Summary
Vi beskriver her en nøyaktig, reproduserbar og praktisk biokjemisk metode for titrering av glykogen in vitro. Denne teknikken benytter Abcam Glykogen assay kit, og er basert på etterfølgende hydrolyse av glykogen til glukose og glukose titrering av fluorescens.
Abstract
Glykogen er hoved energisk polymer av glukose i virveldyr og spiller en avgjørende rolle i hele kroppens metabolisme, så vel som i cellulær metabolisme. Mange metoder for å oppdage glykogen allerede eksisterer, men bare et fåtall er kvantitativ. Vi beskriver her en metode ved hjelp av Abcam Glykogen analysen kit, som er basert på spesifikke degradering av glykogen til glukose ved glucoamylase. Glukose er da spesielt oksydert til et produkt som reagerer med OxiRed probe for å produsere fluorescens. Titrering er nøyaktig, følsom og kan oppnås på celleekstrakter eller vevssnitt. Imidlertid, i motsetning til andre teknikker, det gir ikke informasjon om fordeling av glykogen i cellen. Som et eksempel på denne teknikk, beskriver vi her titreringen av glykogen i to cellelinjer fra kinesisk hamster lunge fibroblast CCL39 og human colon carcinoma LS174, inkubert i normoksiske (21% O 2) mot hypoksi (1% O 2). Vi antok at hypoksi er en signal som forbereder celler til å syntetisere og lagre glykogen for å overleve en.
Introduction
Glykogen er en multibranched polymer av glukoserester, som er til stede i cytoplasma av mange celletyper. Det er en av de viktigste former for energilagring i celler, og spiller en viktig rolle i glukosemetabolismen. De fleste pattedyrceller er i stand til å produsere og lagre glykogen, som kan bli hurtig nedbrutt til glukose for å fremme glykolyse og ATP-produksjon ved metabolsk stress. Hepatocytter produserer enorme mengder glykogen å regulere blodsukkeret derved å tilveiebringe en kontinuerlig tilførsel av glukose i kroppen. I motsetning til dette er konsentrasjonen av glykogen i andre celler (muskler, røde blodceller, osv.) er relativt lav. Imidlertid lokalt, disse mengder er tilstrekkelig til å gi energi på kort sikt når cellene blir plutselig eksponeres for et miljø ute av næringsstoffer.
Glykogen syntese og glykogen sammenbrudd følger de samme trinnene i alle vev (figur 1). For det første, glukosegår inn i celler ved glukosetransportører (gluts), og raskt omdannes fra glukose-6-fosfat (G6P) til glukose-1-fosfat (G1P) av phosphoglucomutase. G1P blir deretter omformet til UDP-glukose, og karbon C1 av UDP-glukose er festet til en tyrosin-rest av glycogenin, forankrings protein av glykogen. Dette molekylet, muligens en glykogen-primer, er utvidet ved feste av UDP-glukose til terminalen glukose ved en α (1 → 4) bindingen gjennom glykogensyntase. Til slutt, når en lineær kjede med mer enn 11 glukoserester er dannet, overfører den forgrenede enzymet terminal oligosakkarid som utgjøres av minst 6 glukoserester til et annet glukose av kjeden i nærheten gjennom en α (1 → 6) binding. Gjentagelse av denne prosessen gir en massiv fraktal struktur som inneholder grener som danner en helix med 6,5 glukose per omdreining. Glykogen kan være reversely hydrolysert til glukose ved samordnet aksjonav debranching enzymer som hydrolyserer den α (1 → 6) bundet og glykogen-fosforylase som hydrolyserer den α (1 → 4) glykosidisk bundet mellom den siste rest av glukose i en gren og glykogen molekylet. Denne reaksjon kalles glykogenolyse aktiveres ved å øke nivået av AMP (reflekterer ATP-forbruk), og hemmet av glukose og ATP 2,3.
Ved elektronmikroskopi, har glykogen-molekyler blitt beskrevet i mange celletyper som β frie partikler (eller glykogen monoparticles) på 15-30 nm i diameter. I spesifikke celletyper som for eksempel leverceller, kan β partikler settes sammen til et komplekst til å danne rosetter, også kjent som α partikler som varierer i diameter fra 80 nm til et maksimum på 200 nm 4 5, hydrogenbinding, eller til og med gjennom protein-protein interaksjoner 6. Mengden av glykogen som er lagret i cellene avhenger av mange parametre: (I) mengden glycogenin i cellen som initierer glykogensyntese, (II) aktiviteten av glykogen-syntase og fosforylase regulert av protein phosphorylation / dephosphorylation, (III) konsentrasjonen av glukose i cellene, noe som er avhengig av flere parametre slik som tilførsel av glukose fra det vaskulære system og glukoseopptak i celler. Glykogenlagrene er strengt regulert av allosterisk regulering av biosyntetiske hormoner gjennom mellomliggende metabolitter, av hormoner som regulerer energiomsetningen, og ved næringsfølesignalveier 7.
Det er viktig å være istand til å kvantifisere glykogen i biologiske prøver for å bedre forstå betydningen av glykogen metabolisme på hele kroppen og cellenivå. Vi beskriver her en presis, reproduserbar og praktisk biokjemiske in vitro assay for glykogen. Denne teknikken er basert på kvantifisering glukose fluorescens før og etter spesifikk hydrolyse av glykogen.
Andre metoder foreligger for å anslå graden av glykogen i cellene, men de fleste av dem er ikke kvantitativ. En av de første teknikkene som er beskrevet for kvantifisering av glykogen i cellene var basert på måling av [14C]-glukose til glykogen inkorporering 8,9. Bruken av radioaktiviteten som gjør denne prosessen vanskeligere å håndtere, men den har fordelen av å gi en hastighet på glukose innlemmelse i glykogen og skille mellom fordelingen av glukoserester på de ytre grener og i kjernen av molekylet (det også kreves en ekstra β-amylolysis og en kromatografisk trinn). En annen teknikk som ble utviklet senere, og er basert på inkorporering av 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oksa-1 ,3-diazol-4-yl] amino}-2-deoxyglucose), et 2-deoxyglucose fluorescerende derivat, til glykogen 10. Den målte fluorescensintensiteten reflekterer mengden av glykogen som produseres og kan måles med et fluorescens-leser. Fordeling av fluorescens i cellen kan også bli evaluert ved konfokal mikroskopi.
Blant de andre nonquantitative teknikker, er periodsyre-Schiff-farging (PAS) kanskje den vanligste. Den kan brukes for påvisning av glykogen i faste celler, vev-seksjoner i parafin eller frosset. Dette histologiske teknikk farger ikke spesielt polysakkarider, glykolipider, glykoproteiner, cellulose og nøytrale mucins i lilla. Spesifisiteten til denne testen kan økes ved behandling av faste celler eller vev-seksjoner med diastase, som spesifikt digests glykogen. Deretter,nivået av glykogen kan kvalitativt estimert ved å sammenligne unhydrolyzed prøver (alle karbohydrat-modifisert makromolekyler) til hydrolyserte prøver (karbohydrat modifisert makromolekyler med unntak av glykogen). PAS-farging og mikroskopisk analyse, i motsetning biokjemiske analyser av glykogen, inneholder informasjon angående fordelingen av glykogen i cellen, noe som kan bli spredt eller konsentreres i en bestemt del av cellen. Men selv om PAS fargingsestimater forskjeller i glykogen akkumulering mellom forskjellige forhold, er det ikke kvantitativ 11..
Monoklonalt mus antistoff opprinnelig laget ved hjelp av kjeve condylar brusk som antigenet er vist å reagere med glykogen i celler og med renset glykogen in vitro 12.. Ettersom dette antistoff spesifikt gjenkjenner glykogen-relaterte sukkerkjeder, er det et nyttig verktøy for påvisning av glykogen ved immunhistokjemi i en mer spesifikk måte enn PAS farging. Elektronmikroskopi er en annen teknikk som tillater visualisering av korn av glykogen i celler og evaluering av graden av glykogenlagring. Faktisk, glykogen β partikler er lett gjenkjennelig med en elektronmikroskopi som elektron tette granuler en.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biokjemisk Titrering av Glykogen
En. Cellelysis
- Seed cellene ved en konsentrasjon på 0,5-2 x 10 6 per 100 mm diameter fatet.
- Behandling: ruge celler 24, 48, eller 72 timer i lav oksygenkonsentrasjon (hypoksi) i en Bug-Box anaerob arbeid stasjon (Ruskinn Technology Biotrace International Plc, Bridgend, UK) satt til 1% eller 0,1% O 2, 94% eller 94,9% N 2, og 5% CO 2. Parallelt inkuberes cellene i normoksiske (21% O-2, 5% CO2). Skift medium (25 mM glukose-inneholdende medium) hver 24. time for å minimere variasjoner i glukosekonsentrasjon i løpet av tiden i eksperimentet.
- Etter behandling, vask cellene 2x med PBS for å fjerne spor av glukose fra kulturmediet. Skrap cellene i kaldt PBS.
- Sentrifuger oppløsningen ved 1000 rpm i 5 minutter, kaste supernatanten og pelleten vaskes en gang med PBS. Pelleten kan fryses ved -20 ° C, før man går videre.
- Resuspender pelleten i 100 pl destillert vann. Legg 100 mL av Glykogen Hydrolyse Buffer følger med Glykogen Assay Kit (Abcam). Kok lysatet ved 95 ° C i 5 min for å inaktivere enzymene.
- Vortex og sentrifuger lysatet ved 13 000 rpm i 10 minutter for å fjerne uoppløselige produkter. Hold supernatanten.
- For å normalisere glykogen til proteininnhold mellom prøvene, kan kvantifisering av proteiner gjøres med 25-35 pl av supernatanten ved hjelp av Bicinchoninic Acid analyse (BCA-Interchim).
En del av lysatet kan brukes til å måle den frie glukosekonsentrasjonen inne i cellene.
2. Hydrolyse av Glykogen
- Bland 50 ul av supernatanten (trinn 1) med 1 pl av den Hydrolyse Enzym Mix. Denne blandingen inneholder glucoamylase. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Klargjør kalibreringskurve ved å fortynne standard glykogen (2 mg / ml) supplied med settet til en oppløsning av 10 ug / ml i hydrolysebuffer. Deretter klar seks separate rør med 0, 4, 8, 12, 16, og 20 ul av 10 ug / ml-standarden og justere hvert rør til et sluttvolum på 50 pl med hydrolysebuffer for å gi en konsentrasjon av glykogen fra 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16, og 0,2 pg / ml. Legg 1 mL av Hydrolyse Enzym Mix i standardene og inkuberes i 30 min ved romtemperatur.
Bakgrunnen glukose konsentrasjon av cellelinjen, gitt ved verdien for den frie glukosekonsentrasjon, må trekkes fra verdien for den totale glukosekonsentrasjon (glukose fra glykogenhydrolyse + fri-glukose) for å bestemme nivået av glykogen i cellen.
Tre. Utvikling og Lesing av fluorescens
- For hver tilstand, forberede et rør (rør 1) for å måle fri glukosekonsentrasjon og to rør (rør 2 og 3) for å måle totalglukosekonsentrasjon (hvert rør witha forskjellig volum av hydrolysert glykogen).
- Tilsett 15 pl av supernatanten utvunnet ved slutten av trinn 1 i røret 1.. Legg 35 pl av buffer for å fullføre hydrolysen til et sluttvolum på 50 pl. Erholdt fluorescens vil gi den frie glukosekonsentrasjonen.
- Legg X mL av hydrolysert glykogen (oppnådd i trinn 2) i rør 2. Juster til et sluttvolum på 50 pl. Prøvevolum (X il) har til å bli justert i henhold til celletetthet og / eller celletype for å oppnå fluorescens-verdier som ikke er mer enn konsentrasjonene av kalibreringskurven.
- Legg 2 X mL av hydrolysert glykogen i røret tre. Juster til et sluttvolum på 50 pl.
- Forbered en utbyggingsløsning for prøver og standarder ved å blande for hvert rør 48,7 mL av Development Buffer, 1 mL of Development Enzyme Mix og 0,3 mL av OxiRed Probe (leveres i Glykogen Assay Kit). For eksempel, for to forhold, utarbeide en blanding for 12 rørs (6 for standarder, to gratis glukose og 4 for total glukose fluorescens).
- Tilsett 50 pl av denne blanding til hvert rør og inkuberes i 30 min ved romtemperatur i mørke.
- Måle fluorescensen ved en eksitasjonsbølgelengde på 535 nm, en emisjonsbølgelengde på 587 nm, som anbefalt, og en slisse på 3 nm for eksitasjon og emisjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et lavt nivå av oksygen (hypoksi) i tumorer signaler til tumorceller behovet for å lagre energi for å håndtere påfølgende næringsutarming, slik som å overleve. Som glykogen er hoved energisk polymer av glukose i pattedyrceller, studerte vi regulering av glykogenlagring i hypoksi. Beregningen og standardiseringen av konsentrasjonen av glykogen i cellelysater må utføres på rådata av fluorescens som vist i tabellene 1, 2 og 3.. Den biokjemiske assay for glykogen bekreftet at elektron-tette aggregater observert på elektronmikrografer av CCL39-celler (figur 2A) ble glykogen partikler (figur 2B). Oppbyggingen av glykogen i hypoksi er avhengig transkripsjonsfaktor Hypoksi-Inducible faktor-1 (HIF-1) (figur 3), som utgjør hovedtranskripsjonsfaktor involvert i cellulær tilpasning til hypoksi. Til slutt, vi demonstrere i forskjellige kreft ognoncancer cellelinjer som er lagret glykogen kan bli raskt metabolisert av cellen på mindre enn 6 timer (fig. 4A), og at bruken av glykogen beskytter mot celledød under betingelser med glukose sult (figur 4B) 1.
Tabell 1.
| Glu. (Mikrogram) | 0 | 0,04 | 0,08 | 0,12 | 0,16 | 0,2 | |
| Rådata fluorescens (RDF) | fluo. | 60 | 88.8 | 106,7 | 121.8 | 148 | 172.1 |
| RDF - Bakgrunn (fluorescens for 0 mikrogram i standardkurve) | korreksjon | 0 | <strong> 28.8 | 46,7 | 61.8 | 88 | 112,1 |
 | |||||||
| Rådata Fluo. (RDF) | RDF - Bakgrunn | (Korreksjon * 1000) / skråning standardkurve | Volum av prøven brukes for å titrere glykogen | Rådata protein-konsentrasjonen | γ * volum prøve | Glukose (ng) / protein totalt | |
| Total glukosekonsentrasjon 1 | fluo. | korreksjon | glukose (ng) | volum prøve | | protein total | glukose (ng / mg Pr.) | |
| Eksempel 1 (CCL39-NX 1) | 65.8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0,07 | 1.4 | 7.5 |
| Eksempel 2 (CCL39-NX 2) | 64.1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0,11 | 2.2 | 3.4 |
| Eksempel 3 (CCL 39 HX 48 hr 1) | 177,3 | 117.3 | 211.5 | 4 | 0,22 | 0,88 | 240,3 |
Tabell 1.5.
| Eksempel 4 (CCL 39 HX 48h 2) | 174.2 | 114,2 | 205,9 | 4 | 0,24 | 0,96 | 214,5 |
| Eksempel 5 (CCL 39 HX 72 timer 1) | 164.7 | 104.7 | 188,8 | 2 | 0,22 | 0,44 | 429,1 |
| Eksempel 6 (CCL 39 HX 72 timer 2) | 174,7 | 114,7 | 206,8 | 2 | 0,24 | 0,48 | 430,9 |
| Rådata Fluo. (RDF) | RDF - Bakgrunn | (Korreksjon * 1000) / skråning standardkurve | Volum av prøven brukes for å titrere glykogen | Rådata protein-konsentrasjonen | γ * volum prøve | Glukose (ng) / proteintotal | |
| Total glukosekonsentrasjon 2 | fluo. | korreksjon | glukose (ng) | volum prøve | γ (mikrogram / mL) | protein total | glukose (ng / mg Pr.) |
| Eksempel 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0,07 | 0,7 | 7.7 |
| Eksempel 2 (CCL39-NX 2) | 61.2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0,11 | 1.1 | 2,0 |
| Eksempel 3 (CCL 39 HX 48 hr 1) | 121.6 | 61.6 | 111,1 | 2 | 0,22 | 0,44 | 252,4 |
| Eksempel 4 (CCL 39 HX 48 hr 2) | 111,9 | 51.9 | 93.6 | 2 | 0,24 | 0,48 | 195,0 |
| Eksempel 5 (CCL 39 HX 72 timer 1) | 110,3 | 50.3 | 90.7 | 1 | 0,22 | 0,22 | 412,3 |
| Eksempel 6 (CCL 39 HX 72 timer 2) | 117.8 | 57.8 | 104,2 | 1 | 0,24 | 0,24 | 434,3 |
Tabell 2.
| fri glukose | fluo. | korreksjon | glukose (ng) | volum prøve | γ (mikrogram / mL) | protein total | glukose (ng / mg Pr.) | negative verdier betraktes som 0 |
| Eksempel 1 (CCL39-NX 1) | 60.2 | 0,2 | 0,4 | 15 | 0,07 | 1,05 | 0,3 | 0,3 |
| Eksempel 2 (CCL39-NX 2) | 55,3 | -4,7 | -8,5 | 15 | 0,11 | 1,65 | -5,1 | 0 |
| Eksempel 3 (CCL 39 HX 48 hr 1) | 56.5 | -3,5 | -6,3 | 15 | 0,22 | 3.3 | -1,9 | 0 |
| Eksempel 4 (CCL 39 HX 48 hr 2) | 56.7 | -3,3 | -6,0 | 15 | 0,24 | 3.6 | -1,7 | 0 |
| Eksempel 5 (CCL 39 HX 72 timer 1) | 57.5 | -2,5 | -4,5 | 15 | 0,22 | 3.3 | -1,4 | 0 |
| Eksempel 6 (CCL 39 HX 72 timer 2) | 56.9 | -3,1 | -5,6 | 15 | 0,24 | 3.6 | -1,6 | 0 |
Tabell 3.
| Total glukose-konsentrasjonen 1 | Total glukose-konsentrasjonen 2 | Total glukose konsen-tration gjennomsnitt | Gratis glukose-konsentrasjonen | Glykogen (ng / mg Pr.) (Total gjennomsnittlig glukose - fri glukose) | Gjennomsnittlig glykogen (mellom DUPLI-cates) | Standard feil | |
| Eksempel 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0,3 | 7.3 | 5,0 | 3.3 |
| Eksempel 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2,0 | 2.7 | 0,0 | 2.7 | ||
| Eksempel 3 (CCL 39 HX 48 hr 1) | 240,3 | 252,4 | 246,4 | 0,0 | 246,4 | 225,6 | 29.5 |
| Sample 4 (CCL 39 HX 48 hr 2) | 214,5 | 195,0 | 204,7 | 0,0 | 204,7 | ||
| Eksempel 5 (CCL 39 HX 72 timer 1) | 429,1 | 412,3 | 420,7 | 0,0 | 420,7 | 426,6 | 8.4 |
| Eksempel 6 (CCL 39 HX 72 timer 2) | 430,9 | 434,3 | 432,6 | 0,0 | 432,6 |
Tabellene 1, 2, 3. Representant beregning og normalisering av glykogeninnhold av CCL39 celler fra fluorescens rad datasett. Glykogen ble titrert i CCL39 etter inkubasjon i normoksiske (NX) eller i hypoksi 1% O 2 (Hx) i 48 timer eller 72 timer. Glykogen målinger er gjort i to eksemplarer for hver tilstand. Øverste delen av
Figur 1. Glykogen metabolisme:. Oversikt over syntese og nedbrytning av glykogen Glukose kommer inn i cellen gjennom cytoplasma glukosetransportører (gluts) for omforming til glukose-6-fosfat ved hexokinases 1 og 2 (HK). Glukose-6-fosfat (G6P) er i krysset mellom glykolyse, den pentosefosfateveien og glykogenesen. Phosphoglucomutase (PGM) er denførste enzym i glykogenesen som katalyserer omdannelsen av G6P til glukose-1-fosfat (G1P), som deretter omdannes til UDP-glukose av glukose-1-fosfat urydylyltransferase (UGP). UDP-glukose blir brukt av glykogen-syntase (GS) for å forlenge en anker molekylet utgjøres av glycogenin og en glukoserester festet med en forgrening enzym (BE). Glykogensyntase og forgreninger enzymer samarbeide i dannelsen av glykogen, også kalt glykogenesen. Den omvendte prosessen som hydrolyzes glykogen til G1P via glykogenfosforylase (GP) og debranching enzymer (DBE) kalles glykogenolyse. Tilpasset fra tre.
Figur 2. Opphopning av glykogen i hypoksi i ikke kreft celler og kreftceller. (A) Electron micrografts av CCL39 i normoksiske (NX) (venstre panel) og hypoksi 1% O 2 (Hx 1%60, 96 hr) (høyre panel). Piler betegne aggregater av glykogen partikler. (B) Kvantitering av mengden av glykogen i CCL39 (svarte søyler) og LS174 (hvite stolper) celler dyrket i normoksiske (Nx) eller hypoksi 1% O 2 (Hx 1%) etter 48, 72 og 96 timer i en 25 mM glukose-inneholdende medium.
Figur 3. Akkumulering av glykogen i hypoksi er avhengig av HIF-1. Kvantifisering av glykogen beløpet i LS174 pTerHIF-1α. Disse cellene er induserbare kloner uttrykker en shRNA mot HIF-1α i tilstand av tetracyklin. Cellene vokste i normoksiske (NX) (hvite stolper) eller hypoksi 0,1% O 2 (Hx 0,1% - sorte stolper) i fravær (-) eller nærvær (+) av tetracyklin (Tet).
Figur 4. Glykogen storage beskytter mot celledød. (A), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF-7 (●), og MDA-MB231 (x)-celler ble utsatt for 1% O 2 hypoksi i 96 timer, og deretter dyrket i glukose-free medium for seks hr. Den glykogen-konsentrasjon ble målt like før fjerning av glukose og utgjør 100%. Glykogen ble så målt ved 1, 3 og 6 timer. Resultatene er representative for minst tre separate forsøk. (B) Måling av celledød i CCL39-celler. Celler ble utsatt for enten normoksiske (- lagring) eller hypoksi (+ lagring) i 96 timer, og inkubert i glukosefritt medium i hypoksi i 24 timer før måling av celledød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biokjemisk titrering av glykogen in vitro gir en nøyaktig kvantifisering av celler glykogeninnhold. Sammenlignet med noen andre teknikker (PAS, immunfluorescens med en glykogen antistoff, etc.), Er dette titrering veldig spesifikk, sensitiv og reproduserbar. Dessuten er fremgangsmåten fordelaktig siden det krever ingen radioaktivitet, men en fluorescens-spektrometer. Imidlertid er denne teknikk rent kvantitativ, og ikke gi informasjon om fordeling glykogen i cellen.
Den teknikk som beskrives i dette manuskriptet er oppnådd på celleekstrakter, men det kan også oppnås på vevssnitt med en hensiktsmessig metode for ekstraksjon av glykogen fra vev. Denne analysen anvendes for in vitro-anvendelser, og på grunn av en indirekte måling av glykogen (etter hydrolyse til glukose), kan det ikke bli utviklet til å følge glykogenlagre in vivo.
PAS farging er allerede videnbrukes til å diagnostisere mange glykogen lagring sykdommer (von Gierke sykdom, Cori sykdom, McArdle sykdom, etc.). Det er også brukt til å detektere soppinfeksjoner, eller for å skille mellom forskjellige undertyper av tumorer. I teorien kunne PAS beising være koplet til en bilde analysator for å bestemme glykogen konsentrasjon. I praksis er denne teknikk er vanskelig å utføre og er mindre hensiktsmessig enn den fremgangsmåte som beskrives her for de følgende årsaker. For det første, som PAS positiv farging (fiolett) overlapper med negativ farging (Hematoxylin-blått), er det teknisk vanskelig å utelukke det negative signal uten å fjerne det positive signal. I tillegg er PAS farging ikke reproduserbar nok til å kvantifisere glykogen, fordi intensiteten av fargen kan være avhengig av tidspunktet for fiksering, effekt av farge, vasking, osv.. Endelig gir denne biokjemiske metode en gjennomsnittlig konsentrasjon på glykogen for et stort antall celler, samtidig som PAS farging fokuserer på et bestemt felt, og derfor er mindre representativ for den totale glykogen konsentrasjon.
Den biokjemiske analyse av glykogen kunne gi meget nøyaktige og informative data vedrørende nivået av glykogen i vevet. Disse dataene kan for eksempel være hypotetisk korrelert med sykdomsprogresjon, eller kan bidra til å forstå effekten av behandlingen på glykogen metabolisme. På den annen side krever denne teknikken flere trinn (protein kvantiteringsstandarder, hydrolyse av glykogen og en minimum av tre fluorescens målinger per prøve), og virker mindre praktisk enn PAS flekker. For en bedre forståelse av det fysiologiske eller patofysiologiske metabolisme (cancer, etc.), Er det viktig å nøyaktig kvantifisere glukose (og ATP) som leveres av glykogen. Imidlertid er glykogen kvantifisering alene ikke tilstrekkelig til å forstå glykogen metabolisme, og må sammen med mikroskop for å bestemme fordelingen av glykogen i celler.
nt "> Det er viktig å peke på at til tross for den nøyaktighet og reproduserbarhet av denne analyse, kan en liten variasjon i proteininnhold fører til store variasjoner i normaliserte verdier av glykogen. Dessuten, selv om det er en lineær økning i fluorescens med glykogen konsentrasjon, er linearitet ikke vedlikeholdt høy konsentrasjon som signalet synker dramatisk. Derfor anbefaler vi ikke å ta hensyn til fluorescens verdier utover konsentrasjoner av kalibreringskurve. Vi anbefaler derfor å utføre to målinger med to forskjellige prøvevolumer. I på denne måten fluorescens gjenspeiler den glykogen i cellene og er ikke oppveies av en reduksjon i fluorescens.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Dr. Thierry Pourcher for å tillate oss å bruke fluorescens spektrometer og for hans hjelp. Laboratoriet er finansiert av Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), Foreningen pour la Recherche contre le Cancer, Institut National du Cancer (INCA), Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU program FP7), Senter A. Lacassagne, den Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE og Universitetet i Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Vi takker Dr. M Christiane Brahimi-Horn for kritisk lesing og redaksjonell korreksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. "Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. Theory and practice of histotechnology. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
