Summary
We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische methode voor titratie van glycogeen in vitro. Deze techniek gebruikt de Abcam Glycogen testkit en is gebaseerd op opeenvolgende hydrolyse van glycogeen tot glucose en glucose titratie van fluorescentie.
Abstract
Glycogeen is de belangrijkste energetische polymeer van glucose in gewervelde dieren speelt een cruciale rol geheel stofwisseling en in cellulair metabolisme. Vele manieren om glycogeen te sporen bestaat, maar slechts een paar zijn kwantitatief. We beschrijven hier een methode waarbij de Abcam Glycogen testkit, die is gebaseerd op specifieke afbraak van glycogeen tot glucose met glucoamylase. Glucose wordt vervolgens geoxideerd tot een specifiek product dat reageert met de OxiRed probe fluorescentie te produceren. Titratie is nauwkeurig, gevoelig en kan worden bereikt op mobiele extracten of coupes. In tegenstelling tot andere technieken, zij geen informatie over de verdeling van glycogeen in de cel geven. Als voorbeeld van deze techniek, beschrijven we hier de titratie van glycogeen in twee cellijnen, Chinese hamster long fibroblasten CCL39 en humaan coloncarcinoom LS174, geïncubeerd in normoxia (21% O2) tegen hypoxie (1% O2). Onze hypothese was dat hypoxie is een signal die bereidt cellen synthetiseren en opslaan glycogeen om te overleven 1.
Introduction
Glycogeen is een multibranched polymeer van glucose residuen die aanwezig zijn in het cytoplasma van vele celtypen. Het is een van de belangrijkste vormen van energieopslag in cellen en speelt een belangrijke rol in glucosemetabolisme. De meeste zoogdiercellen kunnen opslaan en glycogeen, die snel kunnen worden afgebroken tot glucose om glycolyse en ATP productie te bevorderen tijdens metabole stress produceren. Hepatocyten produceren grote hoeveelheden glycogeen de bloedsuikerspiegel waardoor een continue aanvoer van glucose aan het lichaam. In tegenstelling, de concentratie van glycogeen in andere cellen (spieren, rode bloedcellen, etc.) relatief laag. Echter, plaatselijk, deze hoeveelheden voldoende om energie op korte termijn wanneer de cellen plotseling blootgesteld aan een omgeving beroofd van voedingsstoffen.
Glycogeen synthese en afbraak glycogeen volgt dezelfde stappen in alle weefsels (figuur 1). Allereerst glucosebinnenkomt cellen door glucose transporters (gluts) en snel omgezet van glucose-6-fosfaat (G6P) in glucose-1-fosfaat (G1P) van fosfoglucomutase. G1P wordt dan gewijzigd in UDP-glucose, en het koolstofatoom C1 UDP-glucose is een tyrosine residu glycogenin, de verankering eiwit van glycogeen gehecht. Dit molecuul, beschouwd als een glycogeen primer, wordt verlengd met bevestiging van de UDP-glucose naar de terminal glucose door een α (1 → 4) binding via de glycogeen synthase. Tenslotte, wanneer een lineaire keten van meer dan 11 glucose residuen gevormd, het vertakkingsenzym brengt een terminal oligosaccharide gevormd door ten minste 6 glucose residuen ander glucose van de keten nabijgelegen via een α (1 → 6) binding. De herhaling van dit proces geeft een enorme fractale structuur met takken die een helix met 6,5 glucose per beurt vormen. Glycogeen kan omgekeerd gehydrolyseerd worden tot glucose door de gezamenlijke actievan debranching enzymen die de α (1 → 6) gebonden en glycogeenfosforylase dat de α (1 → 4) glycosidische gebonden tussen de laatste resten van glucose van een tak en het glycogeen molecuul hydrolyseert hydrolyseren. Deze reactie heet glycogenolysis wordt geactiveerd door het verhogen van het niveau van AMP (reflecterende ATP consumptie), en geremd door glucose en ATP 2,3.
Door elektronenmicroscopie werden glycogeen moleculen zijn beschreven in vele celtypen als β vrije deeltjes (of glycogeen monoparticles) van 15-30 nm in diameter. In specifieke celtypen zoals hepatocyten, kan β deeltjes worden samengevoegd tot een complex rozetten, ook wel α deeltjes die variëren in diameter van 80 nm tot maximaal 200 nm 4 vormen 5, waterstofbinding, of zelfs door eiwit-eiwit interacties 6. De hoeveelheid glycogeen in de cellen is afhankelijk van vele parameters: (I) de hoeveelheid glycogenin in de cel die glycogeen synthese initieert, (II) de activiteit van glycogeen synthase en fosforylase gereguleerd door eiwit fosforylatie / defosforylatie, (III) hetzij van glucose in de cellen, die afhankelijk is van verschillende parameters zoals de aanvoer van glucose uit het vasculaire systeem en glucoseopname door cellen. Glycogeenopslag zijn strak gereguleerd door allosterische regulering van biosynthetische hormonen via intermediaire metabolieten, door hormonen reguleren energiemetabolisme, en door nutrient sensing signaalwegen 7.
Het is belangrijk omkunnen glycogeen kwantificeren in biologische monsters beter te begrijpen van het belang van glycogeen metabolisme in het gehele lichaam en cellulaire niveau. We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische in vitro test voor glycogeen. Deze techniek is gebaseerd op het kwantificeren glucose fluorescentie voor en na specifieke hydrolyse van glycogeen.
Andere methoden bestaan om het niveau van glycogeen schatten in de cellen, maar de meeste zijn niet kwantitatief. Een van de eerste technieken beschreven voor het kwantificeren van glycogeen in de cellen was gebaseerd op metingen van [14C]-glucose opname in glycogeen 8,9. Het gebruik van radioactiviteit maakt dit proces moeilijker te hanteren, maar het heeft het voordeel dat de snelheid van glucose opname in glycogeen en onderscheiden tussen de verdeling van glucose residuen op de buitenste takken en in de kern van het molecuul (het vereist ook een Aanvullende β-amylolysis en een chromatografische stap). Een andere techniek is meer recent ontwikkeld en is gebaseerd op de opname van 2-NBDG (2 - {N-[,3-diazol 4-yl-7-nitrobenz-2-oxa-1] amino}-2-deoxyglucose), een 2-deoxyglucose fluorescerend derivaat, in glycogeen 10. De gemeten fluorescentie-intensiteit geeft de hoeveelheid glycogeen geproduceerd en kan worden gemeten met een fluorescentie lezer. Verdeling van fluorescentie in de cel kan ook worden geëvalueerd door confocale microscopie.
Onder de andere nonquantitative technieken, Periodic Acid-Schiff kleuring (PAS) is misschien wel de meest voorkomende. Het kan gebruikt worden voor de detectie van glycogeen in gefixeerde cellen, weefselcoupes in paraffine of bevroren. Deze histologische techniek kleuren niet specifiek polysacchariden, glycolipiden, glycoproteïnen, cellulose en neutrale mucines in paars. De specificiteit van deze test kan worden verhoogd door behandeling van gefixeerde cellen of weefselsecties met diastase, die specifiek verteert glycogeen. Daarnahet niveau van glycogeen kan kwalitatief worden geschat door het vergelijken van gehydrolyseerde monsters (alle koolhydraten gemodificeerde macromoleculen) om gehydrolyseerde monsters (koolhydraten gemodificeerde macromoleculen behalve glycogeen). PAS kleuring en microscopische analyse tegenstelling biochemische analyses van glycogeen, geeft informatie over de verdeling van glycogeen in de cellen, die kunnen worden verspreid of geconcentreerd in een bepaald deel van de cel. Echter, hoewel PAS kleuring schattingen verschillen glycogeen verschillende omstandigheden is niet kwantitatief 11.
Een monoklonaal muizenantilichaam oorspronkelijk gebruikt mandibulaire condylaire kraakbeen antigeen waargenomen tussen glycogeen in cellen en gezuiverd glycogeen reageren in vitro 12. Aangezien dit antilichaam herkent specifiek glycogeen gerelateerde suikerketens is een nuttig hulpmiddel voor de detectie van glycogeen door immunohistochemie op een meer specifieke wijze dan de PAS kleuring. Elektronenmicroscopie is een andere techniek die visualisatie van korrels van glycogeen in de cellen en de evaluatie van de mate van glycogeen opslag mogelijk maakt. In feite, glycogeen β deeltjes herkenbaar met een elektron microscopie elektron granulen 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biochemische Titratie van glycogeen
1. Cell Lysis
- Zaad cellen bij een concentratie van 0,5-2 x 10 6 per 100 mm schaal.
- Behandeling: incubeer cellen 24, 48, of 72 uur in een lage zuurstofconcentratie (hypoxie) in een Bug-Box anaërobe werkplek (Ruskinn Technology Biotrace International Plc, Bridgend, UK) vastgesteld op 1% of 0,1% O 2, 94% of 94,9% N2 en 5% CO2. Parallel incubeer cellen in normoxia (21% O2, 5% CO2). Opnieuw medium (25 mM glucose-bevattend medium) elke 24 uur variaties in de glucoseconcentratie in de tijd van het experiment te minimaliseren.
- Na de behandeling, wassen cellen 2x met PBS om sporen van glucose uit kweekmedium te verwijderen. Schraap de cellen in koude PBS.
- Centrifugeer de oplossing bij 1000 rpm gedurende 5 min, gooi de supernatant en was de pellet eenmaal met PBS. De pellet kan bij -20 ° C worden ingevroren voordat u verder gaat.
- Resuspendeer de pellet in 100 pl gedestilleerd water. Voeg 100 ul van de glycogeen hydrolyse Buffer voorzien van de glycogeen Assay Kit (Abcam). Kook het lysaat bij 95 ° C gedurende 5 minuten om enzymen te inactiveren.
- Vortex en centrifugeer het lysaat bij 13.000 rpm gedurende 10 min om de onoplosbare producten verwijderen. Houd de bovenstaande vloeistof.
- Om glycogeen niveaus normaliseren van het eiwitgehalte van monsters kan kwantificering van eiwitten worden gedaan met 25-35 pl van het supernatant met behulp van de bicinchoninezuur assay (BCA-Interchim).
Sommige lysaat kan worden gebruikt om het vrije glucoseconcentratie gemeten in de cellen.
2. Hydrolyse van Glycogeen
- Meng 50 ul van de supernatant (stap 1) met 1 pl van de hydrolyse Enzym Mix. Dit mengsel bevat glucoamylase. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Bereid de ijkcurve door verdunning van de standaard glycogeen (2 mg / ml) supplied met de kit een oplossing van 10 ug / ml in de hydrolyse buffer. Bereid vervolgens zes afzonderlijke buizen met 0, 4, 8, 12, 16 en 20 pl van 10 ug / ml standaard en elke buis passen aan een eindvolume van 50 pl met hydrolyse buffer tot een concentratie van glycogeen geven van 0, 0.04 , 0,08, 0,12, 0,16 en 0,2 ug / ml. Voeg 1 ul van hydrolyse Enzym Mix van de standaarden en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
De achtergrond glucoseconcentratie van de cellijn, van de waarde van de vrije glucoseconcentratie moet worden afgetrokken van de waarde van de totale concentratie glucose (glucose uit het glycogeen hydrolyse + vrije glucose) om het niveau van glycogeen in de cel te bepalen.
3. Ontwikkeling en lezen van fluorescentie
- Voor elke staat, bereiden een buis (buis 1) om gratis glucoseconcentratie en twee buizen te meten (buizen 2 en 3) aan de totale concentratie glucose (elke buis wit metenha verschillende volume van gehydrolyseerde glycogeen).
- Voeg 15 pl supernatant geëxtraheerd eind van stap 1 in buis 1. Voeg 35 ul van hydrolyse buffer te vullen tot een eindvolume van 50 pi. Verkregen fluorescentie zal de vrije glucoseconcentratie geven.
- Voeg X ui gehydrolyseerd glycogeen (verkregen bij stap 2) in buis 2. Stel een eindvolume van 50 pi. Monstervolume (X pl) moet worden aangepast aan celdichtheid en / of celtype om fluorescentie waarden die niet buiten concentraties van de ijkcurve te bepalen.
- Voeg 2 X pi van gehydrolyseerde glycogeen in buis 3. Stel een eindvolume van 50 pi.
- Bereid een ontwikkeling oplossing voor monsters en standaarden door het mengen voor elke buis 48,7 ul van Ontwikkeling buffer, 1 ui van Ontwikkeling Enzym Mix en 0,3 pl OxiRed Probe (in het glycogeen Assay Kit meegeleverd). Bijvoorbeeld, voor 2 voorwaarden, bereiden een mix voor 12 buiss (6 voor normen, 2 gratis glucose en 4 voor de totale glucose fluorescentie).
- Voeg 50 ul van dit mengsel aan elke buis en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Meet de fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 535 nm, een emissiegolflengte van 587 nm zoals aanbevolen, en een spleet van 3 nm voor excitatie en emissie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een laag niveau van zuurstof (hypoxie) in tumoren signalen naar tumorcellen dat de energie opslaan volgende nutriënten uitputting behandelen, teneinde te overleven. Als glycogeen is de belangrijkste energetische polymeer van glucose in zoogdiercellen, bestudeerden we de regulatie van glycogeen opslag in hypoxie. De berekening en normalisatie van de concentratie van glycogeen in cellysaten worden uitgevoerd op de ruwe gegevens van fluorescentie weergegeven in de tabellen 1, 2 en 3. De biochemische assay voor glycogeen bevestigd dat het elektron-dichte aggregaten waargenomen op electronenmicroscoop van CCL39-cellen (figuur 2A) werden glycogeen deeltjes (Figuur 2B). De accumulatie van glycogeen in hypoxie is afhankelijk van de transcriptiefactor hypoxia-induceerbare factor-1 (HIF-1) (Figuur 3), de belangrijkste transcriptiefactor die betrokken zijn bij cellulaire aanpassing aan hypoxie. Ten slotte tonen we aan in verschillende kanker ennoncancer cellijnen die opgeslagen glycogeen snel worden gemetaboliseerd door de cel in minder dan 6 uur (Figuur 4A), en dat het gebruik van glycogeen beschermt tegen celdood onder omstandigheden van glucose honger (Figuur 4B) 1.
Tabel 1.
| glu. (Ug) | 0 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | |
| Ruwe data Fluorescentie (RDF) | fluo. | 60 | 88.8 | 106.7 | 121.8 | 148 | 172.1 |
| RDF - Achtergrond (fluorescentie voor 0 ug in standaard curve) | correctie | 0 | <strong> 28.8 | 46.7 | 61.8 | 88 | 112.1 |
 | |||||||
| Ruwe data Fluo. (RDF) | RDF - Achtergrond | (Correctie * 1000) / helling standaardcurve | Volume van het monster gebruikt om glycogeen titreren | Ruwe data eiwit concentratie | γ * volume monster | Glucose (ng) / eiwit totaal | |
| Totaal glucoseconcentratie 1 | fluo. | correctie | glucose (ng) | volume monster | | eiwit totaal | glucose (ng / pg Pr.) | |
| Monster 1 (CCL39-NX 1) | 65.8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0.07 | 1.4 | 7.5 |
| Monster 2 (CCL39-NX 2) | 64.1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0.11 | 2.2 | 3.4 |
| Monster 3 (CCL 39 HX 48 uur 1) | 177.3 | 117.3 | 211.5 | 4 | 0.22 | 0,88 | 240.3 |
Tabel 1.5.
| Voorbeeld 4 (CCL 39 HX 48h 2) | 174.2 | 114.2 | 205.9 | 4 | 0.24 | 0.96 | 214.5 |
| Monster 5 (CCL 39 HX 72 uur 1) | 164.7 | 104.7 | 188.8 | 2 | 0.22 | 0,44 | 429,1 |
| Voorbeeld 6 (CCL 39 HX 72 uur 2) | 174,7 | 114.7 | 206.8 | 2 | 0.24 | 0.48 | 430,9 |
| Ruwe data Fluo. (RDF) | RDF - Achtergrond | (Correctie * 1000) / helling standaardcurve | Volume van het monster gebruikt om glycogeen titreren | Ruwe data eiwit concentratie | γ * volume monster | Glucose (ng) / eiwittotaal | |
| Totaal glucoseconcentratie 2 | fluo. | correctie | glucose (ng) | volume monster | γ (ug / ul) | eiwit totaal | glucose (ng / pg Pr.) |
| Monster 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0.07 | 0.7 | 7.7 |
| Monster 2 (CCL39-NX 2) | 61.2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0.11 | 1.1 | 2.0 |
| Monster 3 (CCL 39 HX 48 uur 1) | 121.6 | 61.6 | 111.1 | 2 | 0.22 | 0,44 | 252.4 |
| Voorbeeld 4 (CCL 39 HX 48 uur 2) | 111.9 | 51.9 | 93.6 | 2 | 0.24 | 0.48 | 195.0 |
| Monster 5 (CCL 39 HX 72 uur 1) | 110.3 | 50.3 | 90.7 | 1 | 0.22 | 0.22 | 412,3 |
| Voorbeeld 6 (CCL 39 HX 72 uur 2) | 117,8 | 57.8 | 104.2 | 1 | 0.24 | 0.24 | 434.3 |
Tabel 2.
| gratis glucose | fluo. | correctie | glucose (ng) | volume monster | γ (ug / ul) | eiwit totaal | glucose (ng / pg Pr.) | negatieve waarden worden beschouwd als 0 |
| Monster 1 (CCL39-NX 1) | 60.2 | 0.2 | 0.4 | 15 | 0.07 | 1.05 | 0.3 | 0.3 |
| Monster 2 (CCL39-NX 2) | 55.3 | -4.7 | -8.5 | 15 | 0.11 | 1.65 | -5.1 | 0 |
| Monster 3 (CCL 39 HX 48 uur 1) | 56.5 | -3,5 | -6,3 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.9 | 0 |
| Voorbeeld 4 (CCL 39 HX 48 uur 2) | 56.7 | -3.3 | -6.0 | 15 | 0.24 | 3,6 | -1.7 | 0 |
| Monster 5 (CCL 39 HX 72 uur 1) | 57.5 | -2.5 | -4.5 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.4 | 0 |
| Voorbeeld 6 (CCL 39 HX 72 uur 2) | 56.9 | -3.1 | -5.6 | 15 | 0.24 | 3,6 | -1,6 | 0 |
Tabel 3.
| Totaal glucose concentratie 1 | Totaal glucose concentratie 2 | Totaal glucose concen-tratien gemiddelde | Gratis glucose concentratie | Glycogeen (ng / ug Pr.) (Totale gemiddelde glucose - gratis glucose) | Gemiddeld glycogeen (tussen dupli-caten) | Standaard fout | |
| Monster 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0.3 | 7.3 | 5.0 | 3.3 |
| Monster 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2.0 | 2.7 | 0.0 | 2.7 | ||
| Monster 3 (CCL 39 HX 48 uur 1) | 240.3 | 252,4 | 246.4 | 0.0 | 246.4 | 225.6 | 29.5 |
| Sample 4 (CCL 39 HX 48 uur 2) | 214.5 | 195.0 | 204.7 | 0.0 | 204.7 | ||
| Monster 5 (CCL 39 HX 72 uur 1) | 429,1 | 412,3 | 420,7 | 0.0 | 420,7 | 426,6 | 8.4 |
| Voorbeeld 6 (CCL 39 HX 72 uur 2) | 430,9 | 434.3 | 432,6 | 0.0 | 432,6 |
Tabellen 1, 2, 3. Representatieve berekening en normalisering van glycogeen inhoud van CCL39 cellen van fluorescentie rij datas. Glycogeen werd getitreerd in CCL39 na incubatie in normoxia (Nx) of in hypoxie 1% O 2 (Hx) voor 48 uur of 72 uur. Glycogeen metingen zijn gedaan in tweevoud voor elke conditie. Bovenste deel van
Figuur 1. Glycogeen metabolisme. Overzicht van de synthese en afbraak van glycogeen Glucose komt in het cytoplasma door glucose transporters (gluts) voor omzetting in glucose-6-fosfaat door hexokinases 1 en 2 (HK). Glucose-6-fosfaat (G6P) is op de kruising tussen glycolyse, de pentosefosfaatroute en glycogenese. Fosfoglucomutase (PGM) is deeerste enzym in glycogenese dat de omzetting katalyseert van G6P tot glucose-1-fosfaat (G1P), die vervolgens wordt omgezet in UDP-glucose door glucose-1-fosfaat urydylyltransferase (UGP). UDP-glucose wordt gebruikt door glycogeen synthase (GS) een ankerplaats molecule opgebouwd uit glycogenin en een glucoserest bevestigd door een vertakkingsenzym (BE) verlengen. Glycogeen synthase en vertakkingsenzymen meewerken aan de vorming van glycogeen, ook wel glycogenese. Het omgekeerde proces dat glycogeen hydrolyseert in G1P via glycogeenfosforylase (GP) en debranching enzymen (DBE) wordt genoemd glycogenolysis. Aangepast van 3.
Figuur 2. Accumulatie van glycogeen in hypoxie in niet kankercellen en kankercellen. (A) Electron micrografts van CCL39 in normoxia (Nx) (linker paneel) en hypoxie 1% O 2 (Hx 1%60, 96 uur) (rechter paneel). Pijlen duiden aggregaten van glycogeen deeltjes. (B) Kwantificering van de hoeveelheid glycogeen in CCL39 (zwarte balken) en LS174 (witte balken) cellen gekweekt in normoxia (Nx) of hypoxie 1% O2 (Hx 1%) voor 48, 72 en 96 uur in een 25 mM glucose-bevattend medium.
Figuur 3. Accumulatie van glycogeen in hypoxie afhankelijk is HIF-1. Kwantificering van het glycogeen bedrag LS174 pTerHIF-1α. Deze cellen zijn induceerbare klonen die een shRNA tegen HIF-1α in toestand van tetracycline. Cellen groeiden in normoxia (Nx) (witte balken) of hypoxie 0,1% O 2 (Hx 0,1% - zwarte balken) in de afwezigheid (-) of aanwezigheid (+) van tetracycline (Tet).
Figuur 4. Glycogeen storage beschermt tegen celdood. (A), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF-7 (●) en MDA-MB231 (x) cellen werden blootgesteld aan 1% O 2 hypoxie gedurende 96 uur en vervolgens gekweekt in glucose-vrij medium gedurende 6 hr. Het glycogeen werd gemeten net vóór verwijdering van glucose en 100% weergeeft. Glycogeen werd vervolgens gemeten op 1, 3, en 6 uur. De resultaten zijn representatief voor ten minste drie afzonderlijke experimenten. (B) Meting van celdood in CCL39-cellen. Cellen werden blootgesteld aan ofwel normoxia (- opslag) of hypoxie (+ opslag) gedurende 96 uur en geïncubeerd in glucosevrij medium hypoxie gedurende 24 uur voor het meten van celdood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biochemische titratie van glycogeen in vitro maakt een nauwkeurige kwantificering van cellen glycogeengehalte. In vergelijking met een aantal andere technieken (PAS, immunofluorescentie met een glycogeen antilichaam, enz.), Deze titratie is zeer specifiek, gevoelig en reproduceerbaar. Bovendien is de werkwijze is gunstig omdat het geen radioactiviteit maar een fluorescentie spectrometer vereist. Deze techniek is zuiver kwantitatieve en ofwel informaties glycogeen verspreiding in de cel kan worden gebracht.
De in dit manuscript beschreven techniek wordt verwezenlijkt celextracten, maar het kan ook worden verwezenlijkt weefselsecties met een geschikte methode voor de extractie van glycogeen uit weefsels. Deze test wordt gebruikt voor in vitro toepassingen en door een indirecte meting van glycogeen (na hydrolyse tot glucose) kan niet worden ontwikkeld om glycogeen te volgen in vivo.
PAS kleuring is al op grote schaalgebruikt om vele glycogeenstapelingsziekten (ziekte van von Gierke, ziekte Cori, ziekte van McArdle's, enz.) te diagnosticeren. Het wordt ook gebruikt om schimmelinfecties te detecteren en te discrimineren tussen verschillende subtypen van tumoren. In theorie zou PAS kleuring worden gekoppeld aan een beeld analysator om de glycogeen concentratie te bepalen. In de praktijk is deze techniek moeilijk uit te voeren en is minder geschikt dan de hier beschreven werkwijze de volgende redenen. Ten eerste, zoals PAS-positieve kleuring (violet) overlapt met de negatieve kleuring (hematoxyline-blauw), is het technisch moeilijk de negatieve signaal sluiten zonder de positief signaal. Bovendien PAS kleuring niet reproduceerbaar genoeg glycogeen kwantificeren, omdat de intensiteit van de kleur kan afhankelijk van het tijdstip van fixatie, werkzaamheid van kleuring, wassen, enzovoort. Ten slotte is dit biochemisch methodologie levert een gemiddelde concentratie van glycogeen voor een groot aantal cellen, terwijl PAS kleuring gericht op een specifiek gebied en daardoor minder representatief voor de totale concentratie glycogeen.
De biochemische analyse van glycogeen kunnen zeer nauwkeurige en informatieve gegevens over het niveau van glycogeen in weefsel verschaffen. Deze gegevens kunnen bijvoorbeeld hypothetisch worden gecorreleerd met ziekteprogressie of kunnen helpen om de effecten van de behandeling op glycogeen metabolisme begrijpen. Anderzijds, deze techniek vereist een aantal stappen (eiwitkwantificering, hydrolyse van glycogeen en minimaal drie fluorescentie metingen per monster), en lijkt minder praktisch dan de PAS kleuring. Voor een beter begrip van de fysiologische of pathofysiologische metabolisme (kanker, enz.), Is het belangrijk om de glucose (en ATP) door glycogeen nauwkeurig te kwantificeren. Echter, glycogeen kwantificering alleen is niet voldoende om glycogeen metabolisme begrijpen en moet gaan met microscopie de verdeling van glycogeen in de cellen te bepalen.
nt '> Het is belangrijk op te merken dat ondanks de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de assay, een kleine variatie in de eiwitgehalte kan leiden tot grote variaties van genormaliseerde waarden van glycogeen. Bovendien, hoewel er een lineaire toename van de fluorescentie met glycogeen concentratie, wordt de lineariteit niet in een hoge concentratie waarvoor het signaal wegvalt dramatisch onderhouden. Daarom raden wij u geen rekening te houden met de fluorescentie waarden over concentraties van de kalibratiecurve. Daarom adviseren wij het uitvoeren van twee lezingen met twee verschillende sample volumes. In Zo wordt de fluorescentie weerspiegelt de glycogeen in de cellen en wordt niet gecompenseerd door een afname in fluorescentie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar voor de Dr Thierry POURCHER voor zodat we de fluorescentie spectrometer gebruiken en voor zijn hulp. Het laboratorium wordt gefinancierd door de Ligue Nationale Contre le Cancer (equipe Labellisee), de Vereniging pour la Recherche contre le Cancer, het Institut National du Cancer (INCA), de Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU-programma KP7), het Centrum A. Lacassagne, het Centre National de la Recherche Scientifique, het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale en de Universiteit van Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Wij danken dr. M Christiane Brahimi-Hoorn voor het kritisch lezen en redactionele correctie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R.
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. "Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. Theory and practice of histotechnology. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
