 48 Stunden 1) | 177,3 | 117,3 | 211,5 | 4 | 0,22 | 0,88 | 240,3 |
Tabelle 1.5.
| Probe 4 (CCL 39 HX 48h 2) | 174,2 | 114,2 | 205,9 | 4 | 0,24 | 0,96 | 214,5 |
| Probe 5 (CCL 39 HX 72 Stunden 1) | 164,7 | 104,7 | 188,8 | 2 | 0,22 | 0,44 | 429,1 |
| Probe 6 (CCL 39 HX 72 Stunden 2) | 174,7 | 114,7 | 206,8 | 2 | 0,24 | 0,48 | 430,9 |
| Raw Data Fluo. (RDF) | RDF - Hintergrund | (Korrektur * 1000) / Steigung Standardkurve | Volumen der Probe zu Glykogen titriert | Raw-Daten-Protein-Konzentration | γ * Volumen Proben | Glucose (ng) / Proteingesamt | |
| Gesamtglukosekonzentration 2 | Fluo. | Korrektur | Glukose (ng) | Volumen Proben | γ (ug / ul) | Proteingesamt | Glukose (ng / ug Pr.) |
| Probe 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0,07 | 0,7 | 7.7 |
| Probe 2 (CCL39-NX 2) | 61,2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0,11 | 1.1 | 2.0 |
| Probe 3 (CCL 39 HX 48 Stunden 1) | 121,6 | 61,6 | 111,1 | 2 | 0,22 | 0,44 | 252,4 |
| Probe 4 (CCL 39 HX 48 Stunden 2) | 111,9 | 51,9 | 93,6 | 2 | 0,24 | 0,48 | 195,0 |
| Probe 5 (CCL 39 HX 72 Stunden 1) | 110,3 | 50,3 | 90,7 | 1 | 0,22 | 0,22 | 412,3 |
| Probe 6 (CCL 39 HX 72 Stunden 2) | 117,8 | 57,8 | 104,2 | 1 | 0,24 | 0,24 | 434,3 |
Tabelle 2.
| freie Glucose | Fluo. | Korrektur | Glukose (ng) | Volumen Proben | γ (ug / ul) | Proteingesamt | Glukose (ng / ug Pr.) | negative Werte werden als 0 betrachtet |
| Probe 1 (CCL39-NX 1) | 60,2 | 0,2 | 0,4 | 15 | 0,07 | 1,05 | 0,3 | 0,3 |
| Probe 2 (CCL39-NX 2) | 55,3 | -4,7 | -8,5 | 15 | 0,11 | 1,65 | -5,1 | 0 |
| Probe 3 (CCL 39 HX 48 Stunden 1) | 56,5 | -3,5 | -6,3 | 15 | 0,22 | 3.3 | -1,9 | 0 |
| Probe 4 (CCL 39 HX 48 Stunden 2) | 56.7 | -3,3 | -6,0 | 15 | 0,24 | 3.6 | -1,7 | 0 |
| Probe 5 (CCL 39 HX 72 Stunden 1) | 57,5 | -2,5 | -4,5 | 15 | 0,22 | 3.3 | -1,4 | 0 |
| Probe 6 (CCL 39 HX 72 Stunden 2) | 56,9 | -3,1 | -5,6 | 15 | 0,24 | 3.6 | -1,6 | 0 |
Tabelle 3.
| Gesamtzucker-Konzentration ein | Gesamtglukosekonzentration 2 | Insgesamt Glucose konzen-tRATIOn Durchschnitt | Kostenlose Glucose-Konzentration | Glykogen (ng / ug Pr.) (Durchschnittliche Glucose - freie Glucose) | Durchschnittliche Glykogen (zwischen Duplikaten) | Stan-dard-Fehler | |
| Probe 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0,3 | 7.3 | 5,0 | 3.3 |
| Probe 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2.0 | 2.7 | 0.0 | 2.7 | ||
| Probe 3 (CCL 39 HX 48 Stunden 1) | 240,3 | 252,4 | 246,4 | 0.0 | 246,4 | 225,6 | 29,5 |
| Samweise 4 (CCL 39 HX 48 Stunden 2) | 214,5 | 195,0 | 204,7 | 0.0 | 204,7 | ||
| Probe 5 (CCL 39 HX 72 Stunden 1) | 429,1 | 412,3 | 420,7 | 0.0 | 420,7 | 426,6 | 8.4 |
| Probe 6 (CCL 39 HX 72 Stunden 2) | 430,9 | 434,3 | 432,6 | 0.0 | 432,6 |
Tabellen 1, 2, 3. Repräsentative Berechnung und Normalisierung der Glykogen-Gehalt von Zellen aus CCL39 Fluoreszenz Reihe Daten. Glykogen wurde in CCL39 nach Inkubation in Normoxie (NX) oder Hypoxie 1% O 2 (Hx) für 48 h oder 72 h titriert. Glykogen Messungen in zweifacher Ausfertigung für jede Bedingung getan. Top Teil
Fig. 1 ist. Glykogen-Metabolismus:. Überblick über die Synthese und Abbau von Glykogen Glucose gelangt in das Cytoplasma der Zelle durch Glucose-Transporter (GLUTs) für die Umwandlung in Glukose-6-Phosphat durch Hexokinase 1 und 2 (HK). Glucose-6-phosphat (G6P) ist an der Verbindung zwischen der Glykolyse, Pentosephosphatweg und Glykogenese. Phosphoglucomutase (PGM) isterste Enzym in Glykogenese das die Umwandlung von G6P in Glucose-1-phosphat (G1P), die dann von Glucose-1-phosphat urydylyltransferase (UGP) in UDP-Glucose umgewandelt katalysiert. UDP-Glucose von Glykogen-Synthase (GS) verwendet wird, um einen Ankermolekül glycogenin gebildet und ein Glucoserest durch ein Verzweigungsenzym (BE) angeschlossen verlängern. Glykogensynthase und Verzweigungsenzyme zusammen bei der Bildung von Glykogen, auch als Zuckerbildung. Der umgekehrte Vorgang, die Glykogen über Glycogenphosphorylase (GP) und abbauenden Enzymen (DBE) in G1P hydrolysiert wird als Glykogenolyse. 3 angepasst.
2. Die Akkumulation von Glykogen in Hypoxie bei Nichtkrebszellen und Krebszellen. (A) Electron Micrografts von CCL39 in Normoxie (Nx) (links) und Hypoxie 1% O 2 (Hx 1%60; 96 hr) (rechts). Pfeile bezeichnen Aggregate von Glykogen Partikel. (B) Quantifizierung der Menge an Glykogen in CCL39 (schwarze Balken) und LS174 (weiße Balken) Zellen in Normoxie (Nx) oder Hypoxie 1% O 2 (Hx 1%) für 48, 72 und 96 h in einem 25 angebaut mM Glucose enthaltenden Medium.
3. Die Akkumulation von Glykogen in Hypoxie ist abhängig von HIF-1. Quantifizierung der Menge Glykogen in LS174 pTerHIF-1α. Diese Zellen sind induzierbare Klone, die eine shRNA gegen HIF-1α im Zustand von Tetracyclin. Die Zellen wuchsen in Normoxie (Nx) (weiße Balken) oder Hypoxie 0,1% O 2 (Hx 0,1% - schwarze Balken) in Abwesenheit (-) oder Anwesenheit (+) von Tetracyclin (Tet).
4. Glykogen Storage schützt vor Zelltod. (A), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF-7 (●) und MDA-MB231 (x)-Zellen wurden 1% O 2 Hypoxie für 96 Stunden unterzogen und dann in glucosefreiem Medium kultiviert 6 hr. Die Glykogen-Konzentration wurde nur vor der Entfernung der Glucose gemessen und entspricht 100%. Glykogen wurde dann bei 1, 3 gemessen und 6 Stunden. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens drei getrennten Experimenten. (B) Messung der Zelltod in CCL39-Zellen. (- Lagerung) oder Hypoxie (+ Lagerung) für 96 h und in Glukose-freiem Medium in Hypoxie für 24 Stunden vor der Messung Zelltod inkubiert Zellen wurden entweder Normoxie unterzogen.
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Discussion
Biochemische Titration von Glykogen in vitro ermöglicht eine genaue Quantifizierung von Zellen Glykogen. Im Vergleich zu einigen anderen Techniken (PAS, Immunfluoreszenz mit einem Glykogen-Antikörper, usw..) Ist diese Titration sehr spezifisch, empfindlich und reproduzierbar. Darüber hinaus ist das Verfahren bequemer, da es keine Radioaktivität aber eine Fluoreszenz-Spektrometer erfordert. Jedoch ist diese Technik rein quantitativ und liefert keine Informationen über Glykogen Verteilung in der Zelle.
Die in diesem Manuskript beschriebene Technik ist auf Zellextrakten erreicht, sondern es kann auch auf Gewebeschnitte mit einem geeigneten Verfahren für die Extraktion von Glykogen aus Geweben erreicht werden. Dieser Test ist für die in-vitro-Anwendungen verwendet und aufgrund eines indirekten Messung von Glykogen (nach der Hydrolyse in Glukose), kann es nicht entwickelt, um die Glykogenspeicher in vivo zu folgen.
PAS-Färbung ist bereits weit verbreitetverwendet, um viele Glykogen-Speicherkrankheiten (v. Gierke-Krankheit, Cori-Krankheit, McArdle-Erkrankung, etc.) zu bestimmen. Es wird auch verwendet, um Pilzinfektionen zu erfassen oder um zwischen den verschiedenen Subtypen von Tumoren zu unterscheiden. Theoretisch könnte PAS-Färbung auf einem Bildanalysator gekoppelt ist, um die Glykogen-Konzentration zu bestimmen. In der Praxis ist dieses Verfahren schwierig durchzuführen und ist weniger geeignet als die aus den folgenden Gründen hier beschriebenen Verfahren. Erstens, wie PAS positive Färbung (violett) überlappt mit dem negativen Färbung (Hämatoxylin-blau), ist es technisch schwierig, den negativen Signal ohne Entfernen des positiven Signals auszuschließen. Zusätzlich ist PAS-Färbung nicht reproduzierbar genug, um Glykogen zu quantifizieren, da die Intensität der Farbe auf der Zeit der Fixierung, die Wirksamkeit der Färbung, Wäsche usw. abhängen. Schließlich kann diese biochemische Methode ergibt eine durchschnittliche Konzentration von Glykogen für eine große Anzahl von Zellen, wobei PAS-Färbung konzentriert sich auf einen spezifischen Bereich und ist daher weniger repräsentativ für die Gesamt Glykogen-Konzentration.
Der biochemische Test von Glykogen konnte sehr genaue und aussagekräftige Daten auf der Ebene von Glykogen in Gewebe bereitzustellen. Diese Daten könnten beispielsweise hypothetisch mit Fortschreiten der Krankheit korreliert werden, oder kann dazu beitragen, die Wirkungen der Behandlung auf die Glykogen-Metabolismus zu verstehen. Andererseits erfordert dieses Verfahren mehrere Schritte (Protein-Quantifizierung der Hydrolyse von Glykogen und ein Minimum von drei Fluoreszenzmessungen pro Probe), und scheint weniger praktisch als die PAS-Färbung. Für ein besseres Verständnis der physiologischen oder pathophysiologischen Stoffwechsel (Krebs, etc.), Ist es wichtig, genau zu quantifizieren, die Glucose (und ATP) von Glykogen ist. Jedoch ist Glykogen Quantifizierung allein nicht ausreicht, um Glykogenstoffwechsels verstehen und müssen mit Mikroskopie, um die Verteilung von Glykogen in Zellen gekoppelt werden.
nt "> Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass trotz der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays, eine kleine Änderung in der Proteingehalt kann zu großen Schwankungen der normierten Werte von Glykogen führen. Darüber hinaus, obwohl es eine lineare Zunahme der Fluoreszenz mit Glykogen-Konzentration wird die Linearität nicht in hoher Konzentration für die das Signal drastisch sinkt gehalten. Daher empfehlen wir nicht zu berücksichtigen, die Fluoreszenzwerte über Konzentrationen der Eichkurve zu nehmen. Wir empfehlen daher, die Durchführung von zwei Lesungen mit zwei unterschiedlichen Probenvolumina. In auf diese Weise die Fluoreszenz spiegelt die Glykogen in den Zellen und wird nicht durch eine Abnahme der Fluoreszenz versetzt.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir sind dafür, dass wir, um die Fluoreszenz-Spektrometer zu nutzen und für seine Hilfe danken der Dr. Thierry Pourcher. Das Labor wird von der Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe einem Gütezeichen) gefördert, der Verband pour la Recherche contre le Cancer, das Institut National du Cancer (INCa), der Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU FP7-Programm), das Zentrum A. Lacassagne, das Centre National de la Recherche Scientifique, das Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale und der Universität Nizza ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Wir danken Dr. Christiane Brahimi M-Horn für das kritische Lesen und redaktionelle Korrektur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
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