Summary
Vi beskriver här en noggrann, reproducerbar och praktiskt biokemisk metod för titrering av glykogen in vitro. Denna teknik använder Abcam Glykogen analyssats och är baserad på på varandra följande hydrolys av glykogen till glukos och glukos-titrering genom fluorescens.
Abstract
Glykogen är den huvudsakliga energisk polymer av glukos i ryggradsdjur och spelar en avgörande roll för hela kroppen metabolism och i cellulär metabolism. Många metoder för att upptäcka glykogen finns redan, men bara ett fåtal är kvantitativ. Vi beskriver här en metod som använder den Abcam Glykogen analyssats, som är baserad på specifik nedbrytning av glykogen till glukos med glukoamylas. Glukos sedan specifikt oxideras till en produkt som reagerar med OxiRed sonden för att producera fluorescens. Titrering är korrekt, känsligt och kan uppnås på cellextrakt eller vävnadssektioner. Emellertid i motsats till andra tekniker, att det inte ger information om fördelningen av glykogen i cellen. Som ett exempel på denna teknik, beskriver vi här titreringen av glykogen i två cellinjer, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 och humant kolonkarcinom LS174, inkuberade i normoxia (21% O2) i jämförelse med hypoxi (1% O2). Vi antog att hypoxi är en betynal som förbereder celler för att syntetisera och lagra glykogen för att överleva en.
Introduction
Glykogen är en flergrenad polymer av glukosrester, som är närvarande i cytoplasman hos många celltyper. Det är en av de viktigaste formerna av energilagring i celler och spelar en viktig roll i glukosmetabolismen. De flesta däggdjursceller kan producera och lagra glykogen, som snabbt kan brytas ned till glukos för att främja glykolys och ATP-produktion under metabolisk stress. Leverceller producerar enorma mängder av glykogen för att reglera blodsockernivån vilket ger en kontinuerlig tillförsel av glukos i kroppen. I motsats härtill är koncentrationen av glykogen i andra celler (muskler, röda blodkroppar, etc.) relativt lågt. Men lokalt, dessa mängder är tillräckliga för att ge energi på kort sikt när cellerna plötsligt exponeras för en omgivning berövas näringsämnen.
Glykogensyntes och glykogen nedbrytning följer samma steg i alla vävnader (Figur 1). För det första, glukosträder cellerna genom glukostransportörer (gluts), och omvandlas snabbt från glukos-6-fosfat (G6P) till glukos-1-fosfat (G1P) genom fosfoglukomutas. G1P modifieras sedan till UDP-glukos, och kolet C1 av UDP-glukos är bunden till en tyrosinrest i glykogeninet, den förankrande proteinet av glykogen. Denna molekyl, anses vara en glykogen primer förlängs genom fastsättning av UDP-glukos till den terminala glukos av en α (1 → 4)-bindning via glykogensyntas. Slutligen, när en linjär kedja med över 11 glukosenheter bildas, överför det förgrenande enzymet en terminal oligosackarid bestående av minst sex glukosrester till en annan glukos av kedjan i närheten genom en α (1 → 6)-bindning. En upprepning av denna process ger en massiv fraktal struktur med grenar som bildar en spiral med 6,5 glukos per varv. Glykogen kan vara omvänt hydrolyseras till glukos genom samordnade åtgärderav avgrenande enzymer som hydrolyserar den α (1 → 6) bundet och glykogenfosforylas som hydrolyserar α (1 → 4) glykosidiska bunden mellan den sista resten av glukos av en gren och glykogenmolekyl. Denna reaktion kallas glykogenolys aktiveras genom att öka nivåerna av AMP (reflekterande ATP-förbrukning), och hämmas av glukos och ATP 2,3.
Genom elektronmikroskopi har glykogenmolekyler har beskrivits i många celltyper som β fria partiklar (eller glykogen monoparticles) av 15 till 30 nm i diameter. I specifika celltyper såsom hepatocyter, kan β partiklar sättas samman till en komplex bildar rosetter, även känd som α-partiklar som varierar i diameter från 80 nm till högst 200 nm 4 5, vätebindning, eller ens genom protein-proteininteraktioner 6. Mängden glykogen som lagras i cellerna beror på många parametrar: (I) mängden glykogeninet i cellen som initierar glykogensyntes, (II) aktiviteten av glykogensyntas och fosforylas regleras av proteinfosforylering / defosforylering, (III) koncentrationen av glukos i cellerna, vilket är beroende av flera parametrar, såsom tillförseln av glukos från det vaskulära systemet och glukosupptag genom celler. Glykogen butiker är hårt reglerad av allosterisk reglering av biosyntetiska hormoner genom mellanliggande metaboliter, av hormoner som reglerar ämnesomsättningen, och genom näringssensorsignalvägar 7.
Det är viktigt att varakunna kvantifiera glykogen i biologiska prover för att bättre förstå vikten av glykogenmetabolism i hela kroppen och cellnivå. Vi beskriver här en noggrann, reproducerbar och praktiskt biokemiska i analys vitro för glykogen. Denna teknik är baserad på kvantifiering av glukos fluorescens före och efter specifik hydrolys av glykogen.
Andra metoder finns för att uppskatta nivån av glykogen i cellerna, men de flesta av dem är inte kvantitativ. En av de första teknikerna som beskrivs för kvantifiering av glykogen i cellerna baserades på mätning av [14 C]-glukos inkorporering i glykogen 8,9. Användningen av radioaktivitet gör denna process det svårare att hantera, men det har den fördelen att den ger hastigheten av glukos införlivande i glykogen och för att skilja mellan fördelningen av glukosrester på de yttre grenarna och i kärnan av molekylen (det kräver också en ytterligare β-amylolysis och kromatografiska steg). En annan teknik har utvecklats på senare tid och är baserad på inkorporeringen av två-NBDG (2 - {N-[7-nitrobens-2-oxa-1 ,3-diazol-4-yl] amino}-2-deoxiglukos), ett 2-deoxiglukos fluorescerande derivatet, till glykogen 10. Den uppmätta fluorescensintensiteten återspeglar mängden glykogen som tillverkas och kan mätas med en fluorescensläsare. Fördelning av fluorescens i cellen kan också utvärderas genom konfokalmikroskopi.
Bland de andra nonquantitative teknik är perjodsyra-Schiff-färgning (PAS) kanske den vanligaste. Den kan användas för detektionen av glykogen i fixerade celler, vävnadssnitt i paraffin eller frusen. Denna histologiska färger teknik som inte specifikt polysackarider, glykolipider, glykoproteiner, cellulosa och neutrala muciner i lila. Specificiteten för detta test kan ökas genom behandling av fixerade celler eller vävnadssektioner med diastas, som specifikt digererar glykogen. Däreftergraden av glykogen kan kvalitativt uppskattas genom att jämföra ohydrolyserade prover (alla kolhydrater modifierade makromolekyler) till hydrolyserade prover (kolhydrat modifierade makromolekyler utom glykogen). PAS-färgning och mikroskopisk analys, till skillnad från biokemiska analyser av glykogen ger upplysningar om fördelningen av glykogen i cellen, vilka kan diffundera eller koncentreras i en viss del av cellen. Men även om PAS-färgning uppskattningar skillnader i glykogen ackumulation mellan olika förhållanden, är det inte kvantitativ 11.
En monoklonal musantikropp som ursprungligen gjordes med användning mandibular kondylära brosk som antigenet har visat sig reagera med glykogen i cellerna och med renat glykogen in vitro 12. Eftersom denna antikropp specifikt känner igen glykogenrelaterade sockerkedjor, är det ett användbart verktyg för detektion av glykogen genom immunhistokemi på ett mer specifikt sätt än PAS-färgning. Elektronmikroskopi är en annan teknik som tillåter visualisering av korn av glykogen i celler och utvärdering av graden av glykogenlagring. Faktum glykogen β partiklar är lätt att känna igen med ett elektronmikroskop som elektrontäta granulat 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biokemiska Titrering av glykogen
1. Cellys
- Seed-celler vid en koncentration av från 0,5 till 2 x 10 6 per 100 skålen mm diameter.
- Behandling: inkubera celler 24, 48, eller 72 timmar i låg syrekoncentration (hypoxi) i en bugg-Box anaerob arbetsstation (Ruskinn Technology Biotrace International Plc, Bridgend, Storbritannien) satt till 1% eller 0,1% O2, 94% eller 94,9% N2 och 5% CO2. Parallellt inkubera celler i normoxia (21% O2, 5% CO2). Ändra medium (25 mM glukos-innehållande medium) varje 24 h för att minimera variationer i glukoskoncentrationen under tiden för experimentet.
- Efter behandlingen Tvätta cellerna 2x med PBS för att avlägsna spår av glukos från odlingsmediet. Skrapa cellerna i kall PBS.
- Centrifugera lösningen vid 1000 rpm under 5 min, kasta supernatanten och tvätta pelleten en gång med PBS. Pelleten kan frysas vid -20 ° C innan ytterligare.
- Återsuspendera pelleten i 100 | il destillerat vatten. Tillsätt 100 l av glykogen Hydrolys Buffer medföljer glykogen Assay Kit (Abcam). Koka lysatet vid 95 ° C under 5 minuter för att inaktivera enzymerna.
- Vortexa och centrifugera lysatet vid 13.000 varv per minut under 10 minuter för att avlägsna de olösliga produkter. Håll supematanten.
- För att normalisera glykogennivåer med proteinhalten mellan prover, kan kvantifiering av proteiner göras med 25 till 35 | il av supernatanten med användning av bicinkoninsyra-analys (BCA-Interchim).
Några av lysatet kan användas för att mäta den fria glukoskoncentrationen inuti cellerna.
2. Hydrolys av Glykogen
- Blanda 50 pl av supernatanten (steg 1) med ett pl av Hydrolys Enzyme Mix. Blandningen innehåller glukoamylas. Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Förbered kalibreringskurvan genom att späda ut standard glykogen (2 mg / ml) supplied med satsen till en lösning av 10 pg / ml i hydrolys-buffert. Sedan förbereder sex separata rör med 0, 4, 8, 12, 16 och 20 | il av 10 ^ g / ml standard och justera varje rör till en slutlig volym av 50 | il med hydrolys-buffert för att ge en koncentration av glykogen av 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16 och 0,2 pg / ml. Lägg ett pl av Hydrolys Enzyme Mix i standarderna och inkubera under 30 min vid rumstemperatur.
Bakgrunden glukoskoncentration av cellinje, som ges av värde för den fria glukoskoncentration, måste subtraheras från värdet för den totala glukoskoncentrationen (glukos från glykogen hydrolys + fri-glukos) för att fastställa graden av glykogen i cellen.
3. Utveckling och läsning av fluorescens
- För varje tillstånd, framställa ett rör (rör 1) för att mäta fri glukos koncentration och två rör (rör 2 och 3) för att mäta den totala glukoskoncentrationen (varje rör witha olika volym hydrolyserad glykogen).
- Tillsätt 15 | il av supernatanten extraheras vid slutet av steg 1 i röret 1. Addera 35 pl av hydrolys-buffert för att slutföra till en slutlig volym av 50 | il. Erhålls fluorescens ger den fria glukoskoncentrationen.
- Lägg X il av hydrolyserad glykogen (erhållen i steg 2) i röret 2. Justera till en slutlig volym av 50 | il. Provvolym (X l) måste anpassas efter celltäthet och / eller celltypen för att få fluorescens-värden som inte är längre än koncentrationer av kalibreringskurvan.
- Lägg 2 X il av hydrolyserad glykogen i röret 3. Justera till en slutlig volym av 50 | il.
- Bered en utvecklingslösning för prover och standarder genom att blanda för varje rör 48,7 l av utvecklings buffert, 1 pl utvecklings Enzyme Mix och 0,3 l av OxiRed Probe (levereras i glykogen Assay Kit). Till exempel för 2 villkor, förbereda en mix för 12 rörs (6 för standarder, 2 gratis glukos och 4 för den totala glukos fluorescens).
- Tillsätt 50 | il av denna blandning till varje rör och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Mät fluorescensen vid en excitationsvåglängd av 535 nm, en emissionsvåglängd av 587 nm som rekommenderas, och en spalt av 3 nm för excitation och emission.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En låg nivå av syre (hypoxi) i tumörer signaler till tumörceller behovet av att lagra energi för att hantera efterföljande näringsutarmning, för att överleva. Eftersom glykogen är den huvudsakliga energisk polymer av glukos i däggdjursceller, studerade vi regleringen av glykogen lagring i hypoxi. Beräkningen och standardisering av koncentrationen av glykogen i cellysat måste utföras på rådata av fluorescens såsom visas i tabellerna 1, 2 och 3. Den biokemiska analysen för glykogen bekräftade att de elektrontäta aggregat observerats på elektronmikrofotografier av CCL39-celler (Figur 2A) till glykogen partiklar (Figur 2B). Ackumuleringen av glykogen i hypoxi är beroende av transkriptionsfaktorn Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) (Figur 3), den viktigaste transkriptionsfaktor involverad i cellulär anpassning till hypoxi. Slutligen visar vi i olika cancer ochnoncancer cellinjer som lagrade glykogen snabbt kan metaboliseras av cellen i mindre än 6 tim (fig 4A), och att användningen av glykogen skyddar mot celldöd under betingelser för glukos svält (Figur 4B) 1.
Tabell 1.
| glu. (Ig) | 0 | 0,04 | 0,08 | 0,12 | 0,16 | 0,2 | |
| Raw Data Fluorescens (RDF) | fluo. | 60 | 88,8 | 106,7 | 121,8 | 148 | 172,1 |
| RDF - Bakgrund (fluorescens för 0 mikrogram i standardkurva) | korrigering | 0 | <strong> 28,8 | 46,7 | 61,8 | 88 | 112,1 |
 | |||||||
| Rådata Fluo. (RDF) | RDF - Bakgrund | (Korrigering * 1000) / lutning standardkurva | Volym av prov som används för att titrera glykogen | Rådata protein koncentration | γ * provvolym | Glukos (ng) / protein totalt | |
| Totalt glukoskoncentration 1 | fluo. | korrigering | glukos (ng) | volym prov | | protein totalt | glukos (ng / mikrogram Pr.) | |
| Prov 1 (CCL39-NX 1) | 65,8 | 5,8 | 10,5 | 20 | 0,07 | 1,4 | 7,5 |
| Prov 2 (CCL39-NX 2) | 64,1 | 4,1 | 7,4 | 20 | 0,11 | 2,2 | 3,4 |
| Prov 3 (CCL 39 HX 48 tim 1) | 177,3 | 117,3 | 211,5 | 4 | 0,22 | 0,88 | 240,3 |
Tabell 1.5.
| Prov 4 (CCL 39 HX 48h 2) | 174,2 | 114,2 | 205,9 | 4 | 0,24 | 0,96 | 214,5 |
| Prov 5 (CCL 39 HX 72 tim 1) | 164,7 | 104,7 | 188,8 | 2 | 0,22 | 0,44 | 429,1 |
| Prov 6 (CCL 39 HX 72 tim 2) | 174,7 | 114,7 | 206,8 | 2 | 0,24 | 0,48 | 430,9 |
| Rådata Fluo. (RDF) | RDF - Bakgrund | (Korrigering * 1000) / lutning standardkurva | Volym av prov som används för att titrera glykogen | Rådata protein koncentration | γ * provvolym | Glukos (ng) / proteintotalt | |
| Totalt glukoskoncentration 2 | fluo. | korrigering | glukos (ng) | volym prov | γ (^ g / ^ il) | protein totalt | glukos (ng / mikrogram Pr.) |
| Prov 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5,4 | 10 | 0,07 | 0,7 | 7,7 |
| Prov 2 (CCL39-NX 2) | 61,2 | 1,2 | 2,2 | 10 | 0,11 | 1,1 | 2,0 |
| Prov 3 (CCL 39 HX 48 tim 1) | 121,6 | 61,6 | 111,1 | 2 | 0,22 | 0,44 | 252,4 |
| Prov 4 (CCL 39 HX 48 tim 2) | 111,9 | 51,9 | 93,6 | 2 | 0,24 | 0,48 | 195,0 |
| Prov 5 (CCL 39 HX 72 tim 1) | 110,3 | 50,3 | 90,7 | 1 | 0,22 | 0,22 | 412,3 |
| Prov 6 (CCL 39 HX 72 tim 2) | 117,8 | 57,8 | 104,2 | 1 | 0,24 | 0,24 | 434,3 |
Tabell 2.
| fri glukos | fluo. | korrigering | glukos (ng) | volym prov | γ (^ g / ^ il) | protein totalt | glukos (ng / mikrogram Pr.) | negativa värden betraktas som 0 |
| Prov 1 (CCL39-NX 1) | 60,2 | 0,2 | 0,4 | 15 | 0,07 | 1,05 | 0,3 | 0,3 |
| Prov 2 (CCL39-NX 2) | 55,3 | -4,7 | -8,5 | 15 | 0,11 | 1,65 | -5,1 | 0 |
| Prov 3 (CCL 39 HX 48 tim 1) | 56,5 | -3,5 | -6,3 | 15 | 0,22 | 3,3 | -1,9 | 0 |
| Prov 4 (CCL 39 HX 48 tim 2) | 56,7 | -3,3 | -6,0 | 15 | 0,24 | 3,6 | -1,7 | 0 |
| Prov 5 (CCL 39 HX 72 tim 1) | 57,5 | -2,5 | -4,5 | 15 | 0,22 | 3,3 | -1,4 | 0 |
| Prov 6 (CCL 39 HX 72 tim 2) | 56,9 | -3,1 | -5,6 | 15 | 0,24 | 3,6 | -1,6 | 0 |
Tabell 3.
| Totalt glukos koncentration 1 | Totalt glukos koncentration 2 | Totalt glukos koncentrera tration genomsnitt | Gratis glukos koncentration | Glykogen (ng / mikrogram Pr.) (Totala genomsnittliga glukos - fri glukos) | Genomsnittlig glykogen (mellan dubbelarbete fikat) | Standard error | |
| Prov 1 (CCL39-NX 1) | 7,5 | 7,7 | 7,6 | 0,3 | 7,3 | 5,0 | 3,3 |
| Prov 2 (CCL39-NX 2) | 3,4 | 2,0 | 2,7 | 0,0 | 2,7 | ||
| Prov 3 (CCL 39 HX 48 tim 1) | 240,3 | 252,4 | 246,4 | 0,0 | 246,4 | 225,6 | 29,5 |
| Sampel 4 (CCL 39 HX 48 tim 2) | 214,5 | 195,0 | 204,7 | 0,0 | 204,7 | ||
| Prov 5 (CCL 39 HX 72 tim 1) | 429,1 | 412,3 | 420,7 | 0,0 | 420,7 | 426,6 | 8,4 |
| Prov 6 (CCL 39 HX 72 tim 2) | 430,9 | 434,3 | 432,6 | 0,0 | 432,6 |
Tabellerna 1, 2, 3. Representant beräkning och normalisering av glykogeninnehåll i CCL39 celler från fluorescens rad datas. Glykogen titrerades i CCL39 efter inkubation i normoxia (Nx) eller hypoxi 1% O 2 (Hx) under 48 timmar eller 72 timmar. Glykogen mätningar har gjorts i två exemplar för varje tillstånd. Övre delen av
Figur 1. Glykogen metabolism:. Översikt av syntes och nedbrytning av glykogen glukos går in i cellens cytoplasma genom glukostransportörer (gluts) för omvandling till glukos-6-fosfat genom hexokinases 1 och 2 (HK). Glukos-6-fosfat (G6P) ligger vid korsningen mellan glykolysen, pentosfosfatvägen och glykogenesen. Fosfoglukomutas (PGM) är denförsta enzymet i glykogenesen som katalyserar omvandlingen av G6P till glukos 1-fosfat (G1P), som sedan omvandlas till UDP-glukos med glukos-1-fosfat urydylyltransferase (UGP). UDP-glukos används av glykogensyntetas (GS) för att förlänga en förankringsmolekyl består av glykogeninet och en glukosrest fäst med en förgreningsenzym (BE). Glykogen syntas och förgrenings enzymer samarbetar i bildandet av glykogen, även kallad glykogenesen. Den omvända processen som hydrolyserar glykogen i G1P via glykogenfosforylas (GP) och avgrening enzymer (DBE) kallas glykogenolys. Anpassad från 3.
Figur 2. Ackumulering av glykogen i hypoxi i icke cancerceller och cancerceller. (A) Elektron micrografts av CCL39 i normoxi (NX) (vänster panel) och hypoxi 1% O 2 (Hx 1%60, 96 tim) (höger panel). Pilar betecknar aggregat av glykogen partiklar. (B) Kvantifiering av mängden av glykogen i CCL39 (svarta staplar) och LS174 (vita staplar) celler odlade i normoxi (Nx) eller hypoxi 1% O 2 (Hx 1%) för 48, 72 och 96 h i en 25 mM glukos-innehållande medium.
Figur 3. Ansamling av glykogen i hypoxi är beroende av HIF-1. Kvantifiering av glykogen beloppet i LS174 pTerHIF-1α. Dessa celler är inducerbara kloner som uttrycker en shRNA mot HIF-1α i tillstånd av tetracyklin. Celler växte i normoxia (Nx) (vita staplar) eller hypoxi 0,1% O 2 (Hx 0,1% - svarta staplar) i frånvaro (-) eller närvaro (+) av tetracyklin (Tet).
Figur 4. Glykogen StoraGE skyddar mot celldöd. (A), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF-7 (●) och MDA-MB231 (x)-celler utsattes för 1% O 2 hypoxi under 96 h och odlades sedan i glukosfritt medium under 6 hr. Den glykogenkoncentrationen mättes strax före avlägsnandet av glukos och utgör 100%. Glykogen mättes sedan vid 1, 3, och 6 timmar. Resultaten är representativa för minst tre separata experiment. (B) Mätning av celldöd i CCL39-celler. Cellerna utsattes för antingen normoxia (- lagring) eller hypoxi (+ förvaring) för 96 h och odlades i glukosfritt medium i hypoxi för 24 timmar före mätning celldöd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biokemiska titrering av glykogen in vitro ger en exakt kvantifiering av celler glykogeninnehåll. Jämfört med vissa andra tekniker (PAS, immunofluorescens med en glykogen antikropp, osv.), Är denna titrering väldigt specifika, känslig och reproducerbar. Dessutom är metoden bekvämare, eftersom den inte kräver någon radioaktivitet men en fluorescensspektrometer. Dock är denna teknik rent kvantitativ och ger ingen information om glykogen fördelning i cellen.
Den teknik som beskrivs i detta manuskript uppnås på cellextrakt, men den kan också uppnås på vävnadssektioner med en lämplig metod för extraktion av glykogen från vävnader. Denna analys används för in vitro-applikationer och på grund av en indirekt mätning av glykogen (efter hydrolys till glukos), kan det inte utvecklas för att följa glykogen butiker in vivo.
PAS färgning är redan allmäntanvänds för att diagnostisera många glykogenlagringssjukdomar (von Gierke sjukdom, Cori sjukdom, McArdle sjukdom, etc.). Det används också för att detektera svampinfektioner eller för att särskilja mellan olika undertyper av tumörer. I teorin kan PAS-färgning vara kopplad till en bildanalysator för att bestämma glykogenkoncentrationen. I praktiken är denna teknik svår att utföra och är mindre lämpligt än den här beskrivna metoden av följande anledningar. För det första, som PAS-positiv färgning (violett) överlappar med negativ färgning (hematoxylin-blå) är det tekniskt svårt att utesluta negativa signalen utan att ta bort den positiva signalen. Dessutom är PAS-färgning inte är reproducerbar nog att kvantifiera glykogen, eftersom intensiteten i färgen kan bero på tidpunkten för fixering, effekten av färgning, tvättning, osv. Slutligen ger denna biokemiska metoden en genomsnittlig koncentration av glykogen för ett stort antal celler, medan PAS-färgning är inriktat på ett specifikt område och därför är mindre representativa för den totala glykogenkoncentrationen.
Den biokemiska analysen av glykogen kan ge mycket exakta och informativa uppgifter om graden av glykogen i vävnad. Dessa uppgifter skulle till exempel kunna hypotetiskt korrelerade med sjukdomsprogression, eller kan hjälpa till att förstå effekterna av behandling på glykogenmetabolism. Å andra sidan, kräver denna teknik flera steg (protein kvantifiering, hydrolys av glykogen och minst tre fluorescens avläsningar per prov), och verkar mindre praktiskt än PAS färgning. För en bättre förståelse av fysiologiska eller patofysiologiska metabolismen (cancer, osv.), Är det viktigt att exakt kvantifiera glukos (och ATP) som tillhandahålls av glykogen. Det är dock inte tillräckligt för att förstå glykogenmetabolism ensam glykogen kvantifiering och måste kombineras med mikroskopi för att bestämma fördelningen av glykogen i cellerna.
nt "> Det är viktigt att påpeka att trots den noggrannhet och reproducerbarhet av denna analys, kan en liten variation i proteinhalten leda till stora variationer av normaliserade värden av glykogen. Även om det finns en linjär ökning av fluorescens med glykogenkoncentration är linjäriteten inte upprätthålls i hög koncentration för vilken signalen sjunker dramatiskt. Därför rekommenderar vi att inte ta hänsyn till fluorescens värden bortom koncentrationer av kalibreringskurvan. Vi rekommenderar därför att utföra två behandlingar med två olika provvolymer. I detta sätt är fluorescens återspeglar den glykogen i cellerna och är inte kompenseras genom en sänkning i fluorescens.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Dr Thierry Pourcher för att tillåta oss att använda fluorescens spektrometer och för hans hjälp. Laboratoriet finansieras av Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), Association pour la Recherche contre le Cancer, Institut National du Cancer (INCA), Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU-programmet FP7), Centrum A. Lacassagne, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale och universitetet i Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Vi tackar Dr M Christiane Brahimi-Horn för kritisk läsning och redaktionell korrigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. "Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. Theory and practice of histotechnology. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
